靈芝多糖的提取方法及藥理活性研究進展

于海洋 王延鋒* 萬 里 史 磊 王金賀 盛春鴿 劉姿彤 張 鵬

（1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157041；2. 牡丹江康安醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157041）

靈芝（Ganoderma lucidum）又稱靈芝草、長生草、仙草等，在我國已經(jīng)有2 000多年的藥用歷史，東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》、東晉《抱樸子·仙藥》、明朝《本草綱目》和《中華人民共和國藥典》（2000版）中均有收錄記載。靈芝具有扶正固本、強身益氣、安心寧神等藥用功效[1]。靈芝多糖（G. lucidumpolysaccharides，GLP）是一類活性較強、功能較全的天然糖類高分子化合物，由多個單糖分子縮合而成。構(gòu)成靈芝多糖的單糖及其衍生物多達十幾種，主要有葡萄糖、肽多糖、D-木糖、D-甘露糖等，其形成的糖苷鍵復(fù)雜，且合成不遵循遺傳中心法則[2]。提取自靈芝的多糖組分通常分為α型和β型。研究表明，靈芝多糖具有降血糖，抑制腫瘤，抗氧化，免疫調(diào)節(jié)，降血脂等功能，發(fā)揮功能的通常是具有β構(gòu)型的有效多糖。目前，靈芝多糖在醫(yī)療、保健、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[3-4]。

1 靈芝多糖的提取分離

1.1 多糖的提取方法

靈芝多糖存在于靈芝的子實體、菌絲體、液體發(fā)酵培養(yǎng)液和孢子粉中。傳統(tǒng)提取方法有熱水提取法[5]、酶法提取[6]、超臨界流體輔助提取[7]、超濾法[8]、微波輔助提取法[9]、超聲波提取法[10]和超聲-微波協(xié)同萃取法等[11]。

靈芝子實體中的多糖通常采用熱水浸提法提取，操作相對簡單：將子實體粉碎后，利用多糖溶于熱水而不溶于醇、醚、丙酮等有機溶劑的特點，直接浸提。但多糖得率不高，且多數(shù)為胞外多糖。此外，超聲波提取法應(yīng)用也較多，其機理是利用超聲波輻射產(chǎn)生空化作用、熱學(xué)作用達到物理破碎，多糖隨著細胞壁的破碎而釋放出來，提取時間比傳統(tǒng)的熱水浸提法縮短3/4，多糖得率也有所提高[12]。酶法提取多糖主要利用纖維素酶降解細胞壁上的纖維素、蛋白質(zhì)等，使多糖容易被提取，條件相對溫和，工藝較簡單，易操作。而采用多種提取方法聯(lián)合提取，可有效增加靈芝多糖的提取率和得率。

靈芝菌絲體中的多糖通常提取自無菌條件下液體發(fā)酵所得的靈芝菌絲體，相對于子實體提取，菌絲體提取多糖周期短，效益高，不受季節(jié)條件限制，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。無論采用傳統(tǒng)的熱水浸提法還是超聲波提取技術(shù)等，多糖提取率和得率菌絲體都高于子實體，這是由于液體培養(yǎng)的菌絲體細胞壁疏松、脆弱，相對于木質(zhì)化的子實體，多糖更容易提取出來[13]。液體發(fā)酵菌絲體提取多糖相對穩(wěn)定，不受外界因素影響，因此是多糖提取的一個重要趨勢。此外，液體發(fā)酵所得的發(fā)酵液中也含有部分多糖，但由于培養(yǎng)基中的碳源也提供了部分多糖，所以成分相對復(fù)雜，增加了提取的難度。

1.2 多糖的純化

靈芝多糖的粗提物中通?；祀s一些蛋白質(zhì)、色素、低聚糖等雜質(zhì)成分，因此需要進一步的分離純化。分離純化一般分為除蛋白質(zhì)、脫色素、脫鹽、去小分子雜質(zhì)等初級純化，以及離子交換色譜、凝膠過濾、凝膠電泳法等精細純化，目的是將粗多糖純化為基本無蛋白質(zhì)及其他小分子雜質(zhì)的多糖。

多糖的初級純化中，相對溫和的Sevag法較常用于去除蛋白質(zhì)，將氯仿、正丁醇、多糖溶液按比例混合反復(fù)萃取直至蛋白質(zhì)去除，對多糖本身的影響較小[14]。三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等脫蛋白方式相對劇烈，會損失部分多糖，且三氟三氯乙烷易揮發(fā)、有毒性，三氯乙酸為中強酸，對后續(xù)多糖的分離純化有一定的影響[15]。木瓜蛋白酶法可以在較低的溫度下將蛋白質(zhì)分解成氨基酸或多肽等小分子物質(zhì)使其沉淀，但后續(xù)仍需要進行脫色處理。

靈芝多糖一般含酚類化合物，導(dǎo)致顏色較深，可采用氧化法、吸附法、離子交換法、金屬絡(luò)合物法等進行脫色處理。氧化法和吸附法常溫下可進行，但由于活性炭的吸附能力較強，會導(dǎo)致多糖得率下降，過氧化氫只是將色素氧化，目前利用弱堿性的DEAE纖維素進行脫色處理較為常見[16]。多糖中的鹽或其他小分子物質(zhì)主要通過不同分子量的透析袋（膜）去除，通常采用SephadexG-25離子交換柱法，此法相對操作簡單，對多糖的結(jié)構(gòu)、功能影響較小。Jiang等[17]利用A103S陰離子交換樹脂填充洗脫，色素、雜質(zhì)等去除率達到80%以上，且快速、高效，多糖損失率低。

多糖含量的測定，主要利用多糖與試劑呈顏色反應(yīng)，測定的吸收度與含量呈線性關(guān)系的原理。蒽酮-硫酸法利用糖與濃硫酸反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，測定多糖含量較為常用；苯酚-硫酸法測定多糖含量靈敏度高，穩(wěn)定且不需要水解，可用于測定固體多糖的含量[18]。此外，還可采用3,5-二硝基水楊酸法等對多糖進行測定。

2 靈芝多糖的藥理活性

2.1 抗氧化作用

機體在代謝過程中產(chǎn)生的大量自由基，會加速機體的老化。研究表明，靈芝菌絲體水溶性多糖、發(fā)酵液多糖、菌絲體堿提多糖都可以不同程度地防止脂質(zhì)過氧化，降低羥基自由基、ABTS自由基、DPPH自由基的產(chǎn)生，減少紅細胞溶血，清除巨噬細胞中叔丁基過氧化物產(chǎn)生的自由基，提升H2O2的代謝能力，多糖與靈芝其他活性物質(zhì)協(xié)同作用，其抗氧化能力不亞于抗氧化劑BHA（butylated hydroxyanisole）[19-20]。靈芝多糖能夠促進體內(nèi)白介素的合成，加快細胞的增殖分裂，可以調(diào)節(jié)Enos活性和NO的產(chǎn)生，對血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）干預(yù)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的衰老有抑制作用[21]，能夠降低血清和心肌勻漿的丙二醛的水平，降低超氧化物歧化酶含量，間接清除氧自由基或提高GSHpx水平[22]。靈芝多糖還能阻止四氧嘧啶誘導(dǎo)的胰島損傷[23]。

2.2 抗病毒作用

靈芝胞內(nèi)多糖對流感病毒有一定的抑制作用[24]。靈芝蛋白多糖通過抑制過濾性病原體的復(fù)制，干擾病毒早期進入目標細胞后的吸附，而達到抗病毒效用[25]。蝦的體液中含有氧化酶原激活系統(tǒng)等免疫因子，但不具有免疫球蛋白，靈芝多糖可以激活蝦類的非特異性免疫系統(tǒng)，從而達到預(yù)防細菌和抗病毒的作用[26]。

2.3 抗腫瘤作用

靈芝多糖通過對腫瘤細胞產(chǎn)生毒副作用，誘導(dǎo)細胞凋亡從而直接抑制腫瘤細胞生長；并通過增強機體免疫力影響T細胞、B細胞和補體系統(tǒng)等，達到間接對抗腫瘤的效果[27]。靈芝多糖間接提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，從而提高對腫瘤細胞的殺傷活性[28]，如靈芝多糖可提高小鼠免疫功能，有效抑制H22肝腹水瘤細胞的增殖[29]。

林志彬[30]認為靈芝多糖能夠促進樹突細胞的成熟分化，起到促進淋巴細胞活化抑制腫瘤細胞生長的作用。Wasser[31]認為靈芝多糖的抗腫瘤活性在以β（1→3）為糖苷鍵主鏈、β（1→6）為糖苷鍵支鏈時，相對于只有以β（1→6）為糖苷鍵為主鏈時，所發(fā)揮的作用更加明顯?？梢?，靈芝多糖的抗腫瘤活性與其化學(xué)組成及物理性狀存在相關(guān)性[32]。靈芝多糖還具有阻止腫瘤增大及防止癌細胞擴散的功能，甚至能將癌癥細胞反轉(zhuǎn)成正常細胞[33]，對于癌癥治療研究有重大意義。

2.4 降血糖作用

據(jù)統(tǒng)計，糖尿病病例正以每年6%的速度上漲，而高血糖是造成糖尿病的主要原因之一。靈芝多糖能夠通過刺激胰島分泌胰島素，對四氧嘧啶及去甲腎上腺素所導(dǎo)致的血糖升高的小鼠具有明顯降血糖效果，而對血糖正常的小鼠卻沒有繼續(xù)降低的作用?？梢姡`芝多糖對血糖具有雙向調(diào)節(jié)的作用[34-35]。

實驗證明，從赤芝子實體中提取的多糖能夠促使外周組織充分利用游離的葡萄糖，降低高血糖的發(fā)病率；靈芝多糖能夠抑制肝臟PEPCK的表達，Ⅱ型糖尿病患者每天服用一定量的靈芝多糖，能夠降低空腹血糖水平[36]。

2.5 免疫調(diào)節(jié)作用

大多數(shù)靈芝多糖在機體內(nèi)都能夠起到免疫調(diào)節(jié)的作用。Li等[37]用提取自靈芝液體培養(yǎng)液的一種富含半乳糖胞外多糖（GLP-2），對體重為20±2 g的三個月大昆明雄性小鼠進行注射，當注射劑量為75 mg/kg時，便可提高T淋巴細胞和B淋巴細胞的存活率，并產(chǎn)生抗體；當注射劑量達到150和300 mg/kg時，對T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖，抗體的形成，脾臟組織數(shù)量及免疫功能都有顯著的促進作用。靈芝水溶性復(fù)合多糖對人體免疫細胞NK-92MI具有刺激分泌IL-2和I-309免疫因子的作用，能夠增加人體脾單核細胞表面的Dectin-1表達，從而提高免疫力[38]。

靈芝多糖對黏膜免疫具有一定的促進作用，能夠刺激腸道黏膜和上皮淋巴細胞增殖，同時能激活TNF-α和IL-10mRNA的表達，通過增殖淋巴細胞激活全身的免疫系統(tǒng)，達到提高免疫力的作用[39]。

2.6 其他作用

靈芝多糖可以修復(fù)因CCL4中毒引起的小鼠肝損傷，其原理是多糖中的D6對小鼠血清ALT和肝臟TG含量的升高起拮抗作用，增加小鼠的耐毒性，并減少DL-乙硫氨酸引起的肝臟脂肪堆積，提高肝臟代謝戊巴比妥鈉的能力，促進肝臟再生[40]。

靈芝多糖還具有明顯的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用，小鼠長期給服一定劑量的靈芝多糖，能夠延長巴比妥類藥物的中樞抑制作用時間，使小鼠耐受電擊的能力增強；靈芝多糖能夠通過增強心肌氧和能量的供給，增強心肌收縮力，改善心肌缺氧狀態(tài)，緩解因心肌缺血所導(dǎo)致的身體不良癥狀；長期服用靈芝水能止咳化痰，并對呼吸道疾病有顯著療效[41]。雖然靈芝多糖的結(jié)構(gòu)和分子構(gòu)象尚不十分明確，但靈芝多糖還被證實具有抗炎、抗微生物、抗凝血、促進紅細胞免疫、促進吞噬細胞增殖等功能[42-43]。

3 小 結(jié)

近年來，隨著養(yǎng)生保健觀念的日益深入人心，國內(nèi)對靈芝功能性成分的探索和利用已成為現(xiàn)代醫(yī)療保健研究的主要方向之一。靈芝多糖作為重要的生物活性物質(zhì)，除了具有降血糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等生理功能之外，還具有調(diào)節(jié)肝臟功能及改善睡眠等功效。隨著人工栽培靈芝技術(shù)的完善和普及，靈芝價格逐漸降低，靈芝多糖將不僅僅應(yīng)用于藥品、保健食品、化妝品等領(lǐng)域，也將在臨床醫(yī)療、畜禽免疫、新型免疫增強劑、預(yù)防病原體的感染等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。目前，對于靈芝多糖的研究大多停留在提取和功能鑒定的層面，相信在不久的將來，隨著研究的不斷深入，對其的開發(fā)利用必將上升到新的高度。