腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤人源異種移植模型的應(yīng)用研究進(jìn)展

左爭輝，馬春曉

(河南大學(xué)人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，河南 鄭州 450003)

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的50%左右。世界衛(wèi)生組織根據(jù)組織病理學(xué)特點(diǎn)將膠質(zhì)瘤分為4級(jí)，其中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)的惡性程度最高和侵襲性最強(qiáng)，現(xiàn)階段被認(rèn)為是一種涉及細(xì)胞代謝功能失調(diào)的疾病，其生存期短，中位生存期為14.6個(gè)月[1]，目前最佳的治療方案是在安全范圍內(nèi)最大程度的手術(shù)切除腫瘤聯(lián)合術(shù)后的放化療，這只能在一定程度上減緩復(fù)發(fā)，延長生存期，GBM死亡率并沒有顯著下降，僅約17%的GBM患者生存期超過2 a[2]。由于腫瘤錯(cuò)綜復(fù)雜的生物學(xué)特性，現(xiàn)階段對(duì)腫瘤認(rèn)識(shí)不夠透徹，以及臨床前模型的局限性，從而導(dǎo)致了新型治療藥物在臨床研究中的成功率較低。為更有效的治療膠質(zhì)瘤，需要尋找新的治療手段。隨著人源異種移植模型(patient derived xenograft，PDX)在其他腫瘤研究中取得的進(jìn)展，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤PDX模型可能為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)個(gè)體化治療及聯(lián)合治療提供了新方案和新策略。

1 PDX模型的建立及優(yōu)勢

1.1 免疫缺陷小鼠的概念免疫缺陷小鼠是指一種或者多種免疫系統(tǒng)組成成分缺陷的小鼠。歷史上，第一只免疫功能低下的小鼠是由Grist于1962年發(fā)現(xiàn)的，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)時(shí)身體無皮毛，所以被稱為“裸鼠”，因“裸鼠”缺乏免疫器官，所以又被稱為免疫缺陷小鼠。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多品種的免疫缺陷小鼠被研發(fā)出來。根據(jù)缺乏的免疫細(xì)胞不同，分為T淋巴細(xì)胞缺陷小鼠(BALB/C小鼠)；T、B淋巴細(xì)胞雙缺陷小鼠(SCID、NOD-SCID小鼠)；T、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞缺陷小鼠(NSG、NOG小鼠)。其中，NSG小鼠免疫缺陷程度最高，無免疫因素方面的影響，移植成功率最高[3]，被選定為最適合建立模型的小鼠。1969年，人類歷史上首次將結(jié)腸癌腫瘤移植到裸鼠體內(nèi)并獲得成功，至此，人類將各種類型的腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，建立了多種PDX腫瘤模型。

1.2 PDX模型建立方式PDX模型是將患者的腫瘤組織直接移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)而建立的人源異種模型。由于人類與動(dòng)物之間種屬的差異，建立異種移植模型有兩種方式[3-4]：一是原位移植腫瘤模型，是指將腫瘤手術(shù)切除后直接移植到模型相應(yīng)的位置，這種移植方式對(duì)改變原始腫瘤所處的免疫環(huán)境影響小，更適合腫瘤的生長，但是，這種移植模型對(duì)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)要求高，成功率低；二是異位移植腫瘤模型，即將腫瘤組織移植到小鼠背部皮膚下或腎包膜下，這種方式對(duì)技術(shù)要求低，操作方便，而且可以縮短腫瘤形成時(shí)間，提高腫瘤形成率。

1.3 PDX模型的優(yōu)勢PDX將剛手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織直接接種至免疫缺陷小鼠體內(nèi)，用小鼠代替患者，依靠小鼠提供的微環(huán)境，模擬腫瘤在患者體內(nèi)生長的過程，因此能更好地保留腫瘤的重要生物特征。與體外細(xì)胞系相比，PDX不僅少了細(xì)胞系傳代過程，而且增加了體內(nèi)環(huán)境的影響。PDX模型保留原始腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境及腫瘤的異質(zhì)性[5]，打破了傳統(tǒng)腫瘤離體模型固有的局限性，更能模擬腫瘤在體內(nèi)的生長過程和腫瘤微環(huán)境，這是迄今為止與原發(fā)腫瘤最為相似的體內(nèi)動(dòng)物模型[6]。因此，PDX模型是目前最切合實(shí)際且最理想的原發(fā)瘤體替代者，并且在新型藥物研發(fā)、臨床前藥物試驗(yàn)、個(gè)體化藥物篩選、腫瘤相關(guān)分子標(biāo)志物的研究及精準(zhǔn)醫(yī)療等方面帶來新的突破，為膠質(zhì)瘤患者確定最佳的治療方案[7-8]。用小鼠替代患者去測試不同藥物的治療效果，從中挑選出最有效的治療方案，可避免無效療法帶來的治療延誤和毒副作用以及經(jīng)濟(jì)上的浪費(fèi)。

1.4 PDX模型在其他腫瘤方面的應(yīng)用目前，PDX模型在治療胰腺癌、胃癌、肝癌及血液病方面的研究已取得非常好的結(jié)果。Hidalgo等[9]研究指出PDX模型在治療難治性晚期癌癥方面作用顯著，他們從14例晚期癌癥患者中切除腫瘤，立即移植到免疫缺陷小鼠中生長，并在232種治療方案中篩選出63種藥物治療，利用異種移植模型篩選出了12例患者的有效治療方案，除1名患者在接受治療前死亡，其余11名接受了17項(xiàng)前瞻性指導(dǎo)治療，其中15種治療方案獲得成功。Elena Garralda團(tuán)隊(duì)將二代測序技術(shù)和PDX模型結(jié)合起來，根據(jù) PDX的測序結(jié)果選擇最有效的個(gè)體化藥物，在基因方面尋找治療方案，結(jié)果顯示25例實(shí)體瘤患者中的14例接受了個(gè)性化治療，11例得到了持久的部分緩解[10]。PDX模型在卵巢癌免疫治療研究中，利用患者匹配的PDX模型，發(fā)現(xiàn)自體腫瘤反應(yīng)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infifiltrating lymphocytes，TIL)給藥可減少腫瘤負(fù)擔(dān)和增加生存率，為評(píng)估患者特異性T細(xì)胞對(duì)免疫治療的反應(yīng)提供了獨(dú)特的平臺(tái)[11]。

2 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤PDX模型應(yīng)用研究

2.1 PDX模型在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的應(yīng)用研究近年來，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療面臨困境，隨著PDX模型在血液病、胃癌及卵巢癌等腫瘤方面獲得的成就，PDX模型在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療方面成為研究的焦點(diǎn)。有研究[12]指出，小鼠腦內(nèi)接種腫瘤組織后腫瘤形成快，成瘤率高，腫瘤對(duì)周圍正常組織有浸潤性生長，并伴有新生血管的形成，其生物學(xué)特性與人腦膠質(zhì)瘤較為接近，適合用來研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制和治療方法，但模型與患者腫瘤的重要分子特征相似程度尚不清楚。最新研發(fā)出的一項(xiàng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤PDX模型[13]，可將腫瘤細(xì)胞注射到玻璃體腔內(nèi)，這種PDX 模型的成功建立為模擬腫瘤的生物學(xué)行為提供了更為簡單有效的方法。Brown等[14]建立了20個(gè)惡性膠質(zhì)瘤PDX模型用于分析蛋白質(zhì)組學(xué)，分析了包括表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在內(nèi)的幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)和活性，結(jié)果顯示EGFR具有高活性的小鼠是一種很好的臨床前模型，可以為EGFR具有高活性腫瘤的部分GBM患者提供治療方法，這在膠質(zhì)瘤的靶向治療方面找到了可用的工具。在很多繼發(fā)性GBM中TP53普遍表達(dá)，而TP53突變和非功能性p53可能表現(xiàn)出特定的輔助治療易患性和不同的術(shù)后結(jié)果，Radaelli等[15]通過建立移植模型研究證實(shí)，這種表達(dá)模式在移植模型中也同樣表達(dá)，因此小鼠模型可作為臨床前研究的有力工具，用于測試TP53突變設(shè)計(jì)的新型輔助治療方案的可行性。Grobben等[16]的研究顯示，小鼠腦內(nèi)的人異種移植腫瘤細(xì)胞和人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞同大多數(shù)腫瘤細(xì)胞相同，一般均圍繞著血管和神經(jīng)纖維生長和遷移，并且血管周圍生長的普遍為神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，其表現(xiàn)為親內(nèi)皮基底膜的性質(zhì)，提示腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、成瘤與內(nèi)皮細(xì)胞有緊密聯(lián)系。Chen等[17]最新研究利用膠質(zhì)瘤PDX模型進(jìn)一步證實(shí)了通過抑制生物鐘相關(guān)蛋白CLOCK和趨化因子OLFML3的功能可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)的干性，研究結(jié)果顯示荷瘤小鼠的生存期明顯的延長。Fadi等[18]最近將建立的人源膠質(zhì)母細(xì)胞瘤器官(glioblastoma organoids，GBOs)移植到成年小鼠大腦中，GBOs表現(xiàn)出對(duì)周圍組織的快速浸潤，并且保留了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的異質(zhì)性和許多關(guān)鍵特征，因此可以快速研究制定患者的精準(zhǔn)治療策略，能夠及時(shí)對(duì)個(gè)性化治療反應(yīng)做出測試，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化型研究方面有廣泛的應(yīng)用。

2.2 PDX模型在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤免疫治療研究中的應(yīng)用PDX模型聯(lián)合嵌合抗原受體T(chimeric antigen receptor transduced T，CAR-T)細(xì)胞治療癌癥成為近年來腫瘤免疫治療的新方法。有研究指出，CAR-T細(xì)胞能顯著增強(qiáng)抗腫瘤作用，特別是對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤療效尤其顯著[19]。在一項(xiàng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的PDX動(dòng)物模型研究中，EGFR Ⅲ型突變體(EGFRvⅢ)的CAR-T治療產(chǎn)生了非常有希望的結(jié)果，它抑制了小鼠顱內(nèi)腫瘤的生長，目前正在對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行臨床試驗(yàn)[20]。有研究[21-22]利用小鼠異種移植模型，發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中與單獨(dú)靶向表皮生長因子受體2(HER2)的CAR-T細(xì)胞相比，通過雙特異性T細(xì)胞聯(lián)合靶向HER2 和白介素13受體α2的策略在清除腫瘤細(xì)胞方面顯示出更高的效率和更少的抗原逃逸變體。Wing等[23]將溶瘤病毒與過繼性CAR-T細(xì)胞結(jié)合，提高了PDX小鼠腫瘤模型的抗腫瘤效果，延長了其存活率，為實(shí)體瘤免疫治療研究提供了新的策略。Lee等[24]利用PDX小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK)失活可導(dǎo)致GBM遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，將NK細(xì)胞經(jīng)靜脈或瘤內(nèi)移植入原位GBM模型，可誘導(dǎo)腦內(nèi)GBM細(xì)胞凋亡。因此，通過補(bǔ)充腦內(nèi)NK細(xì)胞來治療GBM可能是一種極具潛力的免疫治療策略。

3 PDX模型的局限性與未來展望

就現(xiàn)階段對(duì)膠質(zhì)瘤的研究而言，PDX是重現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞瘤病灶特征的較好的動(dòng)物模型，能很好的保留原發(fā)腫瘤部位的特異性。但由于種屬的不同，腫瘤的生長特點(diǎn)及侵襲性與原始腫瘤不盡相同，而且不同部位的腫瘤組織，模型移植成功率也不同，胃腸道腫瘤的移植成功率較高，而乳腺癌的移植成功率較低[25]。建立PDX所花費(fèi)的時(shí)間較長，成本較高，移植成功率不確定，很難完整的復(fù)制患者數(shù)據(jù)[26]。另外，PDX模型造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的平衡與人類也不同，藥物分布和代謝的速率不同，以及腫瘤生長速率比大多數(shù)癌癥患者要高[27]，為了保證數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性，國際社會(huì)平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)于建立PDX模型和管理分子譜數(shù)據(jù)至關(guān)重要[28]。隨著研究的深入和國際合作的加強(qiáng)，以上這些問題有望逐步得到解決。

雖然有很多問題亟需解決，但PDX模型保留腫瘤形態(tài)和遺傳穩(wěn)定性，保留原發(fā)腫瘤的所有分子生物學(xué)特性及其腫瘤異質(zhì)性的優(yōu)勢不可否認(rèn)，這在人類膠質(zhì)瘤研究中效益突出[29]。模型的腫瘤組織與原發(fā)組織相比，其獨(dú)特的表達(dá)特征和表達(dá)穩(wěn)定性證實(shí)了PDX小鼠模型在膠質(zhì)瘤研究中的有效性和實(shí)用性。另外，由于免疫系統(tǒng)在腫瘤防治中的重要作用，未來可以利用基因編輯重建小鼠免疫系統(tǒng)，用以研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤的免疫治療。

4 小結(jié)

總之，PDX模型作為研究腫瘤治療的強(qiáng)大工具，有助于對(duì)研發(fā)出的新型藥物的敏感性和耐藥性進(jìn)行預(yù)測[30]，可精確模擬原始腫瘤的生物學(xué)行為和個(gè)體化治療，也可以篩選抗腫瘤藥物，預(yù)測藥物療效、藥物吸收率等，為腫瘤研究和藥物研發(fā)提供獨(dú)特的平臺(tái)，是我們研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及其他腫瘤的重要工具。