中藥調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞功能治療阿爾茨海默病的機(jī)制研究進(jìn)展

張偉 孫偉明 徐家淳 李霖 張琳琳 倪道艷 于臻 王凱

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為記憶力、判斷力逐漸下降，隨病情發(fā)展而喪失生活自理能力等[1]。AD的主要病理特征有β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)沉積形成的老年斑、過度磷酸化tau蛋白聚集組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及神經(jīng)炎癥[2]。近年來，神經(jīng)炎癥逐漸成為AD病理的研究熱點(diǎn)，小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia,MG)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的核心結(jié)構(gòu)，在AD病理進(jìn)程中主要發(fā)揮著獨(dú)特的“炎性”和“吞噬”功能，是AD病理研究中的重要靶點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎虛是AD的發(fā)病基礎(chǔ)，痰、瘀是AD發(fā)展和加重的關(guān)鍵因素，治當(dāng)補(bǔ)腎填精生髓、化痰蠲濁、標(biāo)本兼治[3]。中醫(yī)藥在治療AD方面取得了一定療效，且中醫(yī)藥治療該病的機(jī)制研究也取得了一定進(jìn)展。本文就中藥從調(diào)控MG“炎性”和“吞噬”功能治療AD的機(jī)制研究進(jìn)展作一綜述，以期為臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

1 中藥調(diào)控MG“炎性”功能

在AD中，MG的“炎性”功能是一把“雙刃劍”，既可參與炎癥反應(yīng)，又可在一定程度上抑制炎癥，減少神經(jīng)元的損傷和死亡。在AD病理狀態(tài)下，隨著Aβ的過度沉積及tau蛋白的增多，MG被過度激活，激活后的MG極化為M1和M2兩種細(xì)胞類型維持免疫平衡。M1型分泌促炎因子，如白細(xì)胞介素-lβ(interleukin-lβ,IL-lβ)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)，加重炎癥反應(yīng)，同時(shí)會(huì)加重Aβ沉積；M2型分泌抑炎因子，如IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，保護(hù)神經(jīng)元[5-6]。與此同時(shí)，MG中多種受體通路被Aβ和tau蛋白激活，也參與到其“炎性”功能中來，主要涉及核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號(hào)通路，toll樣受體(toll-like receptor,TLR)和NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體等[7]。

1.1 抑制NF-κB通路

NF-κB通路通常由細(xì)胞外刺激激活，在MG的“炎性”功能中可促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和釋放，是對(duì)有害細(xì)胞刺激的第一反應(yīng)者。NF-κB通路的激活可進(jìn)一步激活相關(guān)炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、環(huán)氧合酶(cyclooxygenase-2,COX-2)等，這些炎癥因子進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而加重神經(jīng)元的損傷[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎中藥淫羊藿單體淫羊藿苷長期(8個(gè)月)作用于APP/PS1小鼠，可通過降低其腦內(nèi)Aβ的生成并抑制MG過度激活，減少NF-κB p65磷酸化修飾，抑制促炎因子IL-1β的生成，從而改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[9]。

復(fù)方地黃飲子可通過抑制APP/PS1小鼠腦內(nèi)p38-NF-κB通路，減少炎癥因子iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β的合成，且其改善認(rèn)知的功效與多奈哌齊相當(dāng)[10]。復(fù)方地黃飲子的這種抗炎能力與方中諸藥的功效密切相關(guān)：熟地黃中的梓醇成分可減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥反應(yīng)中iNOS及ROS的表達(dá)[11]；而方中肉蓯蓉的主要化學(xué)成分苯乙醇苷類和毛蕊花糖苷，則可有效抑制AD小鼠腦內(nèi)TNF-α、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)和一氧化氮等炎癥刺激物的產(chǎn)生[12]；方中醒神開竅藥物石菖蒲，其主要化學(xué)成分為苯丙素類，如β-細(xì)辛醚，可有效抑制NF-κB啟動(dòng)子活性，直接抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄，以此達(dá)到抗炎的目的[13]。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Aβ誘發(fā)NF-κB通路過度激活是造成AD腦內(nèi)炎癥反應(yīng)加重、學(xué)習(xí)記憶能力減退的原因，中藥單體和復(fù)方能通過抑制NF-κB通路激活，改變MG的活化狀態(tài)，減少炎癥因子釋放，發(fā)揮抗炎作用。

1.2 抑制PI3K/Akt信號(hào)通路

PI3K/Akt信號(hào)通路被認(rèn)為是AD病理中的重要級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，在多種細(xì)胞生長過程如氧化應(yīng)激、鈣超載、自噬、炎癥等多種機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，中藥對(duì)此通路的抑制有助于減輕神經(jīng)炎癥。

補(bǔ)氣要藥黃芪提取物黃芪皂苷I可抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞中M1型標(biāo)記物iNOS、COX-2蛋白以及p-PI3K、p-Akt的表達(dá)，減少M(fèi)G過度激活，從而減輕其引發(fā)的神經(jīng)炎癥[14]。

復(fù)方改良三甲散具有補(bǔ)肝腎、充腦竅、祛痰瘀的功效，體外實(shí)驗(yàn)中其含藥腦脊液培養(yǎng)BV-2細(xì)胞后，可下調(diào)BV-2細(xì)胞PI3K、p-Akt、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平，改善MG引發(fā)的神經(jīng)炎癥[15]。

通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)MG向M2型轉(zhuǎn)化，減輕炎癥反應(yīng)，表明中藥在治療AD方面可通過調(diào)節(jié)MG極化發(fā)揮抗炎作用。

1.3 抑制TLR表達(dá)

TLR是一類主要參與自然免疫反應(yīng)的重要蛋白質(zhì)，作為一類模式識(shí)別受體，可識(shí)別多種類型病原體相關(guān)分子模式或危險(xiǎn)相關(guān)分子模式，在Aβ誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生中扮演著重要角色[16]。

體外實(shí)驗(yàn)中采用LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞擬炎癥模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，姜黃素(1、5、10 μmol/L濃度時(shí))可對(duì)BV-2細(xì)胞內(nèi)TLR4表達(dá)水平和促炎因子IL-1β和IL-6的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一定抑制作用，且呈劑量依賴性，同時(shí)對(duì)髓細(xì)胞觸發(fā)受體2(triggering receptors expressed on mye-loid cells 2，TREM2)的表達(dá)和抑炎因子IL-4、精氨酸酶-1的轉(zhuǎn)錄具有促進(jìn)作用，說明姜黃素能調(diào)節(jié)MG的“炎性”功能[17]。當(dāng)歸芍藥散具有養(yǎng)血活血的功效，亦可降低BV-2細(xì)胞中TLR2和TLR4受體的表達(dá)、減少炎癥因子(IL-1β、iNOS、TNF-α)的釋放，從而對(duì)BV-2細(xì)胞起到保護(hù)作用[18]。

針對(duì)Aβ誘導(dǎo)的AD模型大鼠研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素可顯著下調(diào)其腦內(nèi)TLR4、TNF受體相關(guān)因子6、NF-κB的表達(dá)，在一定程度上抑制MG過度活化造成的炎癥損傷[19]。而吳茱萸提取物吳茱萸堿，也可通過抑制TLR4受體及NF-κB蛋白表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[20]。

TLR已成為近年來調(diào)控MG“炎性”功能的研究熱點(diǎn)，而對(duì)于此靶點(diǎn)的研究主要集中于中藥單體，對(duì)復(fù)方的研究相對(duì)缺乏，是否其他益智藥物也可通過影響此靶點(diǎn)以改善AD認(rèn)知值得深度探索。

1.4 抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá)

NLRP3炎癥小體作為固有免疫的重要組分在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中具有重要作用。在AD中Aβ可以促進(jìn)MG溶酶體破壞，激活NLRP3炎性小體，使MG分泌IL-1β進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)；同時(shí)分泌的IL-1β通過下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路又能持續(xù)過度激活MG，說明NLRP3的激活是Aβ誘導(dǎo)MG炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。NLRP3不僅可以檢測到由非正常寡聚或錯(cuò)誤折疊引起的細(xì)胞外Aβ聚集并與之結(jié)合[21]，且NLRP3與Aβ結(jié)合后可促進(jìn)AD另一大病理因素tau蛋白的聚集[22]。

研究發(fā)現(xiàn)，芪苓益腦湯可顯著抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)中NLRP3炎癥小體的表達(dá)、減少Aβ的沉積，改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[23]。胡黃連能減少Tg6799小鼠腦內(nèi)NLRP3炎性小體的數(shù)量并降低β分泌酶的產(chǎn)生，誘導(dǎo)MG由促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐盅谞顟B(tài)，扭轉(zhuǎn)Aβ沉積引起的AD小鼠認(rèn)知功能下降[24]。

上述研究不僅證實(shí)了NLRP3炎癥小體在AD神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的促炎作用，而且體現(xiàn)了中藥在此過程中發(fā)揮的抑制作用；但研究主要傾向于中藥通過減輕NLRP3炎癥小體減少Aβ沉積方面的作用，缺乏中藥對(duì)tau蛋白聚集作用的研究。

1.5 促進(jìn)抑炎性TGF-β的表達(dá)

TGF-β可由M2型MG產(chǎn)生和釋放，在神經(jīng)炎癥中起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)MG激活引起的iNOS、TNF-α和IL-1β表達(dá)增加[25]。血竭素高氯酸鹽是血竭的提取物，研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)Aβ1-42擬AD模型大鼠腦內(nèi)TGF-β1的表達(dá)，并減少Aβ和促炎性p-SMAD2的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)MG炎性功能，達(dá)到改善大鼠認(rèn)知能力的作用[26-27]。

復(fù)方腦泰方Ⅱ號(hào)由黃芪、川芎、地龍、僵蠶、白術(shù)、防風(fēng)六味中藥組成，張秀麗等[28]將其含藥血清與LPS誘導(dǎo)的HAPI MG模型共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，中藥血清組可抑制MG向M1型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)其向M2型轉(zhuǎn)化，且可增強(qiáng)IL-4、TGF-β的mRNA合成能力，進(jìn)而增加抗炎因子表達(dá)和分泌。

可見，中藥可通過促進(jìn)MG向M2型極化，并促進(jìn)其對(duì)TGF-β的合成表達(dá)以改善AD中的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

2 中藥調(diào)控MG“吞噬”功能

在AD初期，MG的激活能對(duì)過度沉積的Aβ和受損傷的神經(jīng)元碎片進(jìn)行吞噬清除，維持神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮良性“吞噬”功能。然而，在疾病后期MG過度激活時(shí)，其產(chǎn)生的細(xì)胞因子可促使MG對(duì)突觸進(jìn)行過度吞噬，反而加重神經(jīng)元損傷[29]。MG上表達(dá)的多種膜受體不僅能引導(dǎo)激活后的MG向聚集和沉積的Aβ遷移與聚集，還可提高M(jìn)G吞噬Aβ的能力。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Aβ斑塊形成后的1～2天內(nèi)，MG即可被激活并招募到相應(yīng)位點(diǎn)[30]。多光子顯微鏡下監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，注射Aβ抗體后腦組織中將會(huì)立即出現(xiàn)快速的MG激活和斑塊清除反應(yīng)[31]。

2.1 促進(jìn)TREM2受體表達(dá)

TREM2是一種免疫球蛋白超家族跨膜受體，存在于多種骨髓系細(xì)胞中，在外周神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)于各種組織的巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和破骨細(xì)胞表面，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)僅表達(dá)于MG表面[32]。TREM2不僅可抑制炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)元損傷，也可促進(jìn)MG在纖維性Aβ斑塊周圍聚集，并增強(qiáng)MG對(duì)Aβ的清除。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TREM2缺陷可激活5xFAD小鼠海馬中PI3K/Akt/FoxO3a信號(hào)通路減輕氧化應(yīng)激以抑制炎癥反應(yīng)，而體外實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)的TREM2可促使MG向M2型轉(zhuǎn)化[33]。

研究發(fā)現(xiàn)，中藥白藜蘆的提取物白藜蘆醇可改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[34]，李曉光等[35]在體外實(shí)驗(yàn)中證明AD病理相關(guān)早老素蛋白1過表達(dá)可減少BV-2細(xì)胞對(duì)TREM2的膜轉(zhuǎn)運(yùn)，而當(dāng)白藜蘆醇體外作用于LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞系時(shí)，可促進(jìn)TREM2的表達(dá)及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、促進(jìn)MG對(duì)Aβ的吞噬。

2.2 調(diào)節(jié)LRP1/RAGE通路

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1(low density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP-1)和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)為血腦屏障中介導(dǎo)Aβ內(nèi)吞清除的重要受體[36]，可表達(dá)于MG等神經(jīng)細(xì)胞表面。當(dāng)歸芍藥散與多奈哌齊分別作用于APP/PS1模型小鼠時(shí)，二者均可減少小鼠水迷宮逃避潛伏期時(shí)間，提高小鼠在Y迷宮中三個(gè)臂交替百分比與曠場試驗(yàn)中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間；二者均可減輕Aβ的沉積、抑制腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞過度激活、上調(diào)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)出腦蛋白LRP1的水平、下調(diào)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)入腦蛋白R(shí)AGE的水平，說明當(dāng)歸芍藥散或可通過調(diào)節(jié)LRP1/RAGE通路改善AD小鼠認(rèn)知功能[37]。

益智湯由西洋參、石菖蒲、天麻、枸杞子、淫羊藿、川芎六味中藥組成，以其水煎劑干預(yù)APP695轉(zhuǎn)基因小鼠90天后，中藥組RAGE的表達(dá)減少、LRP-1的表達(dá)增加，且電擊實(shí)驗(yàn)中小鼠學(xué)習(xí)達(dá)標(biāo)次數(shù)也明顯增多，說明益智湯可通過調(diào)節(jié)LRP1/RAGE通路增加MG對(duì)Aβ的清除，改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[38]。

苓桂術(shù)甘湯灌胃干預(yù)Aβ1-42擬AD模型大鼠30天后發(fā)現(xiàn)，中藥組腦內(nèi)LRP-1表達(dá)水平提高，RAGE表達(dá)水平降低，Aβ的積累和炎癥因子的釋放減少，表明苓桂術(shù)甘湯可通過調(diào)節(jié)LRP1/RAGE通路增加機(jī)體對(duì)Aβ的吞噬作用，從而改善AD認(rèn)知[39]。

Aβ與載脂蛋白E等結(jié)合為復(fù)合物后，可被微血管表達(dá)的LRP-1所識(shí)別，進(jìn)而入血被清除；而MG表面的RAGE可與Aβ結(jié)合進(jìn)而加速M(fèi)G對(duì)Aβ的內(nèi)吞降解，因而可通過調(diào)節(jié)LRP1/RAGE通路，促進(jìn)MG對(duì)Aβ的吞噬清除進(jìn)而減輕神經(jīng)元損傷，而中藥在此方面有一定作用，可作為未來探索方向進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.3 促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

自噬作為細(xì)胞代謝和細(xì)胞器更新的必要過程，能于細(xì)胞內(nèi)吞噬胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并降解，在某種程度上也可算做MG“吞噬”作用的一部分，故自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的增加亦可促進(jìn)MG“吞噬”功能。自噬相關(guān)蛋白Atg-5、p62和LC3B是自噬體形成過程中所需的相關(guān)蛋白質(zhì)，可促進(jìn)自噬體的形成、結(jié)合聚泛素化蛋白并將其進(jìn)一步降解。

研究表明姜黃素可改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，該作用可能與增強(qiáng)自噬相關(guān)蛋白Atg-5及p62表達(dá)有關(guān)[40]。體外實(shí)驗(yàn)中姜黃素作用于Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，姜黃素組和原代MG組細(xì)胞中Aβ1-42蛋白的表達(dá)均少于模型組，可知姜黃素能通過增加MG對(duì)Aβ的吞噬作用減少神經(jīng)元損傷[41]。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為AD病機(jī)屬腦消髓減、神機(jī)失用。腎主生髓，故AD的病機(jī)根本在于腎虛[42]。王清任對(duì)癡呆病機(jī)有云：“小兒屬髓海未滿，高年為髓海漸空?！倍X髓的充盈又賴于腎精的濡養(yǎng)，如唐容川所說：“記在何處，則在腎經(jīng)?！蹦I精充足，則生髓能力旺盛，髓旺上充于腦，維持人體正常思維認(rèn)知等功能[43]。人臨遲暮，腎精虧虛，髓海漸空，不足上榮腦竅，因而出現(xiàn)健忘、反應(yīng)遲鈍。腎主水，司氣化，腎虛則氣化功能受損，體內(nèi)水濕不化凝聚成痰，痰濁蒙竅可使人呆鈍昏蒙。

針對(duì)NF-κB、PI3K/Akt、NLRP3、toll等MG重要通路或受體，中藥能通過調(diào)控以上通路中關(guān)鍵靶點(diǎn)的表達(dá)，調(diào)節(jié)“炎性”功能發(fā)揮減輕炎癥反應(yīng)的作用[44]，且中藥復(fù)方是單味藥物的組合，集諸藥之所長，是中藥多途徑、多靶點(diǎn)的作用體現(xiàn)。而AD中Aβ、tau等病理產(chǎn)物或?yàn)橹嗅t(yī)學(xué)中AD“濁邪蒙竅”的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)[45]，而中藥通過調(diào)節(jié)MG中TREM2、LRP1/RAGE、自噬相關(guān)蛋白等對(duì)以上病理產(chǎn)物發(fā)揮“吞噬”作用，或可闡釋中醫(yī)藥治療AD中化痰、祛瘀治法的作用機(jī)制[46]。

現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)研究可證實(shí)中藥能通過調(diào)節(jié)MG功能改善AD的學(xué)習(xí)記憶能力減退，且初步揭示了其作用機(jī)制，但研究多集中在調(diào)控MG“炎性”功能方面，對(duì)“吞噬”功能的機(jī)制研究尚顯不足，尤其是MG對(duì)細(xì)胞碎片的清除作用未能體現(xiàn)。此外，研究多為中藥有效成分或提取物的干預(yù)作用，對(duì)于復(fù)方的研究相對(duì)不足，難以體現(xiàn)復(fù)方多成分、多途徑的整體優(yōu)勢。日后可通過中藥復(fù)方有效組分的挖掘，并結(jié)合疾病證候模型系統(tǒng)深入地研究中藥調(diào)控MG功能治療AD的作用機(jī)制，為臨床采用中藥治療AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。