天然化合物作為抗衰老干預(yù)的可能性：NAD+的開源與節(jié)流

王浩，趙瑞杰，李晴，陳丁丁

(中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211100)

1 衰老與NAD+

衰老是一種細胞到整體普遍存在的時間依賴性內(nèi)生變化，表現(xiàn)為機體形態(tài)的老化，主要機能系統(tǒng)的退行性變化，其中最為廣泛的原因是代謝水平改變。老年個體的代謝功能下降，甚至表現(xiàn)出一定程度的紊亂，因此老年個體更容易出現(xiàn)高血壓、血脂異常等代謝疾病。在很多討論中，抗衰老藥物開發(fā)往往意味著尋找一種干預(yù)手段對衰老過程加以“糾正”，事實上，衰老是一種漸進、多方面的機能退化，其藥物開發(fā)，不能同單一病種藥物開發(fā)一樣，應(yīng)當更多著眼于衰老給機體帶來的更廣泛的影響，即代謝水平的退化。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，又稱輔酶I，簡稱為NAD+，作為輔酶廣泛參與如三羧酸循環(huán)、糖代謝等數(shù)百個生物代謝過程。NAD+于20世紀初被發(fā)現(xiàn)并確定了命名規(guī)范，NAD為不帶電荷的化學(xué)主鏈結(jié)構(gòu)的簡稱，氧化和還原形式分別簡寫為NAD+和NADH。

哺乳動物NAD+合成源于色氨酸起始的從頭合成通路，色氨酸經(jīng)過加氧酶生成氨基羧基粘康半醛(ACMS)，ACMS有兩條去路：一是在α-氨基-β-羧基粘康酸-ε-半醛脫羧酶(ACMSD)作用下轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A；二是轉(zhuǎn)化為喹啉酸(QA)生成煙酸單核苷酸(NaMN)最終轉(zhuǎn)化為NAD+。煙酰胺核苷(NR)、煙酰胺(NAM)、煙酸(NA)、煙酰胺單核苷酸(NMN)回收是占比更大的NAD+生成途徑，NA的利用稱為Preiss-Handler通路，其在煙酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(NAPRT)作用下生成NaMN，最終產(chǎn)生NAD+。NR、NAM、NMN的利用稱為補救合成途徑(Salvage pathway)，NR和NAM分別經(jīng)過煙酰胺核苷激酶(NRK)和煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)生成NAD+。

NAD+消耗主要發(fā)生在幾類以NAD+為底物的酶中：①環(huán)ADP核糖合成酶，最典型的是一種廣泛表達的細胞外酶CD38。早前已有研究表明衰老組織中CD38表達增強，NAD+含量明顯降低[1]。②ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶(PARP)，研究最多的PARP1在DNA損傷時過度激活，耗盡線粒體的NAD+，誘導(dǎo)細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)抑制小鼠PARP1活性，可提高NAD+水平，改善線粒體功能，表明在未有明顯DNA損傷的正常狀態(tài)下，PARP1也在消耗NAD+[2,3]。③SARM1，新發(fā)現(xiàn)的NAD+裂解酶，其在神經(jīng)元中表達，神經(jīng)損傷時過量消耗細胞質(zhì)NAD+，引發(fā)細胞死亡[4]。NMNAT2-KO小鼠的NAD+補救合成途徑存在缺陷，導(dǎo)致先天神經(jīng)元缺損，研究發(fā)現(xiàn)敲除SARM1使NMNAT2-KO小鼠神經(jīng)元缺陷得到有效彌補[5]。

人們對NAD+的興趣再次高漲，一定程度上源自Sirtuins蛋白的發(fā)現(xiàn)。Sirtuins是一類高度保守的NAD+依賴性去乙酰化酶家族，在哺乳動物中有Sirt1-Sirt7七種亞型。最初證明其NAD+依賴性是在酵母中的沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Sir2)，其參與了酵母壽命的調(diào)控[6]。哺乳動物中與之同源的Sirt1響應(yīng)NAD+信號，調(diào)節(jié)凋亡、代謝和節(jié)律等關(guān)鍵生理過程，其介導(dǎo)NAMPT的表達，調(diào)節(jié)NAD+濃度的晝夜波動[7]。楊越[8]研究證實，干預(yù)NAMPT/NAD+/Sirt1軸，可以延緩骨髓間充質(zhì)干細胞的衰老。p53是細胞周期的負調(diào)控因子，其活性增加導(dǎo)致p21表達增加，p21與細胞周期依賴性蛋白激酶結(jié)合抑制其活性，促使細胞衰老。p21是Sirt1抗衰老機制的下游效應(yīng)物，研究表明提高細胞內(nèi)NAD+水平并活化Sirt1，進而調(diào)控p21基因表達可延緩細胞衰老[9]。

2 開源：促進NAD+從頭合成與前體利用

2.1 ACMSD與NAD+從色氨酸起始的合成

通過從頭合成增加NAD+抗衰老還少有討論，ACMSD是哺乳動物體內(nèi)色氨酸合成NAD+的關(guān)鍵酶，控制了中間產(chǎn)物ACMS的反應(yīng)平衡，ACMSD高表達時，ACMS主要產(chǎn)生乙酰輔酶A，而生成喹啉酸并最終產(chǎn)生NAD+的途徑將大幅弱化，因此，抑制ACMSD的表達使反應(yīng)平衡傾向于喹啉酸支路是增加NAD+自身合成的一個有效辦法。

Nature最新刊發(fā)的研究顯示，在線蟲和小鼠中使用TES公司開發(fā)的兩種新型ACMSD選擇性抑制劑TES-991和TES-1025阻斷該酶的活性后，檢測到了更高的NAD+水平和更強的線粒體功能，Sirt1的表達也被上調(diào)[10]，推測阻斷ACMSD通過增加NAD+從色氨酸來源的合成增強了代謝功能。也有研究發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸酯等對ACMSD有抑制作用[11]，可以有效增加NAD+水平，但是既有研究成果多數(shù)集中于在肝腎等特定器官中提高NAD+的生成以期治療脂肪性肝炎、慢性腎病等某些病種，對于ACMSD和衰老的研究很少。盡管如此，現(xiàn)有研究給阻斷ACMSD提高NAD+從而延緩衰老帶來了后續(xù)可行性支撐，那么可否找到化學(xué)合成藥以外更適宜長期應(yīng)用的干預(yù)手段？

2.1.1 多不飽和脂肪酸攝入抑制ACMSD活性

多不飽和脂肪酸已被充分證明其維護心血管系統(tǒng)功能、促進大腦發(fā)育等多方面作用，且其基本上依靠膳食攝入。Egashira團隊在大鼠飼料中加入2%的ω-3多不飽和脂肪酸，如EPA、DHA，就可以強烈抑制肝中ACMSD活性，后續(xù)研究進一步發(fā)現(xiàn)，亞油酸作為ω-6多不飽和脂肪酸，抑制ACMSD活性的能力弱于ω-3多不飽和脂肪酸，飽和脂肪酸幾乎無抑制作用。提示適度增加膳食中多不飽和脂肪酸，尤其是ω-3多不飽和脂肪酸，可有效抑制ACMSD活性，增加NAD+合成，提高機體代謝[12-13]。

2.2 前體補充

直接補充NAD+的幾類前體物質(zhì)具有理論上的可行性。但后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)，額外攝入NA會導(dǎo)致嚴重潮紅，過多攝取NAM也存在副作用，如對Sirtuins蛋白產(chǎn)生抑制。同時，NR、NAM、MNM所處的補救合成途徑在前體回收中占比更大，通過補救合成途徑進行補充更有效。NAM除上述毒性風(fēng)險外，還受限速酶NAMPT制約。因此，補充NR或NMN是更值得研究的手段。

Martens等[14]證實，給健康中老年人長期服用1000mg/day的NR，不僅有效提高了體內(nèi)NAD+水平，還顯著降低血管僵硬性，同時沒有引發(fā)任何不良反應(yīng)。從更高效的目的出發(fā)，NMN似乎比NR更值得關(guān)注，作為NR的下游產(chǎn)物，NMN是NAD+的更直接來源，并避免了NR在線粒體內(nèi)缺少相關(guān)轉(zhuǎn)化酶且其口服后有相當部分轉(zhuǎn)化為NAM的缺點。補充NMN后吸收迅速，直接改變了NAD+的體內(nèi)水平，NAMPT、NMNAT等酶活性未受明顯影響。Mills等[15]發(fā)現(xiàn)，自然衰老小鼠長期應(yīng)用300mg/kg的NMN，未顯示明顯毒副作用，且NMN的補充攝入不僅增強血漿NMN和組織NAD+水平，促進線粒體呼吸增強能量代謝，同時改善了許多與衰老相關(guān)的退行性變化，主要表現(xiàn)為老年小鼠的年齡相關(guān)性體重增加被抑制、體力活動增加、骨密度改善。LIU等[16]也證明，外源NAD+補充劑以時間和濃度依賴方式增加胞內(nèi)NAD+，提高Sirt1活性，通過Sirt1-p53途徑降低氧化應(yīng)激損傷，抑制心肌細胞凋亡。

3 節(jié)流：減少NAD+自身消耗

除增加NAD+的合成和前體利用外，減少NAD+自身消耗也是可行思路。前述NAD+消耗酶：PARP、CD38、SARM1均已發(fā)現(xiàn)了多種抑制劑，如PARP抑制劑奧拉帕尼，CD38抑制劑化合物78c，SARM1抑制劑化合物XAV939等[17-19]。但多數(shù)化學(xué)合成抑制劑長期安全性存疑，尋找天然化合物作為NAD+消耗酶抑制劑是更安全可行的方案，幸運的是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種廣泛存在的天然化合物能有效抑制CD38活性。

CD38是廣泛存在于細胞膜上的一類環(huán)ADP核糖水解酶，以NAD+為底物，分解產(chǎn)生NAM和ADPR或cADPR，消耗體內(nèi)的NAD+。美國巴克衰老研究所發(fā)現(xiàn)，衰老與慢性炎癥給體內(nèi)的衰老細胞帶來代謝負擔(dān)，這些衰老細胞會激活許多免疫細胞的CD38，導(dǎo)致NAD+大量降解，衰老和炎癥使肝臟內(nèi)促炎M1巨噬細胞累積，該類巨噬細胞可以高水平的表達CD38，同時衰老細胞由于DNA損傷且不再分裂，會分泌大量促炎蛋白SASP加重慢性炎癥，誘導(dǎo)M1巨噬細胞進一步增殖，形成惡性循環(huán)[20]。同期另一項研究證實：衰老誘發(fā)的炎癥促進了免疫細胞中CD38的積累并且降低NMN和NAD+水平[21]，這與巴克衰老研究所的研究相互佐證。

3.1 幾種天然CD38抑制劑

3.1.1 芹菜素、槲皮素

芹菜素(apigenin)，自然界中廣泛存在的黃酮類化合物，芹菜中含量尤高。目前已發(fā)現(xiàn)了其在抗病毒、心血管保護等方面的生物活性。槲皮素也是一種廣泛分布的黃酮類化合物，在抗菌和防治心血管疾病等方面有較強的活性，且治療劑量內(nèi)未顯示毒性。

Carlos等[22]發(fā)現(xiàn)芹菜素和槲皮素對CD38有特異性抑制作用，體外實驗發(fā)現(xiàn)芹菜素或槲皮素處理后胞內(nèi)NAD+水平顯著提升。后續(xù)動物實驗中，芹菜素及槲皮素干預(yù)小鼠和敲除CD38小鼠均比野生型小鼠有更高的NAD+水平和Sirt1活性，長期飼養(yǎng)中，芹菜素組、槲皮素組和CD38敲除組小鼠更是表現(xiàn)出了更長的平均壽命和最大壽命。同時，研究者進行PARP1敲除小鼠的平行實驗，發(fā)現(xiàn)其NAD+水平也顯著提升，但平均壽命顯著縮短，可能與PARP1參與DNA修復(fù)和維持基因穩(wěn)定性有關(guān)。這也說明在幾種典型的NAD+消耗酶中，抑制CD38活性是更安全的抗衰老手段。

過去已發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)可以緩解小鼠高血脂、糖尿病等代謝疾病，一般認為其機制為激活A(yù)MPK，而芹菜素是一種很弱的AMPK活化劑，這進一步佐證其提高代謝水平和抗衰老是通過抑制CD38提高NAD+水平從而激活Sirt1實現(xiàn)的。當然，Sirtuins家族的其他蛋白也可能受到CD38活性減弱的影響，同時CD38也存在于線粒體中，芹菜素和槲皮素的干預(yù)也可能提高位于線粒體的Sirtuin蛋白活性，直接提高線粒體代謝水平。此外，天然化合物往往具有多靶點的特點，芹菜素和槲皮素也很可能存在CD38以外的靶點，這將是后續(xù)值得繼續(xù)研究的問題，但目前已經(jīng)明朗的是它們對CD38的有效抑制提高NAD+水平和平均壽命。

3.1.2 木犀草素

木犀草素(luteolin)也是一類天然黃酮類化合物，在辣椒、紫蘇等中含量較高。James和YJ Zhao[23]發(fā)現(xiàn)木犀草素可保留心肌細胞內(nèi)的NAD+保護缺血后心臟。其團隊通過動物缺血再灌注模型和離體心臟模型驗證了在心臟發(fā)生缺血后，CD38被大幅激活，引發(fā)NAD+池的枯竭，這種現(xiàn)象在內(nèi)皮細胞內(nèi)尤甚。內(nèi)皮細胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)依賴于一氧化氮合酶(eNOS)，而eNOS產(chǎn)生NO的過程需要NADH的參與，因此CD38的過度激活所引發(fā)的NAD+池枯竭使內(nèi)皮功能極大改變。內(nèi)皮功能的減弱和血管收縮舒張功能障礙也是衰老個體的易發(fā)癥狀，研究者后續(xù)通過eNOS依賴性的冠狀動脈血流和左心室功能測量，驗證了木犀草素作為CD38抑制劑具有逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮功能障礙的活性，這和提高膳食中黃酮類物質(zhì)的含量可以降低多因素心臟損傷的既有結(jié)論[24]相互驗證。

3.2 天然CD38抑制劑小結(jié)

近年又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種天然藥物可以抑制CD38活性，包括多種類黃酮、大黃素型游離蒽醌[25]等，這些天然藥物的現(xiàn)有研究往往針對于其對神經(jīng)、心血管等具體器官退行性病變的逆轉(zhuǎn)，但它們共同的核心機制是抑制CD38來增加體內(nèi)NAD+水平，提升代謝能力，這使得在抗衰老領(lǐng)域?qū)@些藥物進行進一步研究也極具價值。

更重要的是，天然化合物往往有多靶點的特點，在體內(nèi)表現(xiàn)出多種活性，而衰老也是一種系統(tǒng)性的機體功能衰退，既有的藥物開發(fā)思路很難通過單一方法逆轉(zhuǎn)整體衰老，天然化合物的多靶點活性恰恰適宜于這種狀況，有如芹菜素、木犀草素等天然黃酮類物質(zhì)不僅體現(xiàn)出提高NAD+水平的能力，其對心血管系統(tǒng)的保護、抗炎、維持血糖血脂穩(wěn)定等作用也是對衰老個體的另一重保護。

4 展望

抗衰老研究發(fā)現(xiàn)了各種關(guān)乎衰老進程的反應(yīng)或物質(zhì)，但仍舊很難提出一種行之有效且安全的藥物抗衰老方法，主要瓶頸在于難以保證長期應(yīng)用的安全性和可靠性。但是也應(yīng)當認識到，抗衰老干預(yù)不同于以往的藥物開發(fā)，抗衰老研究應(yīng)當具有整體性、可行性和預(yù)防性，即基于衰老機體的整體進行有可行性的日常干預(yù)，以期實現(xiàn)對衰老進程的延緩和并發(fā)疾病的預(yù)防。正因此，基于日常膳食和天然化合物來多靶點提高NAD+水平，增強整體代謝能力是值得深入討論且可實踐的重要思路。