輔助生殖技術(shù)中卵母細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集研究進(jìn)展

姜經(jīng)航 綜述 江梅 審校

荊門市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北 荊門 448000

人類輔助生殖技術(shù)為了獲得一定數(shù)目的卵母細(xì)胞，會使用促排卵藥物，其有可能導(dǎo)致卵細(xì)胞周圍微環(huán)境的改變，引起卵母細(xì)胞的形態(tài)變化，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常。不同于自然周期中卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟是同步的，促排卵周期可能出現(xiàn)不同步，卵母細(xì)胞胞漿出現(xiàn)多種形態(tài)異常。卵母細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集(aggregates of smooth endoplasmic reticulum，SERa) 就是卵母細(xì)胞形態(tài)異常的一種。2011 年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會(Alpha/ESHRE)專家共識建議丟棄含有SERa卵母細(xì)胞[1]。然而，2015年一項基于歐洲生殖醫(yī)學(xué)中心的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，只有48%的中心接受2011 年Alpha/ESHRE 共識建議[2]。2017 年Alpha/ESHRE修訂后指出根據(jù)病例個體化選擇，再次給出一個模糊處理方式[3]。鑒于對于SERa 的卵母細(xì)胞的處理意見不統(tǒng)一，本研究就國內(nèi)外對含有SERa 卵母細(xì)胞的研究進(jìn)行綜述，為臨床決策提供證據(jù)支持。

1 滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在卵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能

滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(smooth endoplasmic reticulum，SER)是細(xì)胞質(zhì)中最常見的細(xì)胞器之一。當(dāng)受精的精子觸發(fā)卵母細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高，此時胚胎發(fā)育就開始了，這是因為儲存在滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+反復(fù)釋放和重新攝取的結(jié)果，Ca2+釋放主要由卵母細(xì)胞的磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)介導(dǎo)[4]。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不成熟的卵母細(xì)胞中存在滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管和發(fā)育不全的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體，而成熟的卵母細(xì)胞中，數(shù)量最多的細(xì)胞器是線粒體-滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體(mitochondria-SER，M-SER)。M-SER 聚集體直徑從0.5～5 mm不等，被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)成熟的標(biāo)志[5-6]。M-SER聚集體是成熟卵母細(xì)胞受精過程中的觸發(fā)因素，有助于產(chǎn)生典型的鈣振蕩；可能參與受精和第一次胚胎卵裂時的能量產(chǎn)生和儲存[5-6]。

SERa 就是卵母細(xì)胞異常的一種。電鏡檢查發(fā)現(xiàn)畸形卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量大的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體簇，SERa 大小約為(25.3±6.6)～(26.4±6.4) μm[7-8]，在皮質(zhì)下也觀察到少數(shù)小的SERa，通常被線粒體包圍，這些小的聚集體在倒置顯微鏡下看不到，但是電鏡檢查可以觀察到[9]。超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)大的SERa被異常形狀的線粒體和由非常小的小泡組成的小致密小體所包圍，內(nèi)部有彎曲的致密小管，在外周較小的SERa中也觀察到相同的病理改變。SERa MⅡ卵母細(xì)胞皮質(zhì)和皮質(zhì)下主要富含大空泡包裹SER和小SERa[8]，在未受精的卵母細(xì)胞、老化的卵母細(xì)胞和胚胎中也觀察到。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(光滑或粗糙)在卵母細(xì)胞或胚胎的應(yīng)激反應(yīng)以及對減數(shù)分裂紡錘體的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[8]。線粒體ATP供應(yīng)平衡是決定卵母細(xì)胞受精和胚胎發(fā)育能力的關(guān)鍵因素之一，在SERa卵母細(xì)胞中，存在非典型的鈣釋放模式，這種模式對正常的線粒體呼吸活動和線粒體ATP 的供應(yīng)平衡產(chǎn)生有深遠(yuǎn)的影響。在分子水平研究結(jié)果提示在SERa 卵母細(xì)胞中，線粒體鈣調(diào)節(jié)缺陷和能量ATP 動態(tài)平衡的紊亂可能會對下游胚胎發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響[10-12]。通過采用基因芯片技術(shù)比較MⅡSERa 陽性和陰性卵母細(xì)胞基因表達(dá)譜，生物信息學(xué)分析表明，在SERa陽性的卵母細(xì)胞中，參與三個主要生物學(xué)過程的基因表達(dá)顯著下調(diào)：(1)細(xì)胞分裂和有絲/減數(shù)分裂核分裂、紡錘體組裝、染色體分離和有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M 轉(zhuǎn)變；(2)參與細(xì)胞骨架和微管組織形成；(3)線粒體的結(jié)構(gòu)和活性；從而從分子水平強(qiáng)調(diào)SERa的存在與卵母細(xì)胞生理改變以及發(fā)育能力降低之間可能存在一定聯(lián)系[10，12]。

2 SERa形成的原因

導(dǎo)致SERa卵母細(xì)胞的分子學(xué)機(jī)制和細(xì)胞活動仍不清楚，不同的因素可能參與了這種畸形的起源，并對臨床結(jié)果有不同的影響。卵母細(xì)胞SERa的發(fā)生率為1.8%～23.1%[11，13-14]。有研究觀察發(fā)現(xiàn)SERa 在常規(guī)IVF 周期和ICSI 周期中第二極體出現(xiàn)之后，原核出現(xiàn)之前消失，在常規(guī)IVF 周期存在時間為(6.16±1.06) h，在ICSI 周期存在時間為(5.43±1.9) h，在受精失敗的卵母細(xì)胞內(nèi)SERa 不會消失[15]。但是因使用顯微鏡的設(shè)備不同，胚胎學(xué)家的經(jīng)驗、知識水平以及對SERa的認(rèn)知深度的不一致，導(dǎo)致SERa 報道的發(fā)生率也不盡相同。

2.1 SERa的形成可能與遺傳有關(guān)一例28歲女性患者連續(xù)三個ICSI 周期中，共獲得59 個均含有SERa MⅡ卵母細(xì)胞，三個周期ICSI 受精率分別為80%、50%和42%，但是經(jīng)過移植以后均無正常新生兒出生[16]；有1例患者連續(xù)7個ICSI治療周期，其中有6次出現(xiàn)SERa，移植后均未妊娠[8]，對于SERa陽性周期的患者，在后續(xù)再次發(fā)生SERa的比例甚至可以達(dá)到32%[17]。

2.2 SERa 的形成可能與促排卵激素藥物的使用有關(guān)控制性超促排卵時，SERa 陽性周期患者需要更高劑量的促性腺激素(初始和總劑量)以及更長的刺激持續(xù)時間[7-8，14-15，18]。但是有些學(xué)者持以相反的觀點，他們認(rèn)為促性腺激素總劑量和刺激時間上并不導(dǎo)致SERa的形成[17，19-22]。在連續(xù)三個ICSI周期中促性腺激素的起始量都降低了，但是在后續(xù)的治療周期中依舊獲得全部SERa的卵母細(xì)胞[16]。也有報道，使用芳香化酶抑制劑促排的患者卵母細(xì)胞中SERa的發(fā)生率(15.2%)明顯高于使用枸櫞酸克羅米芬促排的患者(6%)[23]。

2.3 SERa的形成可能與體外培養(yǎng)時長有關(guān)SERa通常出現(xiàn)在MⅡ期的卵母細(xì)胞中，而不是在MⅠ和GV 期的卵母細(xì)胞中，并且在分裂中期延長時也會出現(xiàn)。將未受精的卵母細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2～5 d 后，既往無SERa的卵母細(xì)胞中會出現(xiàn)SERa。在大SERa和/或小SERa之間可能存在連接，這些潛在的連接可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)部SERa進(jìn)一步增大[11]。在繼續(xù)培養(yǎng)過程中，老化卵母細(xì)胞可能會發(fā)生細(xì)胞質(zhì)異常變化，大于35歲女性的卵母細(xì)胞對長期培養(yǎng)更為敏感[24]，SERa最有可能與該異常變化有關(guān)[9]。

2.4 SERa的形成可能與促排卵方案有關(guān)促性腺激素釋放激素(GnRH)激動劑或拮抗劑來抑制核成熟，GnRH 拮抗劑組SERa 發(fā)生率為(4.37±11.62)%，明顯低于GnRH激動劑組的(7.36±17.17)%[25]。長方案所產(chǎn)生的SERa陽性周期明顯多于SERa陰性周期[7]。刺激方案(例如拮抗劑方案、長方案、短方案等)和/或劑量的改變會降低產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)成熟卵母細(xì)胞的可能性，說明刺激方案對卵母細(xì)胞SERa 產(chǎn)生有一定的影響[9]。然而有學(xué)者卻持有相反的觀點，短方案、長方案以及拮抗劑方案與SERa的產(chǎn)生并無因果關(guān)系[17]。

2.5 SERa的形成可能與性激素水平有關(guān)芳香化酶抑制劑促排的患者SERa陽性周期的血清雌二醇和孕酮水平均明顯高于SERa陰性周期，枸櫞酸克羅米芬促排的患者中SERa陽性和SERa陰性周期的血清雌二醇和孕酮無差別[23]。有研究提示血清雌二醇[7，9，15，20]和孕酮[15]濃度是顯著變化的，但是有學(xué)者卻指出與孕酮水平無顯著相關(guān)[9，18，22，26]。基礎(chǔ)狀態(tài)下性激素水平在SERa陽性和SERa陰性周期中是無差別的，但是SERa陽性周期促排卵后血清雌二醇水平可升高[18，22，26]，顯著高于SERa 陰性周期[(1 282.2±920.3) pg/mL vs (1 059.0±919.7) pg/mL][7]。單獨(dú)使用卵泡刺激素的患者和卵泡刺激素與黃體生成素協(xié)同刺激的患者所獲得的卵母細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)上存在明顯差異[24]，黃體生成素過早激增可能導(dǎo)致MⅡ卵母細(xì)胞中SERa 的形成[11]。同時有研究表明，SERa陽性周期中卵母細(xì)胞獲得數(shù)據(jù)比較多[13，19]?？箍娎占に貪舛容^高的患者的SERa 發(fā)生率(6.4%)高于正常范圍抗繆勒激素患者的SERa發(fā)生率(1.7%)[14]。

3 SERa對受精率以及胚胎發(fā)育的影響

SERa卵母細(xì)胞中觀察到染色體排列紊亂和/或皮質(zhì)肌動蛋白完整性喪失，導(dǎo)致細(xì)胞骨架異常，可能阻礙第二極體排除或?qū)е率芫舐蚜堰^程中的染色體分離錯誤和干擾細(xì)胞質(zhì)分裂，這對胚胎存活率有明顯的影響[10，12]，并且鈣離子分布模式紊亂導(dǎo)致異常卵裂[11]。含SERa 的卵母細(xì)胞在第二極體排出過程中有絲分裂分裂失敗的發(fā)生率和減數(shù)分裂失敗的發(fā)生率均顯著高于不含SERa 卵母細(xì)胞，ICSI 周期中減數(shù)分裂失敗率更高，有絲分裂的過程中發(fā)生卵裂失敗胚胎細(xì)胞可能變成四倍體，導(dǎo)致染色體構(gòu)型異常，卵裂失敗的細(xì)胞可能會發(fā)育滋養(yǎng)層細(xì)胞，導(dǎo)致胎盤形成障礙，SERa 卵母細(xì)胞來源的胚胎在形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)后，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在分裂的過程中也會發(fā)生卵裂失敗，進(jìn)而可能導(dǎo)致非整倍體發(fā)生[11]。

SERa 周期中，卵母細(xì)胞正常受精與SERa 直徑呈正相關(guān)，單原核、三原核和未受精卵母細(xì)胞與SERa直徑無關(guān)，胚胎繼續(xù)培養(yǎng)后觀察發(fā)現(xiàn)，第2天和第3天的胚胎形態(tài)不受SERa的影響[14]。SERa的存在能夠顯著降低受精率、胚胎卵裂率、囊胚形成率[20]以及優(yōu)質(zhì)胚胎形成率[8-11，14，18，22-23，27]。亞組分析(總MⅡ、正常MⅡ和SERa MⅡ)顯示，SERa MⅡ的受精率受到嚴(yán)重影響，明顯低于SERa 陰性卵母細(xì)胞，在繼續(xù)行囊胚培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，SERa 陽性的卵母細(xì)胞來源胚胎發(fā)育會受到限制，進(jìn)入囊胚期的胚胎明顯較少[8，14，21]，SERa導(dǎo)致內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的質(zhì)量下降35%[28]，囊胚形成率可由62.8%降為42.2%[13]，甚至為無囊胚形成[29]，但是在對形成囊胚進(jìn)行評分時發(fā)現(xiàn)，SERa 的存在并不影響囊胚質(zhì)量[14]。然而有研究確得出相反的結(jié)論，SER 陽性周期第2 天和第5 天更容易得到優(yōu)質(zhì)胚胎，囊胚形成率也略勝一籌[17]。也有一些研究證實，SERa 陽性周期的患者受精率、胚胎卵裂率、囊胚形成率以及優(yōu)質(zhì)胚胎形成率并無影響[7，13，15，19，21，23，25-26，30]。SERa 陽性周期中卵母細(xì)胞Veeck 分級越高，受精率和卵裂率卻與SER 陰性周期越相近[9]。枸櫞酸克羅米芬促排周期SERa 陽性和SERa陰性囊胚形成率卻無差別[23]。在對亞組分析顯示，在SERa陽性周期，SERa陽性MⅡ和SERa陰性MⅡ的受精率、IPN發(fā)生率、3PN發(fā)生率、以及在第3天和第5天發(fā)育成優(yōu)質(zhì)胚胎的能力相似[7，13，19，27]。當(dāng)SERa 陽性MⅡ培養(yǎng)至第5/6天時，常規(guī)IVF和ICSI受精方式的不同對受精率、胚胎卵裂率和囊胚率也無影響[15]。

4 SERa對妊娠結(jié)局的影響

如果遵循2011 年Alpha/ESHRE 共識，將SERa 卵母細(xì)胞丟棄，可利用卵母細(xì)胞數(shù)量減少，部分患者無可利用胚胎，導(dǎo)致周期取消率增加，從而降低卵子數(shù)量有限的夫婦受孕的機(jī)會。周期取消率與血清卵泡刺激素水平和SERa 卵母細(xì)胞數(shù)呈顯著正相關(guān)，在對獲得卵子數(shù)進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn)，獲得卵子數(shù)為1～5 個周期取消率最高[31]。

后代的表型在很大程度上取決于卵母細(xì)胞的質(zhì)量，SERa 卵母細(xì)胞具有高非整倍體率(18%～37%)[28]。大SERa的出現(xiàn)表明細(xì)胞質(zhì)是病理性的，胚胎發(fā)育、胚胎種植以及臨床預(yù)后下降和新生兒畸形均與SERa有關(guān)，移植SERa陽性的卵母細(xì)胞來源的胚胎以后，種植率可降低40%[19]，妊娠率下降67%，生化妊娠率明顯升高[9]，流產(chǎn)率增加20%[32]，但是抱嬰回家率呈現(xiàn)一種相反的變化趨勢[14]，即使是來自同一周期的SERa陰性的卵母細(xì)胞受孕機(jī)會也較低[9，19]，因此不建議SERa 的卵母細(xì)胞來源的胚胎用于移植[8]。

并非所有的研究都指出SERa的存在對妊娠結(jié)局不利。在玻璃化冷凍囊胚移植周期中，SERa陽性MⅡ在IVF和ICSI中的臨床妊娠率沒有顯著差異，進(jìn)一步Logistic 回歸分析中，SERa 的存在與持續(xù)妊娠率之間沒有顯著關(guān)聯(lián)(95%CI：0.505～1.963)[15]。在芳香化酶抑制劑和枸櫞酸克羅米芬促排的患者SERa 陽性和SERa 陰性周期之間，在胚胎種植率、流產(chǎn)率以及活產(chǎn)率沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異[23]。同時對于SERa 陽性周期的患者，無論是β-HCG 陽性的數(shù)量，還是臨床妊娠率和流產(chǎn)率、種植率都沒有顯著減少[7，9，14，18-19，21，26，30]，但是隨著含SERa 陽性卵母細(xì)胞比例的增加，活產(chǎn)率逐漸降低，含SERa 陽性卵母細(xì)胞比例大于50%時無活產(chǎn)胎兒出生[30]。在SERa 陽性周期中亞組分析顯示，SERa陽性MⅡ卵母細(xì)胞妊娠率雖然低于SERa陰性MⅡ卵母細(xì)胞，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，流產(chǎn)率或活產(chǎn)率在兩者之間無區(qū)別[7]。單純SERa 陽性MⅡ卵母細(xì)胞來源胚胎移植(31例)、單純SERa陰性MⅡ卵母細(xì)胞來源胚胎移植(235 例)和混合性胚胎移植(98 例)的妊娠率(25.8%、37.4% 和41.8%)、種植率(18.9%、17.4% 和13.1%)和臨床妊娠率(22.6%、32.4%和37.9%)無明顯差異[13]。但是也有研究指出SERa 卵母細(xì)胞形成的優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯降低[26]。SERa-MⅡ例數(shù)最少，但是異位妊娠率較高，卻沒有顯著差異[8]。

5 SERa對新生兒結(jié)局的影響

有研究報道指出，SERa陽性周期中有386例新生兒出生，并詳細(xì)記錄這些新生兒情況，有364例健康新生兒，而22例孕婦發(fā)生了圍產(chǎn)期并發(fā)癥，這些并發(fā)癥包括10例活產(chǎn)畸形，4例新生兒死亡，2例死產(chǎn)和6例終止妊娠；其中48例來自SERa陽性MⅡ卵母細(xì)胞來源胚胎移植，1例活產(chǎn)畸形，1例新生兒死亡，1例死產(chǎn)和1例終止妊娠；另有53例健康新生兒來源于混合移植，并伴有7例圍產(chǎn)期并發(fā)癥[33]。以上畸形主要表現(xiàn)為：膈疝、三體(47XY+21)綜合征、重復(fù)腎、尿道下裂、心血管畸形、臂癱以及Beckwith-Wiedemann 綜合征等[8-9，13-14，16，33-34]。SERa陽性和陰性周期新生兒畸形率無區(qū)別[7，14-15，18，21，23，30]，但是隨著含SERa 陽性卵母細(xì)胞比例的增加，活產(chǎn)率逐漸降低，含SERa 陽性卵母細(xì)胞比例大于50%時無活產(chǎn)胎兒出生[30]。SERa的患者妊娠期產(chǎn)科并發(fā)癥比例相對較高，更容易出現(xiàn)早產(chǎn)，但是出生的新生兒體質(zhì)量也明顯降低[7，，14]，妊娠期較短[7]，但有研究卻發(fā)現(xiàn)妊娠周數(shù)、新生兒體質(zhì)量以及身長無差別[13，15，21]。

卵母細(xì)胞的安全性進(jìn)行更多的流行病學(xué)研究，尤其有必要評估出生時和后期發(fā)育期間的畸形發(fā)生情況，SERa 作為預(yù)測臨床結(jié)局的結(jié)論的研究樣本量尚少，并且不同的研究結(jié)果之間存在一定的爭議，SERa和胎兒畸形之間是否真的存在關(guān)聯(lián)尚不清楚，但是也有可能存在失訪漏報的可能性。

6 結(jié)語

2011年Alpha/ESHRE專家共識，強(qiáng)烈建議不要對受影響的卵母細(xì)胞進(jìn)行授精，歐洲部分生殖中心調(diào)查結(jié)果顯示，47.5%的生殖中心對SERa卵母細(xì)胞的管理政策接受Alpha/ESHRE 共識建議，然而只有大約13.8%的中心丟棄SERa 卵母細(xì)胞；42.5%的中心不會丟棄SERa卵母細(xì)胞，但會對移植SERa周期的胚胎和新生兒進(jìn)行追蹤隨訪；24.4%的中心在孕期會制定專門的妊娠監(jiān)測。大約25%的中心會和患者溝通這種卵母細(xì)胞畸形，無論是丟棄還是移植，均應(yīng)該獲得患者知情并簽署同書以后才能繼續(xù)后續(xù)醫(yī)療行為[2]。鑒于目前研究有正常新生兒出生，特別是卵子數(shù)量有限的夫婦如若遵循該共識，會增加周期取消率，2017 年Alpha/ESHRE 再次提出專家共識，與患者充分溝通，正確地告知患者出生畸形的風(fēng)險，以及不移植所導(dǎo)致妊娠機(jī)會降低，個體化處理[3]。

因此，本研究指出SERa 卵母細(xì)胞在輔助生殖技術(shù)中有一定的發(fā)生率。目前，對于該卵母細(xì)胞是否行體外受精意見尚不統(tǒng)一。就目前移植SERa卵母細(xì)胞來源的胚胎的研究數(shù)據(jù)而言，有健康新生兒出生，這些文獻(xiàn)數(shù)據(jù)支持給予學(xué)者以及患者信心。臨床上，丟棄SERa卵母細(xì)胞，可能是一種不合理的處理策略，應(yīng)該讓這些卵母細(xì)胞受精，繼續(xù)發(fā)育成具有可利用價值的胚胎，避免了卵母細(xì)胞的浪費(fèi)。再無其他適合移植的胚胎時，酌情考慮選擇SERa卵母細(xì)胞來源的胚胎進(jìn)行移植前。但應(yīng)當(dāng)充分告知患者，幫助其進(jìn)行移植決策，且必須嚴(yán)格追蹤胎兒情況以及密切隨訪觀察新生兒的成長發(fā)育。對于卵母細(xì)胞SERa形成原因我們生殖工作者應(yīng)該繼續(xù)深入研究其機(jī)制，為臨床避免SERa尋找一種治療策略，改善不孕癥患者的臨床結(jié)局。