食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

郝海珍

（內(nèi)蒙古烏蘭察布市疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 烏蘭察布）

0 引言

當(dāng)前，食品安全問(wèn)題是一個(gè)重大的民生問(wèn)題，受到了人們的廣泛關(guān)注，政府也將其提到了重要的議程上。而食品安全的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與評(píng)估工作是食品檢測(cè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的重要任務(wù)。隨著科技的不斷發(fā)展及人們對(duì)于食品安全問(wèn)題越來(lái)越重視，食品微生物成為食品安全評(píng)價(jià)指標(biāo)的重要方面，一旦其受到污染將會(huì)導(dǎo)致食品安全出現(xiàn)問(wèn)題。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[1]對(duì)食品微生物常用的檢測(cè)技術(shù)為普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板及其他特定的培養(yǎng)基，通過(guò)肉眼觀察或是放大鏡進(jìn)行有效的觀察，通過(guò)檢測(cè)觀察結(jié)果對(duì)食品的微生物是否受到污染及污染的程度進(jìn)行判定。而檢測(cè)需要的步驟較為繁瑣，既費(fèi)時(shí)間又費(fèi)精力，一旦出現(xiàn)突發(fā)的食品安全問(wèn)題后檢測(cè)結(jié)果一般都較為滯后。因此，應(yīng)選擇一種更加安全有效的檢測(cè)方法，彌補(bǔ)常規(guī)檢測(cè)方法的不足。食品微生物快速檢測(cè)經(jīng)過(guò)實(shí)證得出具有一定的可行性。該技術(shù)類型較多，且在食品微生物快速檢測(cè)發(fā)揮了重要的作用。本研究詳細(xì)分析了幾種檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)行了如下的綜述。

1 分子生物學(xué)技術(shù)

1.1 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)采取預(yù)定位置進(jìn)行固定的方法，載體上有核酸分子，數(shù)量為數(shù)千萬(wàn)個(gè)，且呈現(xiàn)為微點(diǎn)陣列，對(duì)待測(cè)的樣品預(yù)先進(jìn)行核酸片段的標(biāo)記，在特定的條件下對(duì)樣品補(bǔ)片段及微點(diǎn)陣列核酸片段進(jìn)行雜交處理，選用的雜交信號(hào)為特制的芯片閱讀儀[2]。陸長(zhǎng)勇等用基因芯片技術(shù)對(duì)8種常見(jiàn)的食源性致病菌進(jìn)行了有效的檢測(cè)，建立的基因芯片檢測(cè)方法基礎(chǔ)為單堿基延伸標(biāo)簽反應(yīng)原理，研究結(jié)果顯示對(duì)于食源性致病菌能夠進(jìn)行快速靈敏的檢測(cè)，有效診斷了食源性疾病，在該類疾病中有很好的應(yīng)用價(jià)值[3]。

1.2 核酸探針技術(shù)

核酸片段帶有標(biāo)記物，且有已知序列，雜交時(shí)是與其帶有互補(bǔ)關(guān)系的核酸序列進(jìn)行，在雜交的過(guò)程中形成雙鏈。該技術(shù)對(duì)于待測(cè)核酸樣品中的特定基因序列有一定的應(yīng)用價(jià)值。微生物的種類不同使其具備了獨(dú)特的核酸片段，對(duì)這些片段進(jìn)行有效的分離及標(biāo)記處理，從而制備出探針。該技術(shù)在應(yīng)用檢測(cè)中有較強(qiáng)的特異性及敏感性，能夠充分發(fā)揮出檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，但也有一定的不足之處存在，如常見(jiàn)的有探針應(yīng)和菌相對(duì)應(yīng)、需要對(duì)樣品進(jìn)行一定時(shí)間的培養(yǎng)。該技術(shù)不適合檢測(cè)經(jīng)毒素污染的不含產(chǎn)毒菌的食品[4]。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction，PCR) 檢測(cè)技術(shù)

PCR 檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用的范圍較廣，如食品中的大腸桿菌、金葡菌、乳酸桿菌等。該技術(shù)在應(yīng)用中的優(yōu)點(diǎn)是快速且具有一定的靈敏性，能夠有效地檢測(cè)出樣品中所含的細(xì)菌。但在應(yīng)用期間也有一定的缺點(diǎn)，如只能鑒定核酸序列已知的細(xì)菌，對(duì)于細(xì)菌并不能判定死活，在定量上也能力較低[5]。

1.4 核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

PCR 技術(shù)反應(yīng)過(guò)程中不斷的發(fā)生變化，這其中會(huì)引發(fā)溫度的改變影響到檢測(cè)。因此，這就需要在技術(shù)上保持恒定的溫度，也就是研究核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，試圖保證溫度不變的情況下增加DNA 或RNA 分子數(shù)目。該技術(shù)的應(yīng)用會(huì)比PCR 更具有實(shí)用性。對(duì)于該技術(shù)有相關(guān)的研究人員針對(duì)副溶血性弧菌不耐熱溶血毒素基因的特點(diǎn)對(duì)特異性的引物進(jìn)行了設(shè)計(jì)，同時(shí)對(duì)12 種細(xì)菌共28 株菌株進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增，只有副溶血性弧菌呈陽(yáng)性結(jié)果，因此提出了副溶血性弧菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法[6]。

2 代謝學(xué)技術(shù)

2.1 三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生物發(fā)光技術(shù)

ATP 生物發(fā)光技術(shù)的原理是熒光素酶在Mg2+存在條件下，底物為ATP、D-熒光素、氧氣等，在能量上進(jìn)行轉(zhuǎn)化，由化學(xué)能向光能轉(zhuǎn)化，同時(shí)釋放出一些光量子，其中發(fā)光的強(qiáng)度同樣品中的ATP 的關(guān)系為正比，提取出細(xì)菌ATP并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的方法為生物發(fā)光法，這樣能夠?qū)悠分械暮窟M(jìn)行有效的推算。該技術(shù)在檢測(cè)中具有較短的周期，但檢測(cè)中靈敏度不高，得到的結(jié)果也不穩(wěn)定。因此，為了改善該技術(shù)存在的不足之處，有研究者[7]對(duì)ATP 生物發(fā)光技術(shù)的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化處理，并研制出了新的酶保護(hù)劑，優(yōu)化后能夠?qū)蝹€(gè)的細(xì)菌檢測(cè)出來(lái)，并在蘋果汁、熟肉制品及魚(yú)肉等食品的細(xì)菌總數(shù)上進(jìn)行了檢測(cè)試用的。

2.2 電阻抗技術(shù)

培養(yǎng)基的電阻抗變化的確定方法為測(cè)定電導(dǎo)率，并繪出電導(dǎo)率時(shí)間曲線及微生物生長(zhǎng)曲線，將二者之間的關(guān)系表現(xiàn)清楚，并以培養(yǎng)基電阻抗變化來(lái)對(duì)待測(cè)微生物生長(zhǎng)繁殖特性進(jìn)行判定。該方法的應(yīng)用范圍也較廣，應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)包括具有較高的敏感度及較強(qiáng)的特異性，能夠進(jìn)行快速的反應(yīng)且有較好的重復(fù)性等。

2.3 微熱量計(jì)技術(shù)

微生物在生長(zhǎng)繁殖期間會(huì)產(chǎn)生一定的熱量，可采用微熱量計(jì)對(duì)其測(cè)量，所得結(jié)果可通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行計(jì)算處理，同時(shí)繪制出熱曲線圖，所要體現(xiàn)的是產(chǎn)熱量對(duì)比時(shí)間，將該曲線圖與已知細(xì)菌的熱曲線圖進(jìn)行了比較，對(duì)細(xì)菌之間的差異進(jìn)行了鑒別。

2.4 放射測(cè)量法

放射測(cè)量法是一種聯(lián)合應(yīng)用的新的檢測(cè)技術(shù)，是將物理的診斷方法與化學(xué)的診斷方法結(jié)合起來(lái)，通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程來(lái)測(cè)量分析培養(yǎng)基里鹽類底物、碳標(biāo)記的碳水化合物等代謝產(chǎn)物一氧化碳，對(duì)培養(yǎng)前后一氧化碳的量進(jìn)行對(duì)比，有效對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)。該方法具有較高的準(zhǔn)確度，且具有較快的檢測(cè)速度，能夠進(jìn)行自動(dòng)化的檢測(cè)。

3 免疫學(xué)技術(shù)

3.1 免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence technique,IFT）

該技術(shù)就是應(yīng)用熒光標(biāo)記技術(shù)，將抗體及抗原的特異性進(jìn)行有效的結(jié)合，在對(duì)細(xì)菌觀察和鑒別中采用的是熒光顯微鏡。該技術(shù)能夠?qū)ι抽T氏菌及葡萄球菌等進(jìn)行快速的檢測(cè)。有人[8]利用間接熒光抗體檢測(cè)方法對(duì)中國(guó)對(duì)蝦弧菌病發(fā)病感染情況進(jìn)行診斷，甚至還能對(duì)未發(fā)病感染的對(duì)蝦進(jìn)行檢測(cè)。

3.2 免疫磁珠分離技術(shù)

免疫磁珠分離技術(shù)是利用一種能夠被磁力吸引且能結(jié)合抗體的磁珠，結(jié)合磁珠上的抗體及待檢樣品中的致病微生物特異性，形成一種復(fù)合體。由于磁珠上有致病微生物，在磁場(chǎng)的作用下會(huì)出現(xiàn)聚集的情況，將形成的復(fù)合物與其他的物質(zhì)進(jìn)行分離。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》 已經(jīng)把免疫磁珠捕獲法作為大腸桿菌的檢驗(yàn)方法[9]。

3.3 酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù) （enzyme linked fluorescence immunoassay，ELFIA）

ELFIA 屬于酶免疫分析技術(shù)，其底物為熒光劑，充分結(jié)合了酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和FIA 兩者的優(yōu)點(diǎn)，在酶催化作用下底物發(fā)生了變化，成為了帶熒光的產(chǎn)物，分析熒光產(chǎn)物的量與樣品中被測(cè)物質(zhì)的量，得出二者之間的關(guān)系是正相關(guān)。對(duì)待檢樣品通過(guò)熒光強(qiáng)度進(jìn)行目的菌的定性或是定量的分析。

3.4 免疫層析技術(shù)

免疫層析技術(shù)在檢測(cè)中運(yùn)用的是抗體-抗原之間相互吸附的作用，檢測(cè)操作更簡(jiǎn)單，操作步驟簡(jiǎn)便，不需要使用任何的儀器，對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)十分適合。

4 生物傳感器技術(shù)

該技術(shù)充分利用了生物敏感材料對(duì)于生物的敏感性，將敏感微生物的濃度進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)換，從而對(duì)食品中的微生物進(jìn)行檢測(cè)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是具有較強(qiáng)的專一性及較高的準(zhǔn)確度，操作起來(lái)方便快捷，能夠進(jìn)行快速的分析，一般的檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)20min，最快的在1min 內(nèi)就能得到結(jié)果。

5 分析化學(xué)技術(shù)

5.1 氣相色譜法和高效液相色譜法

不同的微生物在化學(xué)組成及代謝產(chǎn)物上有所不同，因此，通過(guò)氣相色譜法及高效液相色譜技術(shù)直接分析液體中的細(xì)菌成分，對(duì)微生物的特異化學(xué)標(biāo)志成分進(jìn)行有效判定，從而利于微生物的診斷和檢測(cè)[10]。

5.2 微生物自動(dòng)檢測(cè)法

微生物自動(dòng)檢測(cè)法屬于一種理想的檢測(cè)技術(shù)，是將傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)與微生物檢測(cè)技術(shù)及計(jì)算機(jī)技術(shù)進(jìn)行有效的結(jié)合，運(yùn)用概率最大近似值模型對(duì)食品、環(huán)境等樣品中微生物進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)。該方法的檢測(cè)速度較快，在4-18h可以報(bào)告出具體的菌種。

6 小結(jié)

當(dāng)前，食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及評(píng)估引起了極高的重視。因此，對(duì)于食品微生物檢測(cè)應(yīng)建立快速有效的方法，以對(duì)食品安全問(wèn)題進(jìn)行有效的監(jiān)測(cè)[10]。研究者應(yīng)努力研究并不斷地完善現(xiàn)有技術(shù)，實(shí)現(xiàn)高速、有效、靈敏的檢驗(yàn)[11,12]。