人卵巢組織冷凍及移植技術(shù)的研究進(jìn)展及方向

章婷婷

（蘇州市立醫(yī)院東區(qū)，江蘇 蘇州）

0 引言

卵巢組織的冷凍保存及移植作為保存生育能力的手段已被研究多年。用于為育齡期婦女可能面臨的可能導(dǎo)致永久性不育的生育前卵巢急性損傷提供生育力保存。作為癌癥治療后最具毀滅性的后果,放療和化療可能導(dǎo)致患者生育力受損或完全喪失,尤其是盆腔放療和高劑量烷化劑如環(huán)磷酰胺,已被證明會(huì)導(dǎo)致卵巢萎縮,損害卵巢血管,并減少原始卵泡[1]。因此,在治療前保存生育力勢(shì)在必行。卵巢組織保存在育齡婦女人群中較為適用，而對(duì)于青春期的女孩，采取對(duì)卵巢進(jìn)行冷凍的方法是體外保存生育力的唯一措施[2]。2004 年 Donnez 等[3]首次報(bào)道1 例IV 期霍奇金淋巴瘤患者,患者在進(jìn)行化療前進(jìn)行了卵巢皮質(zhì)冷凍處理，6 年后將凍融的卵巢組織進(jìn)行原位移植，妊娠后自然分娩一女嬰，嬰兒各指標(biāo)均正常。這項(xiàng)報(bào)道證實(shí)了對(duì)于惡性腫瘤患者，采取卵巢冷凍技術(shù)能夠有效保存生育功能。之后有更多的研究證實(shí)了這一點(diǎn)[4]。同時(shí)將卵巢組織冷凍移植技術(shù)應(yīng)用于推遲婦女更年期[5],亦可以提高女性患者的生活質(zhì)量。

1 卵巢組織的獲取

組織收集是通過(guò)腹腔鏡手術(shù)進(jìn)行的。卵巢組織提取的大小程度取決于卵巢功能衰竭的可能性。在臨床條件允許的情況下，最佳的手術(shù)治療方式為完整地將單側(cè)卵巢切除，而剩余一側(cè)的卵巢能夠正常地發(fā)揮該有的功能，也能為以后的卵巢原位移植提供條件。而對(duì)于保留的一側(cè)卵巢來(lái)說(shuō)可能會(huì)受到后續(xù)治療的影響，導(dǎo)致其功能受損,甚至喪失生育能力。

另外,進(jìn)行部分切除也是常用方法,去除一半或2/3的卵巢。用于切除卵巢微小組織(5×5×3mm)的技術(shù)并不常用,許多卵泡在凍融過(guò)程中由于缺血損傷而喪失[6],因此,必須獲得足夠大的組織以便儲(chǔ)存許多卵泡。獲得的卵巢組織在用PBS 洗滌后,將其放入含有IVF 培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中,并運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備冷凍保存[7]。

2 冷凍保存技術(shù)

皮質(zhì)主要由原始卵泡填充,由前顆粒細(xì)胞所包圍的初級(jí)卵母細(xì)胞。此外,研究發(fā)現(xiàn)在皮質(zhì)中有很小的百分比卵泡已經(jīng)開(kāi)始發(fā)育,即初級(jí)卵泡。對(duì)于卵巢皮質(zhì)采取直接冷凍的方法會(huì)有效地保存大量的原始卵泡，卵母細(xì)胞具有較小的體積，且結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，具有較低的代謝率，缺少透明帶，有較少的亞細(xì)胞器對(duì)低溫具有敏感性，在冷凍的過(guò)程中不容易受到損害，同時(shí)也不需要對(duì)卵巢進(jìn)行刺激，或是等到卵子成熟，對(duì)患者的放化療不會(huì)產(chǎn)生影響。因?yàn)橐环N細(xì)胞類型的最佳冷凍保存技術(shù)可能對(duì)其他人無(wú)效[8]。卵巢皮質(zhì)細(xì)胞之間的細(xì)胞大小、密度和膜水力滲透性的差異意味著冷凍保存所需的脫水速率以及理想的冷卻速率因細(xì)胞類型而異。卵巢組織冷凍保存的焦點(diǎn)是成功的凍結(jié)和解凍所有細(xì)胞亞型,促進(jìn)最大數(shù)量原始卵泡的存活,因?yàn)樗鼈冎苯哟砩Ρ４妗?/p>

研究發(fā)現(xiàn)[9],大部分始基卵泡都聚集于距離皮質(zhì)表面0.75mm 內(nèi)的組織中,故一般認(rèn)為,1mm 左右的卵巢組織皮質(zhì)是最為合適的冷凍保存厚度，能夠最有效地保存始基卵泡，也可以通過(guò)面積的增加更好地滲透保護(hù)劑以達(dá)到理想的冷卻速度從而盡量減少對(duì)原始卵泡的損傷,獲得滿意的凍存效果。

3 卵巢組織的移植

3.1 卵巢移植的必要性和安全性評(píng)估

自體移植前,卵巢功能狀態(tài)的評(píng)估是必需的。卵巢衰竭表現(xiàn)為閉經(jīng),高促性腺激素、卵巢激素水平低,AMH 水平低以及超聲下觀察竇卵泡的減少也能提示卵巢衰竭。另外,有些病人在經(jīng)歷了廣泛的原始卵泡儲(chǔ)存損失[10],在治療仍會(huì)偶爾出現(xiàn)不規(guī)則月經(jīng),這并不代表她的卵巢功能衰竭。雖然這些患者表現(xiàn)出顯著的激素紊亂,FSH 水平較高,但他們?nèi)匀豢梢栽诓恍枰殉步M織移植的情況下受孕。

考慮病人的康復(fù)治療和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn),提高卵巢冷凍的安全性至關(guān)重要,盆腔超聲是必要的第一步,以確保沒(méi)有宏觀的卵巢病理存在,防止不必要的手術(shù)或并發(fā)癥。移植前,先將一小塊冰凍的皮質(zhì)組織解凍,組織學(xué)染色,解凍后觀察是否有卵泡的存在,并確保沒(méi)有任何惡性細(xì)胞。常用的檢查手段有術(shù)前影像學(xué)檢查、術(shù)后的新鮮組織病理分析、冷凍后惡性細(xì)胞敏感標(biāo)記物檢測(cè)等，聯(lián)合使用多種方法對(duì)于發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤殘余細(xì)胞有重要作用，減少了細(xì)胞的種植，增加了其移植的安全系數(shù)。

文獻(xiàn)報(bào)道的15 例自體移植的霍奇金淋巴瘤病例中,無(wú)患者出現(xiàn)移植后的復(fù)發(fā)情況，而6 例非霍奇金淋巴瘤進(jìn)行卵巢移植患者中無(wú)復(fù)發(fā)證據(jù)。Sanchez-Serrano 等分析在對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行卵巢冷凍保存后進(jìn)行相關(guān)的組織學(xué)檢驗(yàn)尚未發(fā)現(xiàn)有惡性腫瘤再植的情況。尤其對(duì)于早期的乳腺癌患者采取卵巢冷凍是一種安全的方法。

3.2 移植部位

3.2.1 原位移植

原位移植就是對(duì)于冷凍復(fù)蘇后的卵巢組織將其移植到盆腔中。原位移植可以出現(xiàn)更多卵泡,異位移植卵泡生長(zhǎng)減少,卵母細(xì)胞恢復(fù)率和受精率降低。卵巢移植的一個(gè)關(guān)鍵考慮是維持移植組織的血液供應(yīng)。缺血損傷是導(dǎo)致卵泡丟失的主要原因,因此,移植物充分灌注所需的時(shí)間在移植物存活中起著重要的作用。同位移植能夠有效地將自然的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行保存，同時(shí)也能保存一定的生殖功能，越是靠近輸卵管進(jìn)行移植其自然受孕率越高。2015年[11]1 例28 歲葡萄牙女性接受冷凍10 年卵巢組織進(jìn)行自體原位移植,術(shù)后通過(guò)卵巢刺激方案獲得2 個(gè)卵子,并成功獲得1 枚胚胎。

3.2.2 異位移植

異位移植指的是冷凍復(fù)蘇后的卵巢組織移植部位為非盆腔內(nèi)，其常見(jiàn)的移植部位為腹壁及前壁的皮下。異位移植的優(yōu)點(diǎn)是移植物便于觀察、移植或取出。尤其對(duì)于有盆腔粘連或是盆腔血供不具備較好的條件時(shí)采取異位移植效果較好。但是無(wú)血管移植,可能導(dǎo)致卵巢組織的缺血并加速殘存卵泡的閉鎖;且不能進(jìn)行自然妊娠,必須進(jìn)行促排卵、取卵和體外受精才能獲得妊娠。

4 完整卵巢移植

4.1 完整卵巢移植的優(yōu)勢(shì)

該移植存在的問(wèn)題主要是在新生血管生成期由于缺血的原因而導(dǎo)致丟失大量的卵泡,現(xiàn)已有研究嘗試使用額外的技術(shù)和環(huán)境因素作為一種手段,以改善移植血管重建,縮短缺血期,從而提高整體移植物存活率。有研究顯示SCID 小鼠卵巢移植顯示,當(dāng)加入抗氧化劑、維生素E,卵泡存活率增加。但帶血管蒂的整體卵巢移植則可通過(guò)直接對(duì)血管進(jìn)行吻合而減少組織的缺血損傷,從而有望保存更多的卵泡而使卵巢功能得以長(zhǎng)久維持。Oktay 等[12]報(bào)告了59 例婦女通過(guò)卵巢片段移植術(shù)后,卵巢功能維持平均為(36.8±3.6)個(gè)月。卵巢功能維持時(shí)間最長(zhǎng)者已超過(guò)7 年。

4.2 完整卵巢移植的的技術(shù)難點(diǎn)

整體卵巢移植存在的技術(shù)難點(diǎn)有:(1)整體卵巢冷凍困難。對(duì)于整體卵巢冷凍冷凍劑以及冷凍方式的選擇,仍沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的冷凍方案。(2)冷凍前對(duì)整體卵巢的灌注不可避免地對(duì)卵巢組織和微血管帶來(lái)?yè)p傷,以及吻合術(shù)后血栓形成也會(huì)造成大量卵泡損失,導(dǎo)致其保存卵泡的優(yōu)勢(shì)下降。(3)顯微外科血管吻合手術(shù)技術(shù)和手術(shù)時(shí)間也是影響卵巢移植后卵泡存活率的常見(jiàn)因素,對(duì)于外科操作的水平有更高的要求。(4)整體卵巢組織在攜帶了更多卵泡的同時(shí),攜帶殘留癌細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)加大。

最近關(guān)于卵巢組織冷凍和移植成功的懷孕和分娩的報(bào)告,為那些由于需要立即開(kāi)始化療或放射治療而失去生育能力的患者提供了巨大的希望。需要更多的研究來(lái)優(yōu)化冷凍保存和組織移植的流程。此外,進(jìn)一步改進(jìn)識(shí)別微小殘留病的方法是必要的,以確保沒(méi)有惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。整體卵巢移植為更好地保存生育力提供了方法,但同時(shí)也有更高的技術(shù)要求。能肯定的是,卵巢組織冷凍保存技術(shù)在生育力保存具有真實(shí)的潛力,為生育力保存提供了切實(shí)可行的新思路、新方向[13]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,人卵巢冷凍技術(shù)將會(huì)得到進(jìn)一步的提高，該技術(shù)會(huì)克服一些困難得到完善，在以后的應(yīng)用中會(huì)充分發(fā)揮出應(yīng)有的作用。