慢性腎臟疾病進展因素與CD2AP 的關系研究

王瓊，劉運廣

(1.右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

0 引言

慢性腎臟疾病(CKD) 是腎臟結構和功能在多種致病因素作用下發(fā)生不可逆、緩慢進行性的改變，其臨床表現(xiàn)為腎小球濾過率明顯降低或有腎臟損傷的標志，或兩者都有，持續(xù)至少3 個月。發(fā)展至終末期階段為ESKD，此時腎功能不能長期維持生命，需選擇腎臟替代治療( 以透析或腎移植的形式)，或保守治療( 也稱為姑息治療或非透析治療)。2012年根據(jù)世界衛(wèi)組織全球衛(wèi)生估計，有864 226 例死亡( 占全球死亡人數(shù)的15%) 可歸因于ESKD。據(jù)統(tǒng)計慢性腎臟疾病患病率、死亡率呈逐年增長狀態(tài)，目前全球估計慢性腎病的患病率為13.4%，在高收入國家( 包括美國和澳大利亞) 的患病率一直報告在11% 左右，在2012 我國一項CKD 的流行病學調(diào)查表明成人CKD 患病率高達10.8%。由于慢性腎病通常在疾病進展之前沒有癥狀，目前需要腎臟替代治療的終末期腎病患者估計在490.2 萬至708.3 萬之間。因此CKD 是當今我國乃至全球的所面臨的嚴峻的公共衛(wèi)生問題。慢性腎病的發(fā)展與多種因素相關，常見病因繼發(fā)為高血壓、糖尿病、腎炎、遺傳性腎病等基礎疾病[1-2]。隨著研究手段不斷改善，遺傳因素在腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中得到重視。目前已證實有多個基因與腎病的發(fā)生密切相關。CD2AP 為其中一個重要之一。本文針對慢性腎病的進展因素、CD2AP與足細胞關系、CD2AP 的概述、CD2AP 與慢性腎病之間的關系作一綜述。

1 慢性腎病的進展因素

慢性腎臟疾病最常見的病理表現(xiàn)是腎纖維化。其特征是腎小球硬化、腎小管萎縮和間質纖維化。腎小球硬化是由內(nèi)皮損傷和功能障礙、平滑肌細胞和系膜細胞增殖以及足細胞破壞引起的。蛋白尿、高血壓、高血糖、炎性細胞因子均可損傷足細胞，進而導致足細胞結構及數(shù)量改變，進而影響慢性腎病的發(fā)生、發(fā)展[3]。

2 足細胞與CD2AP

足細胞位于腎小球濾過屏障的外層，是高度特化的終末分化細胞，具有細胞質延伸，即所謂的足突。足細胞在大小和電荷選擇性通透性方面有重要作用。足突之間形成特殊的細胞連接即狹縫隔膜 (slit diaphragm，SD) SD 是一種大小選擇性的過濾屏障，可以防止大分子物質及細胞流失到腎小球超濾液中，SD 的組成成分主要包括nephrin、neph1、podocin，nephrin 的 羧 基 末 端 與CD2AP、podocin 組 裝 形成nephrin-CD2AP-podocin 復 合 物[4]，nephrin-CD2APpodocin 復合物可將裂隙隔膜錨定在肌動蛋白細胞骨架上的關鍵功能單位，應用共聚焦電鏡技術發(fā)現(xiàn)，CD2AP 是腎小球裂孔隔膜上的重要成分，同時發(fā)現(xiàn)大部分CD2AP 與F—actin 的表達部位重疊。由此推測CD2AP 與F—actin 在足細胞內(nèi)存在直接相互作用[5]。在一些體外的動物實驗中，敲除CD2AP 基因后，足細胞的足突會發(fā)生改變，SD 消失，導致大量蛋白尿產(chǎn)生[6]。

3 CD2AP 概述

CD2AP 于1998 年首次被Dustin 等人發(fā)現(xiàn)，是一種參與組織免疫突觸的蛋白，與CD2 結合并使細胞骨架極化，在識別抗原中起著重要作用[7]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在全身多個器官組織均有分布，如腎、腸、肝、胃、肺、牙齒、神經(jīng)組織(背根神經(jīng)節(jié))、脾、胸腺內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、分化的軟骨和骨等[8]。在腎臟主要分布在足細胞上，其編碼基因位于第6 號染色體(6p12.3)上，包含18 個外顯子。其編碼蛋白CD2AP是一種分子質量約80 000、富含SH3 結構的連接蛋白，其氨基末端有3 個連續(xù)的SH3 結構域，羧基末端有1 個雙螺旋結構域，三個Src 同源3 (SH3)結構域可介導多種蛋白-蛋白相互作用[9]。

4 CD2AP 與慢性腎臟疾病進展因素之間的關系

4.1 CD2AP 與蛋白尿

完全敲除小鼠CD2AP 等位基因，生后1 周即會出現(xiàn)蛋白尿，2 周時出現(xiàn)腎病綜合征，6-7 周時死于腎衰竭，進一步發(fā)現(xiàn)CD2AP 基因單倍缺失CD2AP+/-的小鼠在出生后9 個月左右出現(xiàn)腎小球病變，提示CD2AP 基因異常使小鼠對腎小球損傷的易感性明顯增加[10-11]。蛋白尿表明足細胞之間的足突和隔膜的結構和組成發(fā)生了變化。蛋白尿與ESKD 和早期死亡的風險增加相關。毛建華等人發(fā)現(xiàn)MCNS 及IgAN 病人腎組織原位Nephrin 及CD2AP 表達有明顯下降，而在MCNS 及IgAN 病人Nephrin 及CD2AP 分布變成了顆粒狀，可能與腎小球上皮細胞足突的消失、蛋白尿及血漿白蛋白下降程度相關[12]。局部節(jié)段性腎小球硬化癥FSGS 是腎小球疾病的重要病理類型之一，F(xiàn)SGS 病的發(fā)病率在幾乎所有的種族群體中、在整個年齡段以及在世界范圍內(nèi)都在上升。它是兒童和成人獲得性慢性腎病(CKD)的最重要原因之一，多數(shù)對激素治療不敏感，具有發(fā)展為終末期腎病(ESRD)的巨大風險[13]。通過對中國散發(fā)性FSGS 患兒行基因測序，發(fā)現(xiàn)有2 例雜合突變，分別為2 號外顯子第160 位堿基G 被A 替代(160G＞A)、該基因4 號外顯子第358 位堿基A 被G 替代(358A＞G)，均導致相應氨基酸發(fā)生改變。從而使CD2AP 蛋白表達減少，影響裂孔膜蛋白podocin 的表達[14]。為了驗證CD2AP 基因突變可導致腎病的結論的可靠性，通過全外顯子組測序，Takano 等人鑒定出CD2AP (p.S198fs) 中的一個純合的移碼突變，該突變發(fā)生在三個同系兄弟姐妹中，他們的父母患有兒童期發(fā)病的FSGS 病和終末期腎病。當通過基因編輯將相同的移碼突變引入小鼠時，小鼠表現(xiàn)出大量蛋白尿，行腎活檢提示FSGS 病，最終死于腎衰竭。這些結果為CD2AP 純合突變導致人類FSGS 病提供了確鑿的證據(jù)。純合突變小鼠發(fā)展成腎病綜合征、FSGS 和ESRD，并明確證明了突變的因果關系[15]。進一步對其可能參與的細胞因子及細胞通路研究發(fā)現(xiàn)，在CD2AP-/-小鼠腎臟中，在白蛋白尿發(fā)作時足細胞中存在增加的轉化生長因子-β1(TGF-β1)表達和細胞凋亡增加[16]。CD2AP 的C 末端區(qū)域以激酶依賴的方式直接與TGF-β 受體I 型(TβRI)的胞質尾相互作用，并且TβRI 和PI3K 的p85 亞基之間的相互作用需要CD2AP(30)。TGF-β 也能促進Smad3介導的促凋亡信號傳導，Smad2 / 3 缺失的足細胞過度增殖，并且對TGF-β 誘導的生長抑制和凋亡具有抵抗力。在小鼠足細胞Smad3 缺失或CD2AP 雜合的TGF-β1 轉基因小鼠。Smad3 缺乏癥改善了足細胞凋亡，而CD2AP 雜合性增加了足細胞凋亡和蛋白尿[17]。

4.2 CD2AP 與高血糖

足細胞對于保持腎小球濾過屏障的結構和功能至關重要，有證據(jù)表明足細胞的早期丟失促進了DN 的發(fā)展[18]。研究發(fā)現(xiàn)早期糖尿病大鼠足突間隙長度變寬，裂隙隔膜結構逐漸變形，且呈不均一性；隨著病程的延長，糖尿病腎病腎組織CD2AP 密度變得聚集和減少。已經(jīng)表明CD2AP 的缺失導致TGF-β1 在足細胞中的表達增加和CD2AP -/-小鼠的凋亡[19]。Ha 等人研究發(fā)現(xiàn)在小鼠足細胞中，在糖尿病狀態(tài)通過PI3-K/Akt 信號通路在轉錄水平誘導內(nèi)轉位并抑制CD2AP 蛋白的產(chǎn)生；同時降低PI3-K 可以誘導細胞凋亡[20]。另外胰島素抵抗是導致2 型糖尿病發(fā)展的主要缺陷。在1 型和2 型糖尿病患者中，易出現(xiàn)胰島素抵抗與糖尿病腎病。足細胞特異性敲除胰島素受體導致腎小球病變，CD2AP 的缺乏減弱了足細胞的基礎葡萄糖攝取，并降低了胰島素誘導葡萄糖攝取的作用。CD2AP-/-足細胞中胰島素反應性葡萄糖轉運蛋白4 Glut4 儲存囊泡(GSV)轉運受損[21]。糖尿病性腎病遺傳易感性可能更加明顯[22]。CD2AP 變異體與非糖尿病和糖尿病(1 型糖尿病，T1D；2 型糖尿病T2D)腎臟疾病有關。在歐洲1 型糖尿病(T1D)患者中，CD2 相關蛋白基因(CD2AP)中的三個單核苷酸多態(tài)性(SNPs) 與ESKD 相關[23]，這是足細胞功能所必需的。相對于歐洲裔美國人(EAs)，非裔美國人(AAs)發(fā)展為終末期腎病(ESKD)的風險更高。在進行非裔美國人基因測序中，發(fā)現(xiàn)CD2AP 的兩個內(nèi)含子(Rs115912771 和rs116139597) 與T2D-ESKD 相關[24]。

4.3 CD2AP 與高血壓

長期血壓控制的惡化，患慢性腎臟病和更快進展的慢性腎臟病的風險增加。在動物實驗中，發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓小鼠腎小球和腎小管間質CD2AP 蛋白水平降低，可能導致腎臟纖維化[25]。在人體實驗中發(fā)現(xiàn)高血壓患者與正常對照組相比，發(fā)現(xiàn)高血壓組尿沉渣中足細胞足突融合，腎小球nephrin 和/或CD2AP 表達明顯降低。這說明高血壓導致足細胞損傷并脫離腎小球基底膜，這與尿路檢測足細胞一致。同時在患有慢性高血壓患者中檢測到了尿足細胞，這是足細胞缺失的直接證據(jù)[26]。進一步對調(diào)節(jié)血壓的靶向軸研究，發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ (Ang Ⅱ) 是腎素 - 管緊張素系統(tǒng)的主要影響因素。同時血管緊張素II (Ang II)是腎小球疾病的關鍵因素，主要導致足細胞損傷。在小鼠足細胞中，血管緊張素II 處理后，廣泛減少CD2AP 表達，并誘導與濃縮腎蛋白的分離。血管緊張素II 以時間和濃度依賴的方式顯著降低CD2AP 的表達Ang II 通過AT1R 誘導CD2AP 的重新定位和減少，并且通過抑制CD2AP/PI3-K 信號引起足細胞凋亡[27]。用Ang II 處理人足細胞后，發(fā)現(xiàn)并證實Ang II 還可通過激活Arf6-Erk1/2-Nox4信號來促進caspase 3 活性、活性氧(ROX)增加。從而導致人足細胞損傷及凋亡顯著增加。另外在Ang II 處理后檢測到CD2AP 的減少，CD2AP 的過表達顯著抑制Ang II 誘導的活性Arf6-GTP 的升高，表明CD2AP 在抑制人足細胞Arf6 活化中起重要作用[28]。

4.4 CD2AP 與炎性細胞因子通路

Wnt 信號通路與多種人類疾病如炎癥、退行性疾病相關。Tankyrases 是具有信號傳導和細胞骨架蛋白功能的多功能聚(ADP- 核糖) 聚合酶(PARP) 超家族成員，拮抗Wnt/β-catenin 信號傳導。研究數(shù)據(jù)顯示CD2AP-/- 足細胞中β-catenin 的活性增加，淋巴增強因子1(LEF1)(Wnt /β-catenin途徑的介質)和纖連蛋白(Wnt /β-catenin 的下游靶標)上調(diào)。另外，在沒有CD2AP 的情況下，小鼠腎臟和培養(yǎng)的足細胞中，tankyrase 介導的ADP-核糖基化(PARylation)，翻譯后修飾涉及腎臟損傷，用坦科聚合酶抑制劑XAV939 抑制PARylation活性后，足細胞總PARylation 和活性β-catenin 降低，LEF1上調(diào)，纖連蛋白未見明顯變化，誘導與足細胞損傷有關的纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)增加。這表明由CD2AP 維持的tankyrase PARylation 活性的平衡對于正常的腎功能至關重要[29]。白細胞粘附、爬行和遷移受內(nèi)皮機械敏感受體細胞間粘附分子-1 (ICAM-1)的聚集調(diào)節(jié)。最近研究發(fā)現(xiàn)CD2AP的缺失刺激了ICAM-1 聚集的動力學，這促進了ICAM-1 復合物在內(nèi)皮細胞表面的形成。導致中性粒細胞粘附增加，爬行減少。CD2AP 是機械敏感的ICAM-1 下游信號傳導所必需的，它可以激活PI3K，募集F-肌動蛋白和活性分支蛋白皮質肌動蛋白。此外，CD2AP 對于ICAM-1 誘導的Rac1 募集和激活是必需的[30]。在CD2AP 突變小鼠研究腎小球三種主要細胞類型的變化特性。對于每種主要細胞類型，觀察到基因表達中潛在的致病性和保護性轉移。在足細胞中，發(fā)現(xiàn)足細胞中表達的五種角蛋白基因都被明顯下調(diào)，內(nèi)皮細胞中顯示出許多有的基因表達發(fā)生變化，包括血管收縮劑內(nèi)皮素(也在系膜細胞中上調(diào))、Bmp4、許多與細胞因子和干擾素反應相關的基因的上調(diào)。介導白細胞粘附的Vcam1(血管細胞粘附分子1)和Sele 也上調(diào)[31]。這些通路再次驗證了細胞炎性因子對足細胞的損傷，同時目前這些通路尚通過動物或離體細胞組織實驗得到的，尚不能確定在CD2AP 基因突變后足細胞損傷是是由一種還是多種通路參與，需要繼續(xù)追蹤與研究。

5 展望

CD2AP 作為足細胞裂隙隔膜蛋白之一，可通過上述多因素、多種通路參與慢性腎病進展，這對干預、治療慢性腎病提供了新的思路。但一種疾病通常是由多種因素、多種通路共同參與的，目前尚未明確進展因素與通路之間有何種關系，CD2AP 作用尚未明確，應嘗試開展這些方面的研究，同時結合臨床，這對慢性腎臟疾病的治療具有重要意義。