環(huán)狀RNA：銀屑病研究治療的新希望

王亞杰，陳雪，嚴炯，王崢嶸，劉青，趙珩，魏躍鋼，施建新(通信作者*)

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，江蘇 南京 210002)

1 環(huán)狀RNA的背景

最初發(fā)現(xiàn)circRNA是在植物類病毒、酵母線粒體及乙型肝炎病毒中[1]，但是由于結(jié)構(gòu)特殊(結(jié)構(gòu)中不存在5′帽子結(jié)構(gòu)或3′聚(A)尾巴結(jié)構(gòu))，當時的RNA測序技術及生物信息分析技術有限，環(huán)狀RNA一直被認為是異常剪切后錯誤拼接的副產(chǎn)物[2]。伴隨著高通量RNA測序(RNA-seq)技術和生物信息學分析的快速發(fā)展，在人組織中已經(jīng)檢測出數(shù)以萬計的circRNA[3]，因此在很多研究領域中，科學家們都發(fā)現(xiàn)其參與了多種疾病的發(fā)生及發(fā)展。

2 環(huán)狀RNA的類型及成環(huán)機制

circRNA根據(jù)來源可以分為四類：全外顯子型的circRNA、內(nèi)含子和外顯子組合的EIcircRNA、內(nèi)含子組成的套索型circRNA、由病毒RNA基因tRNA、rRNA、snRNA等環(huán)化產(chǎn)生的circRNA。不過就目前的情況來說，circRNA的成環(huán)機制有四種主流推測。第一種是依賴于剪切體進行的索尾接環(huán)化，第二種是RNA結(jié)合蛋白(RBPs)調(diào)控的環(huán)化。第三種是內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)互補配對驅(qū)動的環(huán)化。第四種是前體基因剪接中內(nèi)含子去除或外環(huán)子的套索環(huán)化[4]。

3 環(huán)狀RNA的特點

circRNA大多數(shù)是由外顯子環(huán)化而成的，外顯子circRNA主要細胞質(zhì)或儲存于外泌體中，而較少部分內(nèi)含子和外顯子組合的EIcircRNA和內(nèi)含子circRNA則大多數(shù)存在于細胞核中[5]。目前研究表明circRNA有以下特點:(1)高穩(wěn)定性：circRNA的結(jié)構(gòu)中沒有5′帽子結(jié)構(gòu)或3′聚(A)尾巴結(jié)構(gòu)，可抵抗RNA核酸外切酶或RNaseR降解，相比傳統(tǒng)的線性RNA穩(wěn)定性更高。(2)高特異性：主要體現(xiàn)在細胞類型特異性及發(fā)育不同階段的組織特異性。(3)高豐度性：circRNA廣泛存在于多種真核生物的體內(nèi)，并且表達豐度差異很大，甚至是其對應的線性mRNA的10倍以上。(4)高保守性：在不同物種中高度保守[6]。

4 環(huán)狀RNA的生物學功能

大量研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在腫瘤，皮膚病，心血管，精神分裂等疾病的發(fā)生和發(fā)展環(huán)節(jié)密切相關，并且還預測到在疾病診斷標志物的潛力，但對其生物學功能的研究尚欠，目前較受認可的生物學功能，歸類如下：

4.1 充當miRNA海綿或ceRNA

首先人類普遍認為：circRNA可以通過其miRNA反應元件(MRE)作為microRNA(MiRNA)的競爭性內(nèi)源RNA，通過將miRNA從親本mRNA中隔離出來，競爭性地與miRNA結(jié)合，從而緩解了miRNAs對其靶基因的抑制作用，最終提高靶基因的功能活性，從而在疾病調(diào)控中發(fā)揮重要作用[7]。QIAO等研究發(fā)現(xiàn)：在差異表達的circRNA中鑒定出4405個異常的circRNAs都有miRNAs結(jié)合位點，因此可以預測它們通過CERNA機制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，在人和鼠腦組織中，存在著一類名為小腦變性相關蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物的circRNA，包含74個miR-7結(jié)合位點，充當miR-7a/b的海綿樣作用，對miR-7起負調(diào)控作用。若CDR1as過表達，則與miR-7結(jié)合，提升miR-7靶基因表達水平；如CDR1as表達受到抑制，則miR-7靶基因表達水平下降[9]。此外，一個環(huán)狀RNA不僅可以扮演同一個miRNA海綿的不同角色，還可以扮演多個不同的miRNA的相同角色，這與自身的某些特性不謀而合。

4.2 與RNA結(jié)合蛋白(RBPs)結(jié)合

環(huán)狀RNA與RNA結(jié)合蛋白(RBPs)的結(jié)合，是通過與某些蛋白競爭性相互作用以及作為蛋白質(zhì)支架調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，進而抑制相應功能蛋白的活性，從而發(fā)揮生物調(diào)控功能[10,11]。比如circFOXO3與CDK2和p21的相互作用，產(chǎn)生抑制CDK2功能并抑制G1細胞周期進程的三元復合物，非但如此，它還可以調(diào)節(jié)抗衰老蛋白ID-1、轉(zhuǎn)錄因子E2F1、抗應激蛋白FAK等，促進這些因子參與細胞衰老過程以及在細胞質(zhì)中的保留[6]。

4.3 編碼翻譯蛋白

近年還發(fā)現(xiàn)部分circRNA可以編碼蛋白，由于circRNA缺乏5′的帽子結(jié)構(gòu)、3′末端的尾巴結(jié)構(gòu)，所以到目前為止，環(huán)狀RNA是以非帽近年依賴的方式來翻譯蛋白質(zhì)的，這種翻譯方式主要是通過內(nèi)部的核糖體進入位點促進核糖體與環(huán)狀RNA的結(jié)合，從而實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的翻譯功能[6]。Perriman和Ares在大腸桿菌中構(gòu)建了一個環(huán)狀RNA，其包含GFP序列，它可以表達GFP。但從目前情況來看，有關circRNA的翻譯功能機制還有待進一步研究[12]。

5 環(huán)狀RNA與銀屑病

銀屑病(psoriasis)是一種慢性炎癥性皮膚病，易于復發(fā)，病程較長，臨床上以紅斑、白色鱗屑，半透明薄膜，點狀出血現(xiàn)象為主要表現(xiàn)。其皮損特征主要以角質(zhì)形成細胞(KCs)的異常增殖和角化，是由多基因背景下的T細胞介導的。參與的因素很多，如炎癥、免疫、細胞增殖和凋亡，以及神經(jīng)遞質(zhì)和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑。免疫因子介導的炎癥反應可以促進KCs的異常增殖，最終發(fā)展成了銀屑病。在發(fā)病時期可影響到患者的身心健康，讓患者承受很大的精神壓力，同時也伴隨多種嚴重的并發(fā)癥，比如心血管疾病、惡性腫瘤以及其他自身免疫性疾病等等，截止到目前，國內(nèi)外對它的病因及發(fā)病機理研究尚未完全清楚，但已經(jīng)了解到它是一種復雜的、多因素的疾病，受到遺傳、環(huán)境因素的影響。雖然已經(jīng)出現(xiàn)了一些治療手段，但只能對癥狀進行緩解，所以很需要尋找一些具有高特異性及敏感性顯著的早期診斷生物標志物以及新的治療手段。幸運的是，許多研究表明銀屑病中存在著許多表達異常circRNA，并且調(diào)控著銀屑病的發(fā)生發(fā)展，再加上circRNA具有高特異性和高穩(wěn)定性的特點，都表明了circRNA在不久的將來有機會成為一種新的診斷生物標志物及新的治療靶點。

5.1 促進銀屑病發(fā)生發(fā)展的環(huán)狀RNA

銀屑病可在患者的皮損部位、血液中、毛細胞和血管內(nèi)皮細胞中表現(xiàn)出特異的miRNA表達，參與到皮膚組織的發(fā)育和再生，并通過分泌細胞因子對皮膚微環(huán)境產(chǎn)生重要影響。此外，銀屑病的主要病理特征是表皮細胞異常增殖，真皮內(nèi)T細胞介導的擴張和炎癥反應，真皮乳頭血管扭曲。在銀屑病中，發(fā)現(xiàn)有一部分circRNA參與調(diào)節(jié)炎癥、免疫和細胞增殖等等，而銀屑病的發(fā)生與發(fā)展正是與這些因素息息相關。然而，目前對circRNAs在銀屑病中的作用知之甚少。QIAO等研究發(fā)現(xiàn)：共鑒定出4956個環(huán)狀RNA在銀屑病中有差異表達，其中上調(diào)的有3016個，下調(diào)的有1940個；此外，與正常健康皮膚組織相比，銀屑病皮損中發(fā)現(xiàn)了1156個上調(diào)的mRNA和569個下調(diào)的mRNA，同時也在差異表達的circRNA中鑒定出4405個miRNA反應元件，恰好證明了環(huán)狀RNA可以充當miRNA的功能。其中HSA_CIRC_0061012在銀屑病患者的皮損中表達上調(diào)最為明顯，該環(huán)狀RNA包含的前五位對應miRNA反應元件分別是hsa_miR_7157_5p、hsa_miR_miR_4769_3p、hsa_miR_6817_5p、hsa_miR_4310以 及 hsa_miR_6882_3p[8]。經(jīng)過GO分析這5種miRNAs的靶基因，得知GO富集的前30位中的大多數(shù)與銀屑病有關，例如T細胞的選擇，對白細胞介素4的反應，以及NF_κB轉(zhuǎn)運到核內(nèi)的調(diào)節(jié)[8,11,13-15]。輔助性T淋巴細胞1(T helper lymphocytes 1，Th1)/Th2平衡向Th1顯性免疫的轉(zhuǎn)變是銀屑病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，IL-4可逆轉(zhuǎn)銀屑病Th1/Th2平衡紊亂。NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子，被視為銀屑病炎癥和免疫級聯(lián)反應的“調(diào)控閥門”[14]。提示circ0061012的異常表達可能通過上述方式參與了銀屑病的發(fā)病機制，因而可推測hsa_circ_0061012很有可能成為銀屑病新的生物標志物，為銀屑病的診療提供了一個新的視角，也為進一步深入研究銀屑病奠定了基礎。

5.2 抑制銀屑病發(fā)生發(fā)展的環(huán)狀RNA

在銀屑病中還同樣存在著可以抑制銀屑病發(fā)生發(fā)展的circRNA，有研究發(fā)現(xiàn)CIRC_0003738成為miR-562的分子海綿，釋放靶基因IL-17RA(IL-17受體A)的抑制作用，從而促進銀屑病樹突狀細胞的IL-17A信號轉(zhuǎn)導。同時，CIRC_0003738還可作為miR-490-5p的海綿，解除對靶基因IFNGR2的抑制，從而促進銀屑病樹突起干擾素-γ信號轉(zhuǎn)導。circRNAs可能是miRNA活性的有效抑制劑，所以上調(diào)的CIRC_0003738通過miR-562/IL17RA和miR-490-5p/IFN-g受體2軸抑制銀屑病Tres的功能[16]。

在這項研究中，YANG等研究人員通過分析circRNA在銀屑病Tres中的表達譜，并與正常Tres進行了比較，發(fā)現(xiàn)CIRC_0003738在銀屑病Tres中表達上調(diào)。CIRC_0003738基因敲除銀屑病患者皮損后，可通過抑制IL-17A和干擾素-g的產(chǎn)生，部分恢復銀屑病患者的抑制功能。此外，我們還發(fā)現(xiàn)CIRC_0003738的靶點為miR-562和miR-490-5p，分別靶向IL-17受體A(IL17RA)和干擾素-γ受體2(IFNGR2)。我們的發(fā)現(xiàn)確立了circRNAs在調(diào)節(jié)銀屑病Treg抑制功能中的新作用。CIRC_0003738可能是治療銀屑病的潛在靶點[3,17,18]。

YANG等研究人員對CIRC_0003738在正常樹突和銀屑病患者樹突中的表達模式進行了環(huán)形微陣列分析，分析顯示，在銀屑病Tregs中發(fā)現(xiàn)了4個上調(diào)的circRNA和4個下調(diào)的circRNA，這些上調(diào)的circRNA可能參與炎癥相關通路，如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信號通路、AMPK通路和泛素介導的蛋白水解。CIRC_0003738的異常上調(diào)可能通過促進Th1和Th17相關的促炎細胞因子IL-17A和IFN-γ的分泌而降低銀屑病Tres的抑制功能。Cic_0003738與miR-562和miR-490-5p結(jié)合，circRNA最重要的作用是作為海綿隔離miRNA，miR-562和miR-4905p可能是Tregs中CIRC_0003738的靶點。這些結(jié)果表明IL-17RA是miR-562的直接靶點，IFNGR2是miR-490-5p的直接靶點。CIRC_0003738通過與miR-562競爭性結(jié)合，正向調(diào)節(jié)IL-17A的產(chǎn)生和IL-17信號；通過與miR-490-5p的競爭結(jié)合，調(diào)節(jié)IFN-g的產(chǎn)生和IFN-g信號。HAS_CIRC_0003738在銀屑病樹突中的表達上調(diào)可能會削弱其抑制功能。我們還發(fā)現(xiàn)，CIRC_0003738作為miR-562和miR-4905p的海綿，釋放了miR-562介導的IL-17A信號抑制和miR-490-5p介導的干擾素-γ信號抑制[19,20,21]。

因此，CIRC_0003738/miR-562和miR-490-5p軸有利于Tregs向Th1型和Th17型Tregs的轉(zhuǎn)化，這可能是銀屑病Tregs抑制功能降低的原因之一。Tregs抑制功能障礙在T細胞免疫失衡和銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)CIRC_0003738表達上調(diào)可能是銀屑病中Treg抑制功能降低的另一個機制。然而，還需要進一步的研究來闡明其他circRNA在疾病發(fā)病機制中調(diào)節(jié)Treg功能的作用。除已報道的IL-23等細胞因子外，CIRC_0003738還可促進銀屑病患者T細胞分泌IL-17A和IFN-γ，促進炎癥過程，干擾T細胞穩(wěn)態(tài)。一種可能是HAS_CIRC_0003738可以促進Th1型和Th17型細胞的分化，導致干擾素-γ和IL-17A的表達增加。一方面，TargetScan預測影響Th17細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子，包括RORA、RUNX1和MINA，將成為miR-562的靶基因。另一方面，Th1細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet的輔助因子Ets-1被預測為miR-490-5p的潛在靶基因。另一種可能的機制是HAS_CIRC_0003738的兩個靶點miR-490-5p或miR-562可能直接與IFN-g或IL-17A的30UTR結(jié)合，從而抑制其翻譯。也就是說，circRNA，如CIRC_0003738，可能通過刺激Tregs向Th1樣和Th17樣Tregs的轉(zhuǎn)化來抑制Tregs的抑制功能。通過這種機制，circRNAs可以調(diào)節(jié)銀屑病中Tregs功能受損[22-24]。

5.3 激活信號通路的銀屑病相關環(huán)狀RNA

circRNAs主要通過與miRNA結(jié)合參與miRNA的吸附，從而解除miRNA靶向抑制，導致靶基因上調(diào)。此外，我們根據(jù)起源于銀屑病相關MAP3K4的染色體位點鑒定了上調(diào)的circRNA。上調(diào)的circRNA可能通過結(jié)合相關的miRNAs來促進MAP3K4的靶向表達。MAPK信號通路調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、對環(huán)境應激的適應、炎癥反應和其他重要的細胞生理/病理過程以及銀屑病的發(fā)病機制。先前的研究報道銀屑病皮損表皮中的整合素上調(diào)并誘導多種MAPK通路，導致細胞因子和生長因子的異常產(chǎn)生。因此，我們推測circRNA可能參與了MAPK相關銀屑病的發(fā)病機制[25]。

6 小結(jié)

環(huán)狀RNA從一開始被人看做異常剪切后錯誤拼接的副產(chǎn)物，到今日成為很多醫(yī)學疾病領域研究的熱點，尤其是在皮膚病中發(fā)揮了重大的作用并引起了相關研究人員的關注。目前的研究存在嚴重的趨同現(xiàn)象，大部分的功能機制聚焦在競爭性結(jié)合miRNA模型，大部分的功能機制圍繞細胞增殖，遷移侵襲，細胞凋亡，細胞周期等非常宏觀的表型。circRNA的生理病理功能和機制依然沒有非常深入的了解。環(huán)狀RNA表達水平與臨床病理參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)其表達水平可與性別、皮損程度、疾病分期等相關。但是這些推測仍然需要在更多的研究中得到證實。研究環(huán)狀RNA更重要的目的是為了早診斷，早治療。

目前針對銀屑病的治療主要包含口服、外用及生物制劑治療。銀屑病最讓人困擾的問題就是容易受環(huán)境、季節(jié)、飲食、感染、外傷等因素的影響，從而導致病情的復發(fā)或加重，而且銀屑病患者的生活質(zhì)量以及身心健康很容易受到影響，臨床上發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有很多患者已經(jīng)患有抑郁癥。部分患者因為自卑、歧視、異樣眼光等原因，很少參與社交活動。所以尋求治療銀屑病的新方式也是重中之重。目前已經(jīng)有一些環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)研究者發(fā)現(xiàn)可以預測銀屑病復發(fā)，從而改善耐藥性。但是環(huán)狀RNA的研究還是處于初步階段中，要想運用到臨床中，仍需要大量的實驗、時間來進行驗證。

7 展望

環(huán)狀RNA的發(fā)現(xiàn)讓很多臨床醫(yī)生、研究者、和銀屑病患者重新燃起了希望，為銀屑病的臨床治療提供了新的思路和視角。雖然現(xiàn)在對環(huán)狀RNA的研究還不夠徹底，隨著科技的快速發(fā)展以及科學家的不懈努力，在不久的將來環(huán)狀RNA這團迷霧最終會被撥開，未來可期。