ROCK蛋白及其抑制劑與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展

馮智，張小博，惠慧

(中國(guó)藥科大學(xué)玄武門校區(qū)，江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

0 引言

Rho小G蛋白屬于Ras超家族中的一員，具有GTP酶活性，它的分子開關(guān)作用，是通過在活化態(tài)(結(jié)合GTP)和非活化態(tài)(結(jié)合GDP)之間轉(zhuǎn)換來實(shí)現(xiàn)的，在細(xì)胞內(nèi)是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。Rho蛋白通過結(jié)合其下游靶效應(yīng)分子，進(jìn)而產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，其中最重要的效應(yīng)分子之一是Rho相關(guān)蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing kinases,ROCK)，其屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分子量約為160 kD。ROCK具有許多功能，其中包括調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮，遷移，粘附和增殖。藥理研究發(fā)現(xiàn)，諸如多發(fā)性硬化癥[1]，炎癥性疾病[2]，心肌缺血[3]，高血壓[4]等各種疾病的發(fā)生與ROCK有關(guān)。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，ROCK蛋白的異常表達(dá)與腫瘤有著密切的聯(lián)系。本文主要論述了ROCK蛋白及其抑制劑在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起作用的研究進(jìn)展，以期為新的藥物相關(guān)治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供線索。

1 ROCK蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其活性調(diào)節(jié)

自上世紀(jì)90年代后半葉發(fā)現(xiàn)[5]以來，ROCK逐漸成為功能研究最詳細(xì)的Rho下游靶效應(yīng)分子，其在細(xì)胞內(nèi)存在有兩種在同源性上相似度較高的異構(gòu)體，即ROCK1(ROKβ或p160 ROCK)與ROCK2(ROKα)。ROCK遍布全身，相比之下，ROCK1在肝，肺，脾和睪丸等非神經(jīng)組織中富集，而ROCK2在腦，心臟和肌肉等組織中中則呈現(xiàn)更高的表達(dá)量[6]。下面分別論述二者的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其活性調(diào)節(jié)。

1.1 ROCK蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

在人類中，ROCK1和ROCK2都包含33個(gè)外顯子，二者分別位于18號(hào)染色體(18q11.1)和2號(hào)染色體(2p24)上。ROCK1開放閱讀框編碼1354個(gè)氨基酸，而ROCK2編碼1388個(gè)氨基酸。ROCK1和ROCK2在它們的一級(jí)氨基酸序列中具有64%的同一性，并且在激酶域中具有高度相似性(共有92%)[7]。ROCK氨基酸序列由一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域(RBD)(氨基末端)，一個(gè)卷曲螺旋區(qū)域，一個(gè)PH結(jié)構(gòu)域(PHD)和一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)(羧基末端)組成，其中Rho結(jié)合域(RBD)在螺旋結(jié)構(gòu)域中。

1.2 ROCK蛋白的活性調(diào)節(jié)

盡管ROCK1和ROCK2具有高度相關(guān)的功能結(jié)構(gòu)域和顯著的氨基酸同一性，但它們可以通過相同的常見方式以及ROCK1或ROCK2獨(dú)有的機(jī)制來進(jìn)行活性的調(diào)節(jié)。

首先，一方面無論是ROCK1或ROCK2，它們的羧基末端區(qū)域都起自抑制區(qū)的作用。當(dāng)該部分的缺失后，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)和體外激酶活性的激活[8]。抑制的發(fā)生可能是因?yàn)榧っ赣虻幕钚晕稽c(diǎn)被相互作用所阻斷[9]。Ras超家族包括Rho-GTPase蛋白R(shí)hoA和RhoC，它們是最典型的ROCK調(diào)節(jié)劑。據(jù)報(bào)道，Rho蛋白結(jié)合GTP被激活后，再與RBD的相互作用可通過誘導(dǎo)構(gòu)象變化來破壞激酶結(jié)構(gòu)域與自抑制羧基末端區(qū)域之間的負(fù)調(diào)節(jié)相互作用，從而提高激酶的活性。雖然Rho蛋白通常激活ROCK，但其他GTP結(jié)合蛋白已被發(fā)現(xiàn)負(fù)調(diào)控ROCK信號(hào)。在RBD附近的卷曲區(qū)，Gem與ROCK1相互作用，從而抑制MLC的磷酸化和MLC磷酸酶的MYPT1亞基[10]。另一種小的GTP結(jié)合蛋白R(shí)ad1也被報(bào)道模擬Gem通過阻斷ROCK2來抑制肌球蛋白的收縮性，導(dǎo)致細(xì)胞突起的減少。

其次，另一方面ROCK1和ROCK2則會(huì)通過各自獨(dú)有的機(jī)制來進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，在細(xì)胞凋亡的情況下，ROCK1通過半胱天冬酶的裂解和去除自抑制域而被激活[11]，而ROCK2則可能被顆粒酶B(Granzymes B)介導(dǎo)的裂解激活，這也導(dǎo)致了胱天蛋白酶的激活[12]。這兩個(gè)事件均導(dǎo)致不依賴Rho的組成型活性激酶片段的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白的收縮不受約束，進(jìn)而導(dǎo)致膜起泡，凋亡小體形成以及核材料包裝成小泡和凋亡小體[13]。在負(fù)調(diào)控方面，磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(Phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK1)與RhoE類似的ROCK1區(qū)域競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，從而對(duì)抗RhoE對(duì)ROCK1的負(fù)調(diào)控[14]；而通過與PH結(jié)構(gòu)域的直接結(jié)合，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白1B(Coroninactin binding protein 1B，CORO1B)則會(huì)對(duì)ROCK2信號(hào)通路進(jìn)行抑制[15]。

2 ROCK蛋白與腫瘤的關(guān)系

ROCK是癌癥進(jìn)展過程中的關(guān)鍵角色。ROCK及其下游靶點(diǎn)主要參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，因此負(fù)責(zé)細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)。此外，它們還與多種生物學(xué)過程有關(guān)，例如細(xì)胞連接完整性，細(xì)胞周期控制和細(xì)胞凋亡。它們?cè)诎┌Y進(jìn)展各種過程中的作用，例如腫瘤細(xì)胞存活與凋亡[16]，侵襲轉(zhuǎn)移[17]，以及血管增生[18]等都已得到證明。盡管通常認(rèn)為ROCK激活是致癌的，但一些研究表明ROCK在癌癥進(jìn)展中起負(fù)調(diào)控作用。因此，ROCK在不同類型癌癥過程中的確切作用，具體取決于細(xì)胞類型和腫瘤周圍的微環(huán)境。

2.1 ROCK蛋白在腫瘤細(xì)胞存活和凋亡中的作用

ROCK在腫瘤細(xì)胞存活和凋亡中有時(shí)會(huì)呈現(xiàn)出不一樣的作用。研究表明，在一些類型的腫瘤細(xì)胞中，ROCK蛋白表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活的效應(yīng)，即ROCK受到激活可增加細(xì)胞活力，ROCK受到抑制可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ming-KeQiu[19]等通過對(duì)嬰兒期發(fā)生的血管瘤(HA)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與增殖期HA相比，ROCK和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的蛋白質(zhì)與mRNA積累會(huì)顯著更高。增殖期HA中細(xì)胞凋亡指數(shù)低，而漸入期HA中細(xì)胞凋亡指數(shù)增加。用ROCK抑制劑Y-27632處理后發(fā)現(xiàn)，Y-27632誘導(dǎo)HA細(xì)胞中p53表達(dá)并下調(diào)VEGF表達(dá)，顯著地抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

相比之下，其他研究表明，ROCK的抑制作用可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活和化學(xué)抗藥性，或降低抗癌劑的凋亡作用。這是因?yàn)?，ROCK有助于肌球蛋白輕鏈的磷酸化，肌球蛋白ATPase活性和肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白絲與質(zhì)膜的偶聯(lián)，在細(xì)胞凋亡過程中被裂解以產(chǎn)生截短的活性形式。ROCK蛋白的活性對(duì)于形成膜泡以及將片段化的DNA重新定位到膜泡和凋亡小體中都是必需的和足夠的。例如，Hong Zhou[20]等通過對(duì)高葡萄糖(HG)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激過程進(jìn)行研究，證明了RhoA / ROCK通路通過氧化應(yīng)激以及p38MAPK和JNK在新生大鼠中的活化介導(dǎo)HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。而使用ROCK的抑制劑法舒地爾通過減輕氧化應(yīng)激以及調(diào)節(jié)Bax /Bcl-2表達(dá)并抑制caspase-3裂解的p38MAPK和JNK途徑來防止HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

從這些研究可以得出的結(jié)論是，ROCK對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡或抗凋亡作用取決于具體的細(xì)胞固有特性和外部條件。

2.2 ROCK蛋白在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用

腫瘤細(xì)胞的侵襲是轉(zhuǎn)移的標(biāo)志，這是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及細(xì)胞骨架重組，片狀脂蛋白形成，膜起皺和細(xì)胞形態(tài)變化。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)在細(xì)胞遷移中起重要作用，ROCK信號(hào)傳導(dǎo)是肌動(dòng)蛋白重組的主要調(diào)節(jié)因子，因?yàn)楦鞣N細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白都是ROCK的底物。這些調(diào)節(jié)蛋白包括含有LIM結(jié)構(gòu)域激酶(LIM domain kinase，LIMK)，肌球蛋白輕鏈(Myosin Light Chain，MLC)和MLC磷酸酶。ROCK活化的LIMK使纖溶蛋白(Cofilin)磷酸化并使其肌動(dòng)蛋白解聚活性失活，從而導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白絲的穩(wěn)定性[21]。另一方面，ROCK通過MLC磷酸酶的磷酸化和失活或MLC的直接磷酸化來促進(jìn)MLC的磷酸化，從而導(dǎo)致肌球蛋白活化和肌動(dòng)蛋白驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生收縮力[22]。

大多數(shù)研究都贊成ROCK激活通過對(duì)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的直接影響，或?qū)Π┌Y相關(guān)的成纖維細(xì)胞的間接作用來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而增加細(xì)胞外基質(zhì)的硬度并促進(jìn)癌細(xì)胞的移動(dòng)。例如在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的小鼠模型中，ROCK通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白的收縮和調(diào)節(jié)c-Myc途徑，增加了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，促進(jìn)了侵襲和轉(zhuǎn)移[23]。作為一種高度浸潤(rùn)性的癌癥，晚期卵巢癌的不良預(yù)后來自人類卵巢癌細(xì)胞侵襲性的增強(qiáng)。而在這其中，溶血磷脂酸(LPA)/ Rho /ROCK通路與卵巢癌的發(fā)展過程密切相關(guān)，當(dāng)ROCK受到抑制時(shí)，會(huì)顯著降低LPA誘導(dǎo)的人卵巢癌細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而減弱了人卵巢癌細(xì)胞的侵襲性[24]。

2.3 ROCK蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞增殖與血管生成中的作用

與在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的活性相似，大多數(shù)研究都表明ROCK能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和血管生成而在腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮積極作用。這主要是通過影響VEGF介導(dǎo)血管生成、靜脈通透性和新生血管[25]等重要作用來實(shí)現(xiàn)的。

大量報(bào)道表明，ROCK抑制作用會(huì)降低腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成[26]。例如，通過在促進(jìn)應(yīng)激纖維形成方面的公認(rèn)作用，ROCK促進(jìn)了纖連蛋白基質(zhì)的組裝，細(xì)胞粘附以及轉(zhuǎn)移性腎腫瘤細(xì)胞的增殖[27]。在肺癌中，使用法舒地爾進(jìn)行治療會(huì)抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[28]。由于它通過引起應(yīng)力纖維斷裂而抑制了肺癌條件下的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和體內(nèi)侵襲能力，因此它也顯著減弱了血管生成[29]。此外，ROCK抑制作用還可以通過阻止癌基因的激活來減少腫瘤細(xì)胞的增殖。ROCK在T58和/或S62處使癌基因c-Myc磷酸化，從而確保c-Myc在乳腺癌[30]和前列腺癌[31]中具有更高的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性；因此，ROCK的抑制降低了c-Myc活性。

相反，在其他研究中，還發(fā)現(xiàn)ROCK抑制作用可增加細(xì)胞增殖。例如，在結(jié)腸癌[32]和胰腺癌細(xì)胞[33]中，用Y-27632處理可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。這些研究表明，ROCK負(fù)調(diào)節(jié)EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，而EGF首先刺激EGF受體的激活并隨后增加癌細(xì)胞的增殖，EGF同時(shí)誘導(dǎo)ROCK的激活，然后關(guān)閉ROCK。通過負(fù)反饋系統(tǒng)激活EGF受體途徑。因此，用Y-27632抑制ROCK可以防止負(fù)反饋，從而導(dǎo)致EGF活性增加和細(xì)胞增殖。此外，據(jù)報(bào)道，ROCK抑制通過下調(diào)抑癌基因，磷脂酶和張力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog，PTEN)來促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致Akt磷酸化上調(diào)，這對(duì)于細(xì)胞增殖和存活至關(guān)重要[34]。

綜上所述，ROCK通過促進(jìn)肌動(dòng)球蛋白細(xì)胞骨架的收縮性以及細(xì)胞粘附，胞質(zhì)分裂和癌基因的激活，在許多細(xì)胞類型的癌細(xì)胞增殖中具有普遍的積極作用。盡管在特殊情況下，通過對(duì)生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)(例如EGF)和促進(jìn)腫瘤抑制基因激活(例如PTEN)的負(fù)面反饋，存在一些例外情況。

3 ROCK抑制劑與腫瘤的關(guān)系

3.1 ROCK抑制劑的分類及應(yīng)用

現(xiàn)已研究的ROCK抑制劑按其所發(fā)揮作用的靶標(biāo)主要可以分為兩大類：針對(duì)所有ROCK非選擇性抑制劑,以及只對(duì)一種或幾種ROCK同工型的選擇性抑制劑。而它們的共同點(diǎn)則幾乎都是ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，主要代表有Y27632、法舒地爾、羥基法舒地爾和H-1152P。目前通過針對(duì)這四種抑制劑及對(duì)ROCK1配合物晶體結(jié)構(gòu)的解析來開發(fā)高度選擇性和更有效的抑制劑。

最近也有越來越多新的高效選擇性抑制劑被報(bào)道，例如主要針對(duì)ROCK1的抑制劑MBPTA，是一種苯并呋喃衍生物，在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中顯示出神經(jīng)保護(hù)作用[35]。而另一種主要針對(duì)ROCK2的抑制劑Compound 24在人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3中，可以通過激活外源性死亡受體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[36]。隨著研究的深入，新型ROCK抑制劑已逐漸用于研究非癌性疾病的治療。同樣是主要針對(duì)ROCK2的抑制劑，KD025(以前稱為SLx-2119)通過ROCK2依賴性機(jī)制部分抑制3T3-L1細(xì)胞的脂肪生成，除脂肪生成因子FABP4和Glut4外，KD025下調(diào)了脂肪形成過程中關(guān)鍵的脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C /EBPα的表達(dá)，因此KD025有望成為抗脂肪形成或肥胖癥藥物[37]。在其他的研究報(bào)道中，作為ROCK的抑制劑，DL0805及其衍生物在缺氧的條件下對(duì)肺動(dòng)脈血管細(xì)胞，包括人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HPAEC)和人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HPASMC)具有保護(hù)作用[38]。

3.2 RCOK抑制劑與其他抗癌療法的聯(lián)用

隨著研究的深入，除了以往的單獨(dú)使用ROCK抑制劑來治療癌癥，越來越的研究開始探討將ROCK抑制劑與其他抗癌療法聯(lián)用的效果。最近的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，在人類非典型慢性粒細(xì)胞白血病(aCML)細(xì)胞中，Y27632和法舒地爾增加了酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼的抗增殖和促凋亡作用[39]。同樣的，ROCK抑制劑與MEK或ERK抑制劑可以聯(lián)合用于NRAS突變性黑色素瘤的治療。當(dāng)將ROCK抑制劑添加MEK抑制劑中來進(jìn)行治療時(shí)，可以使得MEK抑制劑的劑量顯著降低。這有利于減緩MEK抑制劑所存在的嚴(yán)重劑量依賴的靶點(diǎn)毒性，避免了MEK抑制劑迫使黑素瘤患者停止治療或降低劑量[40]。

但是，在某些情況下，將ROCK抑制與化學(xué)治療劑聯(lián)合使用可能導(dǎo)致增強(qiáng)的腫瘤化學(xué)耐藥性。例如，Y27632在成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中對(duì)ROCK的抑制作用導(dǎo)致順鉑細(xì)胞毒性后腫瘤存活率提高[41]。因此，在開發(fā)聯(lián)用ROCK抑制劑的新型抗癌療法時(shí)，應(yīng)考慮并應(yīng)排除ROCK抑制劑可能的有害作用。

4 總結(jié)與展望

ROCK蛋白對(duì)許多細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)具有主要影響，從而有助于實(shí)現(xiàn)廣泛的細(xì)胞功能。近年來越來越多的證據(jù)表明，ROCK信號(hào)至少在許多重要的癌癥相關(guān)表型中起著至關(guān)重要的作用。靶向ROCK信號(hào)的研究越來越體現(xiàn)在癌癥治療中，特別是在抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，腫瘤生長(zhǎng)，血管生成，與癌癥相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)改變和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中。盡管ROCK抑制劑法舒地爾已經(jīng)在臨床上應(yīng)用了20年，但目前尚未用于癌癥治療，并且涉及人類癌癥的臨床試驗(yàn)數(shù)量仍然有限。

將逐漸發(fā)現(xiàn)的ROCK信號(hào)通路新的作用轉(zhuǎn)化為抗癌治療的效果，仍存在許多挑戰(zhàn)。當(dāng)前有關(guān)ROCK信號(hào)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起作用的信息尚不完善，尤其是ROCK在調(diào)節(jié)包括原發(fā)性腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，包括它們的遷移、增殖、凋亡、存活等方面的促進(jìn)或抑制作用的機(jī)制仍然不清楚。然而，逐漸為人們所知的是，ROCK下游信號(hào)傳導(dǎo)可能在很大程度上取決于腫瘤細(xì)胞的類型和微環(huán)境。最近已經(jīng)開發(fā)出了更多的有效和選擇性的ROCK抑制劑，其中一些可能在不久的將來在癌癥治療中顯示出廣闊的前景。同時(shí)值得注意的是，不少ROCK抑制劑與其他抗癌藥的聯(lián)合治療產(chǎn)生了更顯著的抗癌作用，并且降低了對(duì)單一藥劑的耐藥性。我們還需要更深入地研究癌癥的發(fā)病機(jī)制，以及ROCK1及其抑制劑與腫瘤的關(guān)系，以期為癌癥的治療提供更多可行的辦法。