銀杏葉黃酮主要組分及其配比的抗氧化性作用

曹永富 李廣云 趙丹 郁萬文

摘要： ?對槲皮素、山奈酚、異鼠李素3種銀杏黃酮主要組分及其復(fù)配溶液抗氧化能力的研究結(jié)果表明：（1）槲皮素、山奈酚、異鼠李素可有效清除DPPH自由基，具有相當(dāng)?shù)目傔€原力，且隨著濃度的增加而增加，具有劑量效應(yīng);清除DPPH自由基能力、總還原力均為槲皮素>山奈酚>異鼠李素。（2）3個主要組分的配比顯著影響了復(fù)配液的總還原力，T7（3：1：3）和T4（2：1：2）是2個較好的復(fù)配處理。（3）槲皮素、異鼠李素配伍具有提高清除DPPH自由基清除能力的作用，槲皮素與山奈酚、山奈酚與異鼠李素配伍均降低清除DPPH自由基清除能力;槲皮素、異鼠李素配伍具有削弱總還原力的作用，而槲皮素與山奈酚、山奈酚與異鼠李素配施提高總還原力。

關(guān)鍵詞： ?銀杏黃酮; ?主要組分; ?復(fù)配; ?抗氧化性

中圖分類號： ? S 792. 95 ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： ? A ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1001 - 9499（2021）04 - 0010 - 05

銀杏葉中的黃酮類化合物具有高效的抗氧化性，早已被人們所重視并加以利用。黃酮類化合物的抗氧化能力與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因其本身結(jié)構(gòu)的不同，抗氧化能力的大小也各不相同[ 1 - 3 ]。有關(guān)文獻(xiàn)報道，銀杏葉中的黃酮甙類化合物清除超氧陰離子（O·-）能力由大到小的順序為槲皮素、楊梅樹皮素、蘆丁、槲皮甙[ 4 ， 5 ];各銀杏黃酮苷元組分（槲皮素、山柰酚、異鼠李素）均具有清除自由基能力，黃酮與內(nèi)酯合用可以增強清除DPPH自由基的能力[ 6 ];在紫外線氧化體系中，銀杏葉中的黃酮甙類化合物同樣表現(xiàn)出較強的抗氧化能力，且抗氧化能力存在差異，其中槲皮素甙類表現(xiàn)出最好的抗氧化效果[ 4 ]。從眾多的銀杏葉中黃酮化合物中篩選并分離出抗氧化效果最好的組分，對于銀杏葉開發(fā)制藥有著重要意義。已知在銀杏葉所含的黃酮甙中，主要是山奈酚甙、異鼠李素甙、槲皮素甙，三者之間是否存在一個抗氧化能力最佳的復(fù)配比例？ 基于上述設(shè)想，將山奈酚、異鼠李素、槲皮素純品進(jìn)行復(fù)配，研究不同組分及其復(fù)配物的抗氧化能力差異，篩選出最佳的組分及其復(fù)配比例及劑量，為高抗氧化銀杏種質(zhì)的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1. 1 試驗材料

銀杏葉中3種黃酮組分——槲皮素、山奈酚、異鼠李素購置于上海源葉生物科技有限公司，均為分析標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98%。

1. 2 主要組分溶液的制備方法

稱取槲皮素甙、異鼠李素甙各5 mg，置于200 mL無水乙醇中，充分溶解后，得到25 mg·L-1的槲皮素、異鼠李素母液;稱取山奈酚甙7 mg，置于200 mL無水乙醇中，充分溶解后，得到35 mg·L-1的山奈酚母液。再將槲皮素、異鼠李素母液用無水乙醇稀釋成10.0、7.5、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05 mg·L-1的系列溶液;將山奈酚母液用無水乙醇溶液稀釋成7、4.2、1.4、0.7、0.42、0.28、0.14、0.07、0.028 mg·L-1的系列溶液，無水乙醇作為對照CK，置于4 ℃冰箱中待用。

1. 3 復(fù)配溶液的制備方法

按照銀杏主要組分復(fù)配比例及其在復(fù)配液中的濃度（表1）中的比例，吸取槲皮素、異鼠李素和山奈酚母液進(jìn)行復(fù)配，分別記作T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9，置于4 ℃冰箱中待用。

1. 4 測定指標(biāo)與方法

1. 4. 1 總還原力

參考現(xiàn)有的方法[ 7 ]，略有改動。吸取0.3 mL提取液于10 mL試管中，然后加入3 mL FRAP工作液。工作液成分為300 mmol·L-1的pH3.6的醋酸鹽緩沖液（3.1 g醋酸鈉+16 mL冰醋酸，并用蒸餾水定容至1 000 mL）25 mL，10 mmol·L-1的TPTZ溶液（用40 mmol·L-1鹽酸配制）2.5 mL，20 mmol·L-1的FeCl3·6H2O 2.5 mL，混合而成，現(xiàn)配現(xiàn)用。充分混勻后，37 ℃水浴避光10 min，在593 nm處測定吸光值。以甲醇替代樣品作為空白，每個樣品重復(fù)3次。以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)物，配成不同濃度的FeSO4溶液，采用同樣的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算總還原力。以不同F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制曲線，曲線方程：y=1.094 2x+0.072 7，R2=9 998。樣品測定的吸光值得到的吸光值代入曲線方程，解得的x值即為樣品總還原力，即以達(dá)到同樣的抗氧化能力時，所需的FeSO4·7H2O物質(zhì)的量。

1. 4. 2 黃酮對DPPH自由基的清除作用

參考現(xiàn)有方法[ 8 ]，吸取0.2 mL銀杏葉提取液與4 mL DPPH-乙醇溶液（40 mg·L-1）于10 mL比色管，充分混勻，室溫避光靜置30 min后，于517 nm下測定吸光值A(chǔ)樣品。為去除提取液底色的影響，以等量無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液測定吸光值A(chǔ)對照，以等量無水乙醇代替提取液測定吸光值A(chǔ)空白。每個樣品重復(fù)3次。計算清除率，公式為：

DPPH·清除率（%）=1-[（A樣品-A對照）÷A空白]×100%。

1. 5 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2016和DPS7.04統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析，運用Turky法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同濃度銀杏葉黃酮主要組分溶液對總還原力的影響

由圖1～圖3可知，銀杏葉黃酮主要組分槲皮素、山奈酚和異鼠李素的總還原力存在明顯的劑量效應(yīng)，即隨著濃度的升高呈線性增長趨勢。根據(jù)相應(yīng)的線性方程y=ax+b的a值大小可知，總還原力由高到低的順序為槲皮素（0.021 3）、山奈酚（0.010 5）、異鼠李素（0.006）。

2. 2 不同濃度銀杏葉黃酮主要組分溶液對DPPH自由基清除率的影響

由圖4～圖6可知，銀杏葉黃酮主要組分槲皮素、山奈酚和異鼠李素清除DPPH自由基的能力存在顯著的劑量效應(yīng)，即隨著濃度的升高呈增長趨勢，其中槲皮素在高濃度下表現(xiàn)出飽和效應(yīng)，即當(dāng)槲皮素濃度超過7.5 mg·L-1后，槲皮素清除效果增長變緩。根據(jù)相應(yīng)的線性方程y=ax+b的a值大小可知，清除DPPH自由基能力由高到低的順序為槲皮素（0.106 8）、山奈酚（0.074 6）、異鼠李素（0.024 8）。

2. 3 不同比例的復(fù)配溶液對總還原力的影響

方差分析和多重比較結(jié)果表明，不同配比的總還原力間存在極顯著性差異（p<0.01），表明3個主要組分的配比顯著影響了復(fù)配液的總還原力（圖7）。所有配比的總還原力由高到低的順序為T7、T4、T8、T9、T5、T1、T6、T2、T3。其中，T7的總還原力僅與T4和T8處理不顯著，顯著高于其他6個處理，而T2、T3和T6三個處理的總還原力最差。

將9個處理的總還原力及主要組分配比濃度進(jìn)行非線性回歸分析，求得槲皮素X1、山奈酚X2、異鼠李素X3濃度與總還原力，數(shù)學(xué)模型為：Y還原力= ?5 361.549-299.152X1+3.388X12 -628.802X2+13.588X22 -8.577X32+ 21.448X1X2 -5.193X1X3+12.899X2X3。對方程及其回歸系數(shù)的顯著性檢驗表明方程F檢驗極顯著（p<0.01），擬合程度高;回歸系數(shù)檢驗表明，常數(shù)項及二次項、一次性X1、X2的偏回歸系數(shù)均達(dá)顯著水平（p<0.05）。根據(jù)方程的一次項回歸系數(shù)可知，在復(fù)配液中X1、X2對總還原力的影響均為負(fù)效應(yīng)，且X2>X1，而X3的作用可忽略;二次項中X1、X2、X3的偏回歸系數(shù)分別為3.388、13.588和-8.577，表明X1、X2起正作用，且X2>X1，而X3起負(fù)作用。交互項中X1X2、X2X3的偏回歸系數(shù)大于0，為正向交互作用;X1X3的偏回歸系數(shù)小于0，為負(fù)向交互作用，表明X1X3配伍具有削弱總還原力的作用，而X1X2、X2X3配施提高了總還原力。

2. 4 不同比例的復(fù)配溶液對清除DPPH自由基能力的影響

方差分析和多重比較結(jié)果表明，不同配比處理清除DPPH自由基能力間存在極顯著性差異（p<0.01），表明3個主要組分的配比顯著影響了復(fù)配液的清除DPPH自由基能力（圖8）。所有配比的清除DPPH自由基能力由高到低的順序為T7、T4、T1、T5、T2、T6、T3、T9、T8。其中，T7的DPPH自由基清除率極顯著高于其他8個處理，其次為T4、T1、T5，最差的是T8。

將9個處理的清除DPPH自由基能力及主要組分配比濃度進(jìn)行非線性回歸分析，求得槲皮素X1、山奈酚X2、異鼠李素X3濃度與DPPH自由基清除率，數(shù)學(xué)模型為：YDPPH= -3 106.669+108.414X1+ ?0.635X12+410.813X2-9.200X22+4.971X32-12.429X1X2+

5.609X1X3-9.332X2X3?；貧w系數(shù)檢驗表明，常數(shù)項及二次項、一次性X1、X2的偏回歸系數(shù)均達(dá)顯著水平（P<0.05）。根據(jù)方程的一次項回歸系數(shù)可知，X1、X2對清除DPPH自由基能力的影響均為正效應(yīng)，且X2>X1，而X3不起作用。二次項中X1、X2、X3的偏回歸系數(shù)分別為0.635、-9.200、4.971，表明X1、X3起正作用，且X3>X1，而X2起負(fù)作用。交互項中X1X2、X2X3的偏回歸系數(shù)小于0，為負(fù)向交互作用;X1X3的偏回歸系數(shù)大于0，為正向交互作用，表明X1X3配伍具有提高清除DPPH自由基能力的作用，而X1X2、X2X3配施降低清除DPPH自由基能力。

3 結(jié)論與討論

3. 1 槲皮素、山奈酚、異鼠李素可有效地清除DPPH自由基，具有相當(dāng)?shù)目傔€原力，且隨著濃度的增加而增加，具有劑量效應(yīng);清除DPPH自由基能力、總還原力均為槲皮素>山奈酚>異鼠李素，這與張英等[ 3 ]、宋唯唯等[ 9 ]、劉娜[ 6 ]的研究結(jié)果一致。研究中，除了找到槲皮素清除DPPH自由基能力的劑量外，山奈酚、異鼠李素清除DPPH自由基能力及三者的總還原力均未能找出飽和劑量，后期將進(jìn)一步研究。

3. 2 銀杏葉黃酮主要組分配伍的抗氧化作用研究表明，總還原力和DPPH自由基清除率在不同復(fù)配處理間存在極顯著差異，說明3個主要組分的配比顯著影響了復(fù)配液的總還原力。其中，T7和T4是兩個較好的復(fù)配處理，值得注意的是T8和T9的總還原力較高，但其DPPH自由基清除率卻較低，相關(guān)原因有待進(jìn)一步深入研究。

3. 3 T1處理的槲皮素、山奈酚、異鼠李素比值為1∶1∶1，銀杏黃酮的抗氧化性適中，而T2處理保持槲皮素含量不變，同時增加等量異鼠李素和山奈酚含量，黃酮溶液的抗氧化效果較T1處理卻有所下降;T3處理中，進(jìn)一步增加等量異鼠李素和山奈酚，保持槲皮素含量不變，使得T3處理液中，槲皮素得濃度最低，而黃酮的抗氧化性較T2也有所下降。在T4、T7處理中，槲皮素含量提高，增加了槲皮素濃度，這兩組黃酮處理液的抗氧化性最好。以上數(shù)據(jù)表明，在3種銀杏黃酮類化合物中，槲皮素濃度越高，黃酮的抗氧化性越好。比較T5、T6處理，槲皮素濃度保持不變，T5的山奈酚濃度較高，異鼠李素濃度較低;T6的山奈酚濃度較低，異鼠李素濃度較高，最終T5處理的抗氧化性好于T6。比較T7、T8處理液，T7的山奈酚濃度高，異鼠李素濃度低;T8的山奈酚濃度較低，異鼠李素濃度高，T7處理抗氧化性明顯好于T8。比較T8、T9處理中，T9的異鼠李素濃度和山奈酚濃度均高于T8，但其濃度均不高于槲皮素濃度，且山奈酚和異鼠李素濃度相差不多，T8、T9處理液的抗氧化性差別并不明顯。因此，可認(rèn)為T8、T9發(fā)揮主要抗氧化性作用的是槲皮素。比較T5、T6處理液以及T7、T8處理液，槲皮素含量保持不變，山奈酚濃度高的抗氧化性要優(yōu)于異鼠李素濃度高的，因此認(rèn)為山奈酚濃度對抗氧化性的影響略高于異鼠李素濃度對抗氧化性的影響，而槲皮素的濃度對抗氧化性的影響明顯高于山奈酚以及異鼠李素，這與單一組分抗氧化性能力槲皮素>山奈酚>異鼠李素的結(jié)論一致[1 - 4 ， 6 ， 9 ]。而在9個復(fù)配處理中，T7的兩個指標(biāo)抗氧化均較高，因此認(rèn)為T7處理的槲皮素、異鼠李素、山奈酚三者的比例（3∶1∶3）最佳。在生產(chǎn)實踐中，可以選擇銀杏葉中三者組分含量比值為3∶1∶3的種質(zhì)資源，其次是2∶1∶2（T4），具有進(jìn)一步區(qū)試或推廣。

3. 4 基于復(fù)配溶液抗氧化能力的非線性回歸分析表明，槲皮素、異鼠李素配伍具有提高清除DPPH自由基清除能力的作用，而槲皮素與山奈酚、山奈酚與異鼠李素配伍均降低清除DPPH自由基清除能力;槲皮素、異鼠李素配伍具有削弱總還原力的作用，而槲皮素與山奈酚、山奈酚與異鼠李素配施提高總還原力。在復(fù)配研究中僅考慮了三者間的配比，未考慮兩兩之間的配比，同時缺少與單一組分同劑量的比較分析，需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳琪， ?王伯初， ?唐春紅， ?等. ?黃酮類化合物抗氧化性與其構(gòu)效的關(guān)系[J]. ?重慶大學(xué)學(xué)報： ?自然科學(xué)版， ?2003， 26（11）： 48 - 51.

[2] 呂娜. ?黃酮類化合物的抗氧化性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系[J]. 現(xiàn)代養(yǎng)生， 2014（22）： 31 - 31.

[3] 張英， ?吳曉琴， ?丁宵霖. ?黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與清除活性氧自由基效能關(guān)系的研究[J]. ?天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 1997， 10（4）： 26 - 33.

[4] 李艷， ?徐譽泰， ?張可煒， ?等. ?銀杏葉黃酮組分的分離及抗氧化作用的研究[J]. ?山東大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， ?1999（4）： 473 - 478.

[5] 劉爽， ?宋毅， ?李駿， ?等. ?槲皮素生物學(xué)作用機制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2009， 36（15）： 2 837 - 2 839.

[6] 劉娜， ?康倩， ?李輝， ?等. ?DPPH 法測定銀杏葉提取物各有效成分單體及不同比例配伍清除自由基能力[J]. “好醫(yī)生杯” 中藥制劑創(chuàng)新與發(fā)展論壇論文集（下）， 2013， 823 - 828.

[7] 姚鑫. ?不同來源銀杏葉資源化學(xué)研究[D]. ?南京： ?南京中醫(yī)藥大學(xué)， 2013.

[8] 黃海波， ?劉華春， ?金朱明， ?等. ?銀杏葉原花青素的制備及其抗氧化活性研究[J]. ?中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)， 2016， 3（6）： 686 - 690.

[9] 宋唯唯， ?劉芬芬， ?劉彩紅. ?銀杏葉提取物與其黃酮類物質(zhì)抗氧化作用的比較[J]. ?泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報， ?2016， 37（5）： 484 - 486.

第1作者簡介： ?曹永富（1978-）， ?男， ?高級工程師， ?主要研究方向為林業(yè)科研和技術(shù)推廣、 ?森林培育。

收稿日期： 2021 - 01 - ?25

（責(zé)任編輯： ? 王 巖）

Antioxidant Effects of Main Components of Ginkgo

Biloba Flavonoids and Their Proportions

CAO Yongfu

（Linyi Forest Wetland Protection Center， ?Shandong Linyi 276000）

Abstract The main results of the study on antioxidant ability of main components of quercetin， kaempferol， isorhamnetin and their complexe are as follows： （1）quercetin， kaempferol and isorhamnetin can effectively scavenge DPPH free radicals， and have a considerable total reducing power， and increase with the increase of concentration， with a dose effect; scavenging DPPH free radical energy The results showed that quercetin > kaempferol > isorhamnetin. （2）The ratio of the three main components significantly affected the total reducing power of the compound solution， among which T7 （3∶1∶3） and T4 （2∶1∶2） were two better combination treatments. （3）The combination of quercetin and isorhamnetin can improve the scavenging ability of DPPH free radical， while the combination of quercetin and kaempferol， kaempferol and isorhamnetin can reduce the scavenging ability of DPPH free radical; the combination of quercetin and isorhamnetin can weaken the total reducing power， while the combination of quercetin and kaempferol， kaempferol and isorhamnetin can increase the total reducing power.

Key words Ginkgo flavonoids; ?Main component; ?Complexe; ?Antioxidant activity