基于血清生物標(biāo)志物變化的蒙古扁桃石油醚提取物防治肝纖維疾病進(jìn)展動態(tài)研究

常 虹，白萬富，李 倩，劉全禮，孟洪宇，石松利*

? 藥理與臨床 ?

基于血清生物標(biāo)志物變化的蒙古扁桃石油醚提取物防治肝纖維疾病進(jìn)展動態(tài)研究

常 虹1，白萬富1，李 倩1，劉全禮1, 2，孟洪宇3*，石松利1, 2*

1. 內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060 2. 內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院 蒙藥藥效藥代安全性評價研究院士工作站，內(nèi)蒙古 包頭 014060 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700

應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)，探究蒙古扁桃石油醚提取物對肝纖維化病程中代謝輪廓及生物標(biāo)志物的影響，從代謝角度揭示其抗肝纖維化的作用機(jī)制。大鼠連續(xù)8周sc四氯化碳（CCl4）建立肝纖維化模型，同時ig蒙古扁桃石油醚提取物（1.75、1.25、0.75 g/kg）或水飛薊素（50 mg/kg）。采用超高效液相色譜與四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）聯(lián)用技術(shù)，分析各組大鼠給藥后第2、4、6、8周血清代謝表達(dá)譜的動態(tài)變化，比較不同時間的大鼠血清潛在生物標(biāo)志物含量變化，依據(jù)代謝通路分析構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。蒙古扁桃石油醚提取物可糾正CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化疾病發(fā)展各階段代謝譜，實(shí)驗(yàn)第2周時未見其對肝纖維化早期關(guān)鍵生物標(biāo)志物產(chǎn)生回調(diào)；中期（第4周）主要通過作用于膽固醇和鞘磷脂，減輕肝損傷，延緩肝纖維化形成；晚期（第8周）主要通過回調(diào)鞘氨醇、鞘磷脂、膽固醇等8個關(guān)鍵生物標(biāo)志物水平，參與鞘脂類、甘油磷脂代謝，初級膽汁酸生物合成，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成與降解，發(fā)揮抗纖維化作用；蒙古扁桃石油醚提取物中劑量（1.25 g/kg）對代謝譜回調(diào)趨勢更明顯，對差異代謝物及關(guān)鍵生物標(biāo)志物回調(diào)數(shù)量較多，抗肝纖維化效果較佳?；赨PLC-MS代謝組學(xué)技術(shù)從微觀代謝角度揭示了蒙古扁桃石油醚提取物可通過多靶點(diǎn)影響肝纖維化代謝物水平及其相關(guān)代謝通路，從而有效改善肝纖維化。

代謝組學(xué)；生物標(biāo)志物；肝纖維化；蒙古扁桃；石油醚提取物

肝纖維化是炎癥等刺激器官，實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生壞死、組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）異常增多和過度沉積的復(fù)雜動態(tài)可逆性病理過程[1]。中藥具有多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，在治療臟器纖維化方面有獨(dú)特優(yōu)勢。因此，挖掘天然有效藥物，對治療肝纖維化有重要意義。代謝組學(xué)技術(shù)在方法學(xué)上具有集融整性、動態(tài)、綜合、分析于一體的特點(diǎn)，與中醫(yī)藥整體觀相吻合，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥療效評價與機(jī)制研究[2-4]。

蒙古扁桃(Maxim.) Ricker蒙名為烏蘭-布衣勒斯，是蒙古高原特有的阿拉善荒漠種，屬薔薇科扁桃屬旱生落葉灌木[5]。蒙古扁桃作為民間傳統(tǒng)藥材，其種仁代替中藥“郁李仁”入藥，性平、味苦，能潤燥滑腸、止咳化痰、利尿，主治咽喉干燥、干咳、支氣管炎、陰虛便秘、水腫等癥[6-7]。課題組前期對蒙古扁桃化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，從其種仁中分離發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸、苦杏仁苷、有機(jī)酸、黃酮類、多糖類、生物堿類等多種成分[8-13]。蒙古扁桃石油醚提取物作為其有效組分被證實(shí)具有良好的調(diào)血脂、抗脂質(zhì)過氧化、改善肝腎纖維化作用[14-16]。由于肝纖維化的發(fā)生發(fā)展為動態(tài)進(jìn)展式病程，因此研究疾病不同階段的生物標(biāo)志物動態(tài)變化對藥物的藥效評價及機(jī)制研究具有重要意義。目前尚缺乏蒙古扁桃石油醚提取物對肝纖維疾病發(fā)展的動態(tài)研究，且其潛在作用機(jī)制不明。

課題組前期通過病理組織、氧化指標(biāo)、血清肝纖維化四項(xiàng)對蒙古扁桃石油醚提取物進(jìn)行了藥效學(xué)評價，并初步證實(shí)其具有抗肝纖維化作用[15]。本研究在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)，探究其對肝纖維化模型大鼠不同階段血清代謝譜、潛在生物標(biāo)志物的種類和含量的影響，進(jìn)一步從代謝角度揭示蒙古扁桃提取物抗肝纖維化的作用機(jī)制，為尋找抗肝纖維化的有效藥物提供科學(xué)依據(jù)，也為蒙古扁桃藥理作用的深入研究和中蒙藥資源的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 材料

1.1 藥物

蒙古扁桃藥材采自阿拉善雅布來戈壁，經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院石松利教授鑒定為薔薇科桃屬扁桃亞屬植物蒙古扁桃(Maxim.) Ricker的干燥成熟種子；水飛薊素膠囊（批號131102819，規(guī)格14 mg/粒）購自德國馬博士大藥廠。

1.2 試劑

四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4，批號20091217）購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；特級初榨橄欖油（批號20150123）購自山東魯花集團(tuán)有限公司；羧甲基纖維素鈉（批號20150912）購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜級）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；亮氨酸腦啡肽購自美國Sigma-Aldrich公司；純凈水購自美國Sigma公司；甲酸（色譜級）購自美國Dikma Technologies公司。

1.3 動物

SPF級SD雄性大鼠，4周齡，體質(zhì)量170～200 g，48只，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部（實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部），許可證號SCXK（京）2011-0012。飼養(yǎng)條件：實(shí)驗(yàn)室溫度23～25 ℃，相對濕度（50±5）%。動物實(shí)驗(yàn)已獲得內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號20160310）。大鼠最終采取sc水合氯醛麻醉處死。

1.4 儀器

DZW-8-8型水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D（III）循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；MH-250型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；AcquityTM UPLC超高液相色譜儀、四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-TOF/MS，美國Waters公司）；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新有限公司）。

2 方法

2.1 蒙古扁桃石油醚提取物的制備

取蒙古扁桃種仁，碾碎后用回流煎煮法以95%乙醇90 ℃提取2次，70%乙醇90 ℃提取1次，每次2 h，回收溶劑濃縮成稠浸膏制備總提物，再用石油醚進(jìn)行萃取，濃縮揮干稱重，得石油醚萃取物，得率為13.7%。經(jīng)成分含量分析，蒙古扁桃石油醚提取物主要含脂肪酸類化合物，其中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的73.20%，主要包括28.87%油酸、38.69%亞油酸；飽和脂肪酸以棕櫚酸為主，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.66%[14]。

2.2 肝纖維化模型制備、分組和給藥

大鼠肝纖維化模型制備方法參照文獻(xiàn)方法[17]，依據(jù)石油醚提取物有效劑量，大鼠適應(yīng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組，模型組，水飛薊素（50 mg/kg，水飛薊素溶于0.5%羧甲基纖維素鈉配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液）組，蒙古扁桃高、中、低劑量（1.75、1.25、0.75 g/kg，蒙古扁桃石油醚提取物溶于0.5%羧甲基纖維素鈉分別配制成質(zhì)量濃度為0.35、0.25、0.15 mg/mL的溶液）組，每組8只[14-15]。除對照組大鼠sc橄欖油外，其余各組大鼠于腹部sc 40% CCl4橄欖油溶液（首次5 mL/kg，之后3 mL/kg），2次/周，持續(xù)8周。造模同時各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物（5 mL/kg），模型組和對照組ig等體積羧甲基纖維素鈉溶液。

2.3 樣本收集

大鼠分別于實(shí)驗(yàn)第2、4、6、8周眼眶靜脈取血，置于分離膠促凝管中，離心取上清，于?80 ℃保存，用于血清代謝組學(xué)研究。

2.4 血清代謝組學(xué)研究

2.4.1 色譜條件 Acquity UPLCBEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為0.1%甲酸乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～15 min，2%～100% A；15～17 min，100% A；17～18 min，100%～2% A；18～20 min，2% A；柱溫為40 ℃；體積流量為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），采用正、負(fù)離子W模式檢測，毛細(xì)管電壓為1300 V（ESI＋）、1500 V（ESI?）；樣品錐孔電壓為60 V（ESI＋）、70（ESI?）；離子源溫度為110 ℃；脫溶劑溫度為350 ℃；脫溶劑氮?dú)怏w積流量為750 L/h；錐孔氣體積流量為20 L/h。鎖定質(zhì)量溶液，采用美國Waters公司LockSprayTM校正系統(tǒng)進(jìn)行在線質(zhì)量校正。亮氨酸腦啡肽準(zhǔn)分子離子峰為[M＋H]＋＝556.277 1、[M－H]?＝554.261 5，鎖定質(zhì)量濃度為1 ng/mL，體積流量為30 μL/min。掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍為/: 100～1500。

2.4.3 多元數(shù)據(jù)分析 將各組血清樣品測得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Waters Progenesis QI 2.3軟件進(jìn)行分析。每個離子的強(qiáng)度相對于總離子數(shù)進(jìn)行歸一化，并生成數(shù)據(jù)矩陣，包括保留時間、質(zhì)荷比、歸一化后的峰面積。再使用Waters EZinfo 3.0軟件，采用無監(jiān)督的主成分分析法（principal component analysis，PCA）和有監(jiān)督的偏最小二乘-判別分析法（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）對獲得的多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，對各組大鼠血清的代謝物進(jìn)行分析。課題組前期通過正交偏最小二乘-判別分析法（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），根據(jù)變量投射重要性（VIP）＞2且＜0.05對對照組和模型組大鼠血清進(jìn)行了差異代謝物的篩選；并進(jìn)行代謝通路分析（metabolomics pathway analysis，MetPA），根據(jù)impact＞0.02、?lg＞2篩選出肝纖維化潛在的靶標(biāo)路徑，根據(jù)這些路徑中所對應(yīng)的代謝物進(jìn)一步篩選得到影響肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵潛在生物標(biāo)志物[17]。本研究使用IBM SPSS Statistics 23.0軟件對各組生物標(biāo)志物動態(tài)研究進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，兩組間比較采用Student’s檢驗(yàn)，多組采用單因素方差分析（one-way-ANOVA）。

3 結(jié)果

3.1 蒙古扁桃石油醚提取物對肝纖維化不同發(fā)展階段大鼠血清代謝輪廓的影響

采用PCA法對各組大鼠不同時間段血清代謝輪廓進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1-A所示，各組樣本聚類良好，在肝疾病發(fā)展過程中，模型組與對照組各時間點(diǎn)均呈不同聚類。為更好判別各給藥組對代謝譜的影響，采用有監(jiān)督的PLS-DA分析對代謝譜進(jìn)行最大限度分析，結(jié)果如圖1-B所示，實(shí)驗(yàn)第2周時，模型組與對照組之間分離良好，說明肝纖維化疾病早期與正常大鼠之間有明顯差異；各給藥組從第2周時開始與模型組聚類分離，并向?qū)φ战M移動；第8周時，各組聚類最為明顯，且回調(diào)趨勢達(dá)到最大程度，說明各給藥組在肝纖維化發(fā)展過程中對內(nèi)源性代謝物產(chǎn)生正向調(diào)節(jié)作用，并能預(yù)防早期肝損傷。第8周時，蒙古扁桃高、中劑量組與模型組分離程度較大，并與對照組有重合，說明高、中劑量蒙古扁桃石油醚提取物抗肝纖維化作用優(yōu)于低劑量蒙古扁桃石油醚提取物和水飛薊素。肝纖維化病程各階段模型所建立數(shù)學(xué)模型分別為第2周（2＝39%、2＝29%），第4周（2＝58%、2＝54%），第6周（2＝88%、2＝58%），第8周（2＝97%、2＝85%）。結(jié)果表明，隨造模時間增加，模型建模能力逐步提高，從第4周開始模型預(yù)測能力均大于50%，表明模型具有良好的擬合度和預(yù)測能力。第8周時97%的樣本均符合模型判別，模型的預(yù)測能力達(dá)到85%。

圖1 不同時間點(diǎn)各組血清樣本正離子模式下的PCA (A) 和PLS-DA (B) 3D模式得分圖

3.2 蒙古扁桃石油醚提取物對肝纖維化大鼠血清差異代謝物的影響

課題組前期在實(shí)驗(yàn)第8周時，根據(jù)VIP＞2、＜0.05，篩選鑒定出46種差異代謝物[17]。為探究蒙古扁桃石油醚提取物對這些差異代謝物的影響，對各組差異代謝物的變化趨勢做熱圖聚類分析，如圖2-A所示，模型組與對照組顯著分開，給藥組靠近對照組聚類，并對模型組擾動的肝纖維化差異代謝物具有回調(diào)作用。對模型組與對照組、給藥組與模型組進(jìn)行顯著性差異比較，以值熱圖展示，如圖2-B所示。

根據(jù)結(jié)果，基于ANOVA分析，統(tǒng)計與模型組比較，各給藥組可顯著回調(diào)的差異代謝物個數(shù)，以韋恩圖展示，如圖3和表1所示，在模型組顯著下調(diào)的27個差異代謝物中，蒙古扁桃高、中、低劑量組可分別回調(diào)8、10、6個（＜0.05）；在模型組顯著上調(diào)的19個差異代謝物中，蒙古扁桃高、中、低劑量組可分別顯著回調(diào)13、16、13個（＜0.05）。蒙古扁桃高、中、低劑量組可共同作用16個差異代謝物。

圖2 各組大鼠血清差異代謝物層次聚類熱圖(A) 和P值熱圖(B)

3.3 蒙古扁桃石油醚提取物對肝纖維化大鼠在疾病發(fā)展各階段的血清關(guān)鍵生物標(biāo)志物的影響

課題組前期對模型組和對照組大鼠血清中初步鑒定的46種差異代謝物進(jìn)行了MetPA，共篩選出4條主要參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的代謝通路，包括鞘脂類代謝，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成與降解，初級膽汁酸合成，甘油磷脂代謝，通路中所對應(yīng)的代謝物篩選為影響肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵潛在生物標(biāo)志物[17]。該關(guān)鍵生物標(biāo)志物的質(zhì)譜鑒定和代謝通路信息如表2所示。為探究蒙古扁桃石油醚提取物在肝纖維不同發(fā)展階段對這些關(guān)鍵標(biāo)志物的干預(yù)作用規(guī)律，9個關(guān)鍵潛在生物標(biāo)志物在各組中不同時間點(diǎn)的含量變化如圖4所示。第2周7個代謝物鞘氨醇、鞘磷脂、-亮氨酸、-纈氨酸、溶血磷脂（17∶0）、磷脂酰膽堿[18∶1(11)/20∶5(5,8,11, 14,17)]、膽固醇的含量發(fā)生顯著變化，隨疾病發(fā)展模型組大鼠血清標(biāo)志物呈逐步升高或降低趨勢（＜0.05、0.01），提示這些標(biāo)志物參與疾病進(jìn)展全過程，有望成為早期檢測肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的潛在生物標(biāo)志物。鞘氨醇在第8周可被蒙古扁桃高、中劑量組顯著回調(diào)（＜0.05、0.01）；磷脂酰膽堿水平在第8周可被蒙古扁桃中劑量組顯著升高（＜0.05）；鞘磷脂在第4周可被蒙古扁桃高、中劑量組顯著回調(diào)（＜0.05、0.01），第8周蒙古扁桃中劑量組對其有回調(diào)作用（＜0.01）；-亮氨酸、-纈氨酸在第8周均可被各給藥組回調(diào)（＜0.05、0.01）；膽固醇在第4周可被蒙古扁桃高、中劑量組回調(diào)（＜0.05、0.01），第8周可被蒙古扁桃中、低劑量組顯著回調(diào)（＜0.05）。甘膽酸和乳糖神經(jīng)酰胺在第8周發(fā)生顯著變化（＜0.05），提示其可能為晚期肝纖維化診斷提供重要信息。蒙古扁桃中、低劑量組顯著降低甘膽酸水平，高劑量可顯著回調(diào)乳糖神經(jīng)酰胺水平（＜0.05）。

圖3 蒙古扁桃石油醚提取物回調(diào)差異代謝物韋恩圖

表1 蒙古扁桃石油醚提取物回調(diào)差異代謝物韋恩圖結(jié)果

表2 肝纖維化大鼠血清關(guān)鍵差異代謝物鑒定結(jié)果

4 討論

肝纖維化的發(fā)生為動態(tài)進(jìn)展式病理過程，利用代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行藥物療效動態(tài)監(jiān)測，對藥物的藥效評價及作用機(jī)制研究具有重要意義。課題組前期運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對蒙古扁桃藥材石油醚提取物進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸為其主要成分，占脂肪酸總量73.2%，其中單不飽和脂肪酸（油酸和亞油酸）占67.56%[14]。研究表明，富含油酸等單不飽和脂肪酸的膳食油和藥物可通過改善血脂異常、降低脂質(zhì)過氧化和膠原沉積預(yù)防多種疾病，如降低心血管疾病發(fā)生率、改善胰島素抵抗、防治非酒精性脂肪肝和肝纖維化[18-22]。因此，不飽和脂肪酸為蒙古扁桃發(fā)揮抗肝纖維化重要物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)基于UPLC- Q-TOF/MS技術(shù)，探究蒙古扁桃石油醚提取物對不同發(fā)展階段肝纖維化大鼠代謝輪廓及內(nèi)源性生物標(biāo)志物的影響，以揭示其作用靶點(diǎn)與途徑。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

PLS-DA結(jié)果顯示，在肝疾病發(fā)展過程中，各時間點(diǎn)的模型組與對照組血清樣本均呈不同聚類，第2～8周蒙古扁桃石油醚提取物組與模型組聚類逐步分離，并向?qū)φ战M移動，提示蒙古扁桃石油醚提取物可糾正模型組肝纖維化疾病發(fā)展各階段代謝譜，恢復(fù)機(jī)體代謝紊亂。第8周與對照組比較，模型組經(jīng)篩選鑒定共得到9個與肝纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的血清潛在關(guān)鍵生物標(biāo)志物，主要參與鞘脂類代謝，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成與降解，初級膽汁酸合成，甘油磷脂代謝。這些代謝通路所對應(yīng)的差異代謝物相互影響，在疾病過程中起著關(guān)鍵作用。蒙古扁桃石油醚提取物對這些生物標(biāo)志物有不同程度回調(diào)作用，且不同劑量之間影響趨勢不同。為了探究蒙古扁桃發(fā)揮抗肝纖維化的主要干預(yù)靶點(diǎn)和代謝途徑，根據(jù)京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)構(gòu)建關(guān)鍵差異代謝物-代謝途徑-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖5所示。按照不同的代謝途徑，查詢文獻(xiàn)闡釋關(guān)鍵信號途徑及其對應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物與肝纖維化的相關(guān)性，并根據(jù)蒙古扁桃石油醚提取物對這些代謝物及代謝途徑的影響，進(jìn)而揭示其抗肝纖維化可能的作用機(jī)制。

4.1 蒙古扁桃參與纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成與降解

亮氨酸和纈氨酸為支鏈氨基酸，用于蛋白合成。由亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸組成的混合支鏈氨基酸可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad信號通路和白細(xì)胞介素，從而改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化[23]。Nakanishi等[24]發(fā)現(xiàn)-纈氨酸可以通過減少肝細(xì)胞的促血小板生成素減輕肝臟疾病，并促進(jìn)受損肝臟恢復(fù)而改善肝纖維化。研究表明，乙肝、肝硬化、肝癌患者的支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨基酸）與芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）比值較正常者顯著降低，提示肝臟疾病患者中纈氨酸、亮氨酸分解代謝增加，色氨酸分解代謝減少[25]。本研究結(jié)果顯示，在肝纖維化早、中期（第2～4周），支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸）水平顯著降低，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致；肝纖維化晚期（第8周）支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸）水平升高，推測可能是由于肝臟持續(xù)損傷后，糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺類激素等分泌增加、滅活減少、分解代謝升高，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性蛋白質(zhì)分解，從而釋放了大量的氨基酸，而肝臟代謝和消除氨基酸作用不等，造成血循環(huán)中氨基酸水平增加。蒙古扁桃石油醚提取物組在第8周顯著回調(diào)過高的-亮氨酸和-纈氨酸水平，提示其可參與氨基酸代謝，改善肝纖維化。

紅色或藍(lán)色字體表示：模型組vs對照組，第8周顯著上調(diào)（紅色）和下調(diào)（藍(lán)色）的關(guān)鍵生物標(biāo)志物；△、☆、○分別表示：蒙古扁桃高、中、低劑量組vs模型組，有顯著差異生物標(biāo)志物（P＜0.05）

4.2 蒙古扁桃參與鞘脂類代謝

鞘脂類代謝在脂肪肝、肝纖維化等肝臟疾病發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[26-28]。鞘脂類代謝參與炎癥反應(yīng)、神經(jīng)酰胺合成和多種信號傳導(dǎo)，如細(xì)胞增殖、分化和凋亡等，在器官纖維化的形成、發(fā)展過程中起著重要調(diào)節(jié)作用[28-31]。鞘脂類中神經(jīng)酰胺能夠抑制活化的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）凋亡而導(dǎo)致ECM過度沉積，并增加肝細(xì)胞對各種刺激的敏感性而促進(jìn)肝損傷，此外還參與由氧化應(yīng)激和細(xì)胞外如脂多糖和促炎細(xì)胞因子引起的炎癥反應(yīng)[30]。因此，鞘脂類神經(jīng)酰胺表達(dá)升高將促使肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。神經(jīng)酰胺由1個長鏈鞘氨醇類組成，在細(xì)胞內(nèi)的合成來源為絲氨酸、鞘磷脂、神經(jīng)鞘氨醇。研究表明，肝纖維化大鼠血清鞘氨醇水平降低，合成大量神經(jīng)酰胺應(yīng)答炎癥反應(yīng)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化大鼠疾病發(fā)展各階段血清鞘氨醇和鞘磷脂水平降低，推測鞘脂類代謝影響肝纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展全過程。給予蒙古扁桃石油醚提取物4周時，血清鞘磷脂顯著回調(diào)；8周時，血清鞘磷脂、鞘氨醇、乳糖神經(jīng)酰胺均顯著回調(diào)，推測長期給予蒙古扁桃可在肝纖維化晚期通過調(diào)節(jié)鞘脂類代謝參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，促進(jìn)活化HSC凋亡，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

4.3 蒙古扁桃參與初級膽汁酸生物合成

膽汁酸是膽汁的重要成分，在脂肪代謝中起著重要作用。當(dāng)肝或腸道疾病發(fā)生時，膽汁酸代謝平衡（合成、再吸收、排泄）受到破壞，總膽汁酸水平升高[32]。膽汁酸被認(rèn)為是肝損傷的標(biāo)志，膽汁酸可通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和壞死促進(jìn)肝損傷，最終發(fā)展為肝硬化或肝衰竭[33]。本研究結(jié)果顯示，膽汁酸的共軛膽酸（膽固醇和甘膽酸）分別在肝纖維化各階段和第8周顯著升高，表明血清脂質(zhì)代謝與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。蒙古扁桃石油醚提取物高、低劑量組可顯著降低第4、8周的膽固醇水平和第8周的甘膽酸水平，與課題組前期研究中蒙古扁桃石油醚提取物對高脂血癥大鼠調(diào)脂作用的結(jié)果一致[14]。提示早期給予蒙古扁桃可降低肝纖維化中、晚期脂質(zhì)水平，減少肝損傷。

4.4 蒙古扁桃參與甘油磷脂代謝

磷脂酰膽堿為肝臟重要營養(yǎng)來源，可以拮抗肝臟受病毒、藥物、酒精及其他有毒物質(zhì)的侵害，還可降低血清中膽固醇水平，防止肝纖維化、肝硬化[34]。溶血磷脂在肝損傷中發(fā)揮重要作用，在肝損傷的早期階段，溶血磷脂不足反映磷脂酰膽堿不足[35]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致，磷脂酰膽堿和溶血磷脂（17∶0）水平分別在肝纖維化第8周和2～8周顯著降低，蒙古扁桃石油醚中劑量組第8周上調(diào)磷脂酰膽堿水平，參與甘油磷脂代謝抗肝纖維化。

綜上所述，肝纖維化的發(fā)生發(fā)展存在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、氨基酸代謝紊亂。這些生物標(biāo)志物之間相互聯(lián)系，相互影響構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)體共同參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。給予蒙古扁桃石油醚提取物2周未見對肝纖維化早期變化生物標(biāo)志物產(chǎn)生回調(diào)；中期（第4周）主要通過作用于膽固醇、鞘磷脂，減輕肝損傷，延緩肝纖維化形成；晚期（第8周）可回調(diào)8個關(guān)鍵生物標(biāo)志物包括鞘磷脂、鞘氨醇、乳糖神經(jīng)酰胺、磷脂酰膽堿、膽固醇、肝膽酸、亮氨酸和纈氨酸，參與鞘脂類、甘油磷脂代謝，初級膽汁酸生物合成，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成與降解，從而發(fā)揮抗纖維化作用；蒙古扁桃石油醚提取物中劑量對代謝譜回調(diào)趨勢更明顯，對差異代謝物和關(guān)鍵生物標(biāo)志物回調(diào)數(shù)量較多，抗肝纖維化效果較佳。本研究從代謝組角度闡釋蒙古扁桃石油醚提取物的作用機(jī)制，為蒙古扁桃的開發(fā)利用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為其臨床安全有效應(yīng)用提供參考。課題組后續(xù)將進(jìn)一步驗(yàn)證本研究篩查得到的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，并深入研究具有重要生物學(xué)意義的代謝物，通過相關(guān)調(diào)控蛋白將內(nèi)源性代謝物與疾病的調(diào)控基因整合，獲取更加全面可靠的疾病發(fā)病機(jī)制和蒙古扁桃抗纖維化的作用機(jī)制，為蒙古扁桃有效干預(yù)靶點(diǎn)提供更準(zhǔn)確、可靠信息。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Dynamic study on protective effects ofon hepatic fibrosis based on changes of serum biomarkers

CHANG Hong1, BAI Wan-fu1, LI Qian1,LIU Quan-li1,2, MENG Hong-yu3, SHI Song-li1,2

1. School of Pharmacy, Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014060, China 2. Academician Work Station for Pharmacology, Pharmacokinetics and Safety Evaluation of Mongolian Medicine, Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014060, China 3. Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China

Serum metabolomics were utilized to explore the effects of the petroleum ether extract ofon the metabolic profile and biomarkers in hepatic fibrosis progression, and to clarify its mechanisms of anti-HF from the perspective of metabolism.Rats were sc carbon tetrachloride (CCl4) for 8 weeks to establish liver fibrosis model, and ig petroleum ether extract of(1.75, 1.25, 0.75 g/kg) and silymarin (50 mg/kg). Serum metabolic profiling was performed by UPLC-Q-TOF/MS to explore the dynamic changes of metabolic spectrum in all experimental groups at weeks 2, 4, 6, and 8. The serum potential and dynamicalbiomarkers alteration in each group during different time points were compared. The drug-target-pathway network was constructed by metabolic pathway analysis.The petroleum ether extract ofrestored the CCl4-induced alteration of metabolic spectrum in all stages of hepatic fibrosis. However, there was no effect on the key biomarkers in the early stage of liver fibrosis at the week 2 after being treated with, while it could reduce liver injury and mitigate the development of liver fibrosis by regulating cholesterol and sphingomyelin in the middle stage (4 weeks). In the late stage (8 weeks),played an anti-fibrosis role byreversing eight key biomarkers including sphingosine, sphingomyelin and cholesterol, participating in sphingomyelin metabolism, glycerol phospholipid metabolism, primary bile acid biosynthesis; And participating in biosynthesis and degradation of valine, leucine, isoleucine. In addition, the petroleum ether extract of(1.25 g/kg) group had better efficacies due to more obvious tendency for the callback of metabolic spectrum, and more restored differential metabolites and key biomarkers.UPLC-MS-based metabonomic analysis revealed that petroleum ether extract ofcan effectively improve hepatic fibrosis through multi-target effect on hepatic fibrosis metabolites and related metabolic pathways

metabonomics; biomarkers; hepatic fibrosis;(Maxim.) Ricker; petroleum ether extract

R285.5

A

0253 - 2670(2021)01 - 0108 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.014

2020-07-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81760782）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81641137）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2017MS0813）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2018LH03027）；內(nèi)蒙古自治區(qū)“草原英才”工程青年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)一層次人才項(xiàng)目（Q2017046）；包頭醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金資助項(xiàng)目（BSJJ201809）；北京中醫(yī)藥大學(xué)新教師啟動基金資助項(xiàng)目（2019-JYB-XJSJJ-023）

常 虹（1985—），博士，講師，研究方向?yàn)橹忻伤幩幚怼el: (0472)7167795 E-mail: changhong_cool@163.com

孟洪宇（1988—），女，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)內(nèi)科疾病臨床與基礎(chǔ)研究。Tel: (010)84015829 E-mail: menghyhy@126.com

石松利（1982—），女，碩士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)橹忻伤幩幚?。Tel: (0472)7167795 E-mail: shisongli122@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]