荔枝核改善胰島素抵抗治療2型糖尿病的網絡調控作用研究

鄧志軍，李阿榮，羅永佳，周毅業(yè)，郭潔文，劉若軒，李麗明，吳菲

(廣州醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510130)

本課題組前期研究發(fā)現：荔枝核具有改善糖、脂代謝紊亂，增強胰島素敏感性和對抗自由基損傷等作用；荔枝核皂苷及其有效部位群可顯著改善T2DM伴胰島素抵抗(IR)模型大鼠糖脂代謝，增強胰島素敏感性和葡萄糖利用能力，改善IR[1-4]。網絡藥理學技術是通過構建藥物、成分、靶點、疾病、通路之間的復雜網絡預測藥物的作用機制，適用于中藥復雜體系機制研究[5]。本試驗擬通過網絡藥理學篩選荔枝核降糖的主要成分及作用靶點，根據“化合物-靶標-疾病”網絡分析及GO信號通路富集分析荔枝核降糖的潛在機制，為荔枝核及其活性成分發(fā)揮降糖作用的分子機制研究提供新思路，并為進一步研發(fā)荔枝核降糖調脂的創(chuàng)新制劑奠定基礎。

1 方法

1.1 荔枝核活性化合物及其靶向基因

BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)是一個分析中草藥活性成分、相關靶標的生物信息分析工具數據庫[6]，它利用互聯(lián)網的海量信息共享優(yōu)勢，通過數據挖掘將傳統(tǒng)中藥、方劑或者化合物進行線上交互，進而預測其微觀分子機制和靶向蛋白位點，同時還可以將基因位點信息進行功能富集分析[4]。本研究根據 BATMAN-TCM 數據庫的說明，輸入“荔枝核”為關鍵詞，利用數據庫檢索其成分數據，以閾值(score cutoff)>20、P<0.05為篩選標準，獲得荔枝核的活性化合物及其靶向蛋白基因列表。

1.2 荔枝核活性成分降糖作用靶向基因預測與篩選

DisGeNET(http://www.disgenet.org/)整合了多個數據庫的基因-疾病相關聯(lián)性信息和大量文獻，是一個收錄人類疾病相關基因與突變位點信息的網絡數據庫平臺[7]，可利用文本挖掘技術對相關疾病進行數據分析。通過該數據庫，可以先獲得與血糖相關的虛擬靶基因，然后與荔枝核活性化合物的靶向基因整合，所得的交集基因即為藥物-疾病交集靶基因。

1.3 “化合物-靶標-疾病”網絡的構建

Cytoscape是一款生物信息分析軟件，可以整合信息模塊網絡和生物學科聯(lián)系網絡的繪制，表達成網絡描述格式，還能夠為這種網絡格式添加注釋信息，針對問題進行深入分析[8]。本試驗利用Cytoscape3.6.1軟件構建荔枝核降糖功效的“成分-靶點-疾病”網絡圖，進而呈現荔枝核 “多靶點、多途徑、多層次”的整體調控作用。

1.4 荔枝核活性成分降糖靶點通路分析

利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)系統(tǒng)[9]，將通過上述方法獲取的荔枝核降糖靶點信息進行生物分子功能注釋。結合GO富集分析和KEGG通路注釋分析，根據富集因子分析核心通路富集程度，探討荔枝核降糖的作用機制。

2 結果

2.1 荔枝核主要活性成分及潛在靶點信息

將BATMAN-TCM所得荔枝核活性成分潛在靶點與DisGeNET數據庫中搜到的與降糖相關的靶點比對分析，得到5種活性成分及597個可能與荔枝核治療糖尿病相關聯(lián)的靶點。荔枝核的主要活性成分包括：柏木醇、棕櫚酸、苯甲酸、甲苯、4-甲基-3-戊烯-2-酮，靶點數目分別為26、226、18、58、263。荔枝核活性成分化合物-靶點蛋白網絡關系圖見圖1。基于各靶點來源化合物數量發(fā)現，ESRRG、AKR1C2、AR、DBT等是荔枝核中5種活性成分的主要潛在作用靶點。荔枝核活性成分部分靶點信息及來源化合物數目等詳見表1。上述結果體現出荔枝核多成分、多靶點的降糖作用機制。

2.2 成分-靶點-通路網絡構建與分析

通過試驗數據構建荔枝核“成分-靶點-信號通路”網絡圖，見圖2。它由27個“節(jié)點”(5種成分，16個靶點及6種與降糖有關通路)和64條“邊”構成：3種顏色分別代表荔枝核的活性成分、潛在靶點及相關通路，“邊”代表三者間交互作用。結果顯示網絡節(jié)點度排名靠前的是GABRB2、GABRB3這2個靶點，為網絡樞紐節(jié)點，提示其可能是荔枝核降糖的核心作用靶點。每個活性成分對應多個靶點，每個靶點聯(lián)系多種成分，體現了荔枝核多成分、多靶點降糖作用機理，各通路間既共有靶點又不相互獨立，更說明通路間協(xié)同發(fā)揮相互作用。

注：紅色菱形代表化合物，藍色橢圓形為靶點蛋白。

表1 荔枝核活性成分部分靶點信息

2.3 生物功能與通路分析

2.3.1 GO 富集分析 將BATMAN-TCM所得荔枝核活性成分、靶點以DAVID平臺進行GO富集分析，結果有生物學過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)，見圖3。結果顯示，生物學過程中解剖結構發(fā)育(anatomical structure development)和壓力反饋(response to stress)等作用突出；細胞組分中細胞(cell)和細胞質(cytoplasm)較重要；分子功能中離子結合(ion binding)等功效顯著。

2.3.2 信號通路分析 KEGG通路注釋分析[10]結果提示：共32條相關信息通路與目標成分預測靶點有關，其中16條相關信息通路頻率較高，又可分為8類。內分泌系統(tǒng)通路3條，為卵巢類固醇生成、雌激素和催產素信號通路；神經系統(tǒng)相關通路有6條，分別為逆行內源性大麻素信號轉導和5條突觸通路；信號轉導相關通路有2條，為鈣信號通路和CGMP-PKG信號通路；與信號分子與相互作用相關的通路有1條，為神經活性配體-受體相互作用；循環(huán)系統(tǒng)相關通路有1條，為心肌細胞腎上腺素能信號轉導；脂質代謝相關通路有1條，為類固醇激素生物合成；環(huán)境適應相關通路1條，為晝夜夾帶；能量代謝相關通路1條，為氧化磷酸化。具體分析結果見表2。

注：黃色菱形為化合物，藍色橢圓形為靶點蛋白，綠色正方形為信號通路。

3 討論

荔枝核有效部位群可以調節(jié)糖脂代謝、改善IR，與抑制胰腺組織內質網應激關鍵基因葡萄糖調節(jié)蛋白78 (GRP78)及C/EBP同源蛋白(CHOP)mRNA 的表達關系密切[1-4]。本研究篩選出荔枝核5種活性成分及597個可能與荔枝核治療糖尿病相關聯(lián)的潛在靶點，其主要活性成分包括：柏木醇、棕櫚酸、4-甲基-3-戊烯-2-酮、苯甲酸、甲苯，而ESRRG、AKR1C2、AR、DBT等應是荔枝核中5種活性成分的主要潛在作用靶點。

雌激素是女性內分泌系統(tǒng)的重要激素之一，它通過其受體發(fā)揮多種生物學效應。在妊娠早期雌激素可上調胰島素受體，提高胰島素敏感度；在懷孕中晚期，體內升高的雌激素會抵消孕激素的部分作用，降低身體血糖利用能力， 發(fā)生妊娠糖尿病[11-12]。雄激素維持糖脂代謝，其作用主要是通過AR介導。醛酮還原酶(aldo-keto reductase，AKR)是酮還原酶超家族成員之一，包括糖尿病慢性并發(fā)癥在內的多種疾病的發(fā)生與它的激活關系緊密。研究認為AKR與AR的合成與代謝關系緊密，還參與其信號通路，作為AR合成途徑之一的后門通路(backdoor pahtway)就與AKR1C2有聯(lián)系[13]。γ-氨基丁酸(gamma-aminobu-tyric acid，GABA) 是一種神經遞質，它通過GABA細胞膜極化過程調節(jié)胰島細胞的分泌，最終達到雙向調節(jié)血糖的目的[14-18]。糖尿病就是經由 GABA 調控胰島素的釋放和 GABA抗原的表達來實現，所以通過GABA進行相應治療可延緩由糖代謝受損和氧化應激導致的糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[19]。

圖3 荔枝核活性成分GO富集分析結果

表2 荔枝核活性成分相關通路的分類及信息

荔枝核網絡藥理的相關通路分析結果提示：共32條相關信息通路與目標成分預測靶點有關，其中CNR1 系統(tǒng)失調與多種代謝性疾病有關，如IR和炎癥，而這些因素也是 T2DM 的危險因素[20-21]。胰高血糖素樣肽1(GLP-1)受體激動劑是糖尿病的新藥，功效明顯、優(yōu)勢突出。內源性大麻素系統(tǒng)中含有2種G蛋白偶聯(lián)大麻素受體(CNRs)，可以調節(jié)下丘腦和肥胖、新陳代謝等，其中CNR1主要位于人體大腦的幾個區(qū)域和包括脂肪在內的多種外周組織中，和GLP-1受體激動劑的療效相關[22-23]。脂質代謝相關通路有1條：類固醇激素生物合成；SHBG是專門負責運輸性激素的一種球蛋白，可調控性激素的水平[24]。研究顯示，T2DM 男性患者的SHBG顯著減少，而雌激素明顯增加。男性特別是老年男性體內AR和SHBG的水平下降，是T2DM的危險預測因子[25-27]。

能量代謝相關通路有1條：氧化磷酸化。它能釋放能量供給ADP、合成ATP，主要在線粒體中完成。糖尿病是一種慢性高血糖狀態(tài)，以線粒體的基因突變最多見。糖尿病血管病的早期發(fā)病及最終臨床表現中均與線粒體功能紊亂有關，兩者的病理表現形成惡性循環(huán)又互為因果[28-29]。已知的糖尿病發(fā)病原因比較復雜，其中IR、β細胞功能與線粒體功能聯(lián)系密切，故改善IR和β細胞功能對糖尿病意義重大[30]。

環(huán)境適應相關通路的晝夜夾帶是一種生物節(jié)律，紊亂的生物節(jié)律會降低糖耐量，胰島素異常分泌，最終造成糖代謝紊亂[10]。糖尿病和生物鐘節(jié)律相關，晝夜失調增加糖尿病的風險和炎癥，不規(guī)律生活特別是長期夜生活的人群體內的晝夜周期會發(fā)生變化，破壞胰島生物鐘的功能，降低胰島分泌質量和數量，肥胖也會與之共同促進β細胞衰竭，這些都是胰島生物鐘損傷的結果[31-33]。另外，胰島素分泌的正常節(jié)律是維持血糖生理穩(wěn)態(tài)的關鍵因素之一，晝夜節(jié)律系統(tǒng)調節(jié)胰島素分泌晝多夜少，揭示“晝-夜”周期糖耐量-胰島分泌的內在規(guī)律，這種規(guī)律的紊亂會導致T2DM發(fā)生[34]。

本研究結果顯示了荔枝核“多成分-多靶點-多通路”的降糖作用特點，可為下一步明確荔枝核活性成分治療糖尿病靶點及機制驗證研究提供理論依據。