柴胡-葛根治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的分子靶點和機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和分子對接

方舒涵，張澤鑫，吳汶豐， 陳文廷，官麗蘭， 李菁

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 ； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410000)

2019年12月湖北省武漢市出現(xiàn)高傳染性不明原因的肺炎，經(jīng)證明，為感染新型冠狀病毒 (SARS-CoV-2)引起。此次爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、干咳，嚴(yán)重者可出現(xiàn)呼吸困難、缺氧甚至呼吸衰竭等。

目前冠狀病毒引起的高傳染性疾病如重癥急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome，MERS)以及COVID-19均未發(fā)現(xiàn)特異性治療的藥物，西醫(yī)的治療手段僅以對癥治療為主。中醫(yī)藥治療此次COVID-19具有“簡、便、廉、驗”的特點。從中醫(yī)的角度分析，該病屬“疫病”范疇，病位主要在肺脾，病機(jī)與濕、熱、瘀、毒等有關(guān)，濕毒為原，氣機(jī)不暢則發(fā)病。該病初期臨床癥狀多與外感熱病有類似之處[1]。劉完素認(rèn)為“熱病只能作熱治,不能從寒醫(yī)” 的論點,提出“宜涼不宜溫”的治療原則，基于上述理論,可選用柴葛解肌湯來治療[2]。

柴葛解肌湯出自《傷寒六書》，柴胡、葛根是方中君藥，是臨床常用的退熱藥對。漢代古籍《藥鑒》記載：柴胡、葛根乃“療肌表，功為第一”，葛根能解肌退熱，柴胡能疏散退熱，清熱解毒?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究中，柴胡與葛根配伍具有解熱、抗炎、抗自由基損傷等作用，其可能與降低血清中白介素-1β、髓過氧化物酶等含量和活性有關(guān)[3]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，構(gòu)建柴胡-葛根藥對與 COVID-19的分子靶點網(wǎng)絡(luò)，探討治療COVID-19 的有效成分及其作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療COVID-19提供臨床與基礎(chǔ)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件

TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；Gennecards(https://www.genecards.org/)；OMIM(https://omim.org/)；String(https://string-db.org/)；cytoscape3.7.2；R 3.6.1；FUNRICHNEW3.1.3；Autodock4.2；Pymol。

1.2 柴胡-葛根的潛在有效成分篩選及靶點預(yù)測

通過TCMSP在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，分別檢索柴胡和葛根，獲取柴胡-葛根的有效成分和靶點。中藥多通過口服進(jìn)入人體，并在人體系統(tǒng)經(jīng)過吸收、分布、代謝、排泄(ADME)過程才能與靶器官、靶組織結(jié)合發(fā)揮藥效。而研究表明，符合里賓斯基(Lipinski)的類藥五原則的先導(dǎo)藥物因具有較好的ADME性質(zhì)而成為潛在的口服藥[4]。故限定過濾條件：口服生物利用度(OB)設(shè)置為≥30%，類藥性(DL)設(shè)置為≥0.18，以得到其潛在有效成分和靶點。

1.3 新型冠狀病毒肺炎靶點獲取

在Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫，以“novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞，獲取新型冠狀病毒肺炎疾病靶點。

1.4 柴胡-葛根治療COVID-19靶點獲取

通過R軟件，將柴胡-葛根和疾病靶點取交集，獲取柴胡-葛根治療COVID-19的靶點。

1.5 柴胡-葛根治療COVID-19分子靶點網(wǎng)絡(luò)繪制

將柴胡-葛根治療COVID-19的成分和靶點導(dǎo)入cytoscape3.7.2，繪制出柴胡-葛根治療COVID-19分子靶點網(wǎng)絡(luò)，尋找候選的活性成分。

1.6 柴胡-葛根治療COVID-19蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和富集圖繪制

將柴胡-葛根治療COVID-19靶點導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫，將物種設(shè)定為人，最低要求交互分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.400，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)出tsv文件，結(jié)合R軟件，進(jìn)行靶點富集圖的繪制。

1.7 柴胡-葛根治療COVID-19靶點GO(BP、CC、MF)富集分析

使用FUNRICHNEW 軟件，根據(jù)柴胡-葛根治療COVID-19靶點，進(jìn)行GO富集分析。根據(jù)靶點富集的數(shù)量與顯著程度，將排名靠前的6條GO繪制成餅圖。

1.8 柴胡-葛根治療COVID-19靶點KEGG富集分析

使用FUNRICHNEW 軟件，根據(jù)柴胡-葛根治療COVID-19靶點，進(jìn)行KEGG富集分析。根據(jù)靶點富集的數(shù)量與顯著程度，將排名靠前的6條KEGG繪制成餅圖。

1.9 柴胡-葛根治療COVID-19核心化合物和靶點的分子對接

利用AutoDock 4.2和pymol對“1.5”篩選出的核心化合物和“1.6”中篩選出的前3個靶點進(jìn)行分子對接和可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 柴胡-葛根中藥潛在活性成分和靶點篩選

共篩選得到柴胡-葛根治療COVID-19的13個潛在活性成分，其中柴胡10個，葛根3個，以及柴胡-葛根靶點172個，COVID-19靶點253個，柴胡-葛根治療COVID-19靶點40個。見表1、圖1。

表1 柴胡-葛根治療COVID-19潛在活性中藥成分表

圖1 柴胡-葛根治療COVID-19靶點圖

2.2 柴胡-葛根治療COVID-19分子靶點網(wǎng)絡(luò)繪制

此網(wǎng)絡(luò)包括了56個節(jié)點，130條邊。其中紅色八邊形表示“新型冠狀病毒肺炎”，紫色六邊形表示柴胡-葛根中藥組成，淺藍(lán)色箭形表示柴胡-葛根治療新型冠狀病毒肺炎中藥成分，深藍(lán)色橢圓形表示柴胡-葛根治療COVID-19靶點，由圖2可以看出，MOL00098(槲皮素)和MOL000422(木犀草素)對應(yīng)大部分的疾病靶點，可認(rèn)為是治療COVID-19的主要候選化合物。

圖2 柴胡-葛根治療COVID-19分子靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 柴胡-葛根治療COVID-19蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和靶點富集圖繪制

將柴胡-葛根治療COVID-19的靶點導(dǎo)入到string數(shù)據(jù)庫，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)，并通過R語言軟件對靶點進(jìn)行計數(shù)，靶點計數(shù)越大，說明與其他靶點相互作用關(guān)系更明顯，在網(wǎng)絡(luò)中處于越重要地位，從圖4可以看出，IL6、MAPK8、CASP3、IL10、CCL2是核心靶點。

圖3 柴胡-葛根治療COVID-19蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 柴胡-葛根治療COVID-19靶點GO(BP、CC、MF)富集分析

根據(jù)靶點富集數(shù)目和顯著性進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示：柴胡-葛根治療COVID-19的生物學(xué)過程以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答為主，分子功能以細(xì)胞因子活性為主，其發(fā)揮作用的部位可能為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。見圖5。

2.5 柴胡-葛根治療COVID-19靶點KEGG富集分析

通過FUNRICHNEW3.1.3軟件對柴胡-葛根治療COVID-19的靶點進(jìn)行KEGG分析，共發(fā)現(xiàn)通路420條，主要有(ILK)信號通路、轉(zhuǎn)錄因子AP-1網(wǎng)絡(luò)通路 和CDC42信號通路，其中與整合素連接激酶(ILK)信號通路關(guān)系最為密切。見圖6。

圖4 柴胡-葛根治療COVID-19靶點富集數(shù)目圖

2.6 柴胡-葛根治療COVID-19有效成分和靶點的分子對接

選取柴胡-葛根治療COVID-19的主要候選化合物槲皮素和木犀草素，以及PPI網(wǎng)絡(luò)的前3位核心靶點，使用AutoDock 4.2和pymol軟件實現(xiàn)有效成分和核心靶點的分子對接和可視化處理。結(jié)果顯示槲皮素、木犀草素和IL6、MAPK8、CASP3有良好的結(jié)合能力。見圖7。

圖5 柴胡-葛根治療COVID-19的靶點GO圖

圖6 柴胡-葛根治療COVID-19的靶點KEGG圖

A.槲皮素； B.木犀草素； 1. IL6； 2. MAPK8； 3. CASP3。

3 討論

柴胡-葛根治療COVID-19的分子靶點網(wǎng)絡(luò)由13個成分和40個靶點組成。研究結(jié)果顯示(圖2)，多數(shù)成分具備了多個靶點，而槲皮素和木犀草素連接的靶點數(shù)目最多。其中槲皮素對于急性肺損傷模型，能降低促炎性因子釋放[5]。國外相關(guān)研究表明,槲皮素可以抑制副流感病毒3 ( Pf-3) 和呼吸道合胞病毒(RSV)對細(xì)胞的感染，減少病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[6]。而木犀草素可以多途徑抑制炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)[7]。

將“葛根-柴胡”藥對治療COVID-19的40個靶點進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(圖3)。并根據(jù)degree值大小，尋找“葛根-柴胡”治療該病的核心靶點(圖4)。最終確定了以IL-6、IL-10、MAPK8、CASP3、CCL2為核心靶點。IL-6與IL-10均為常見的炎癥因子，參與機(jī)體炎癥、免疫反應(yīng)。相關(guān)研究指出[8]，IL-6升高與傳染性支氣管炎密切相關(guān)。同時也有實驗數(shù)據(jù)[9]證明IL-6指標(biāo)越高，肺功能越差。當(dāng)呼吸道黏膜受到炎性刺激時，IL-10釋放過多會抑制炎癥消除且加重咳嗽頻率[10]。現(xiàn)代學(xué)者認(rèn)為當(dāng)氧化應(yīng)激平衡失調(diào)時，MAPK8 信號通路障礙，系列基因的表達(dá)紊亂，會導(dǎo)致炎癥(包含肺炎)和細(xì)胞損傷及其他病理過程的發(fā)生[11]。CASP3是一種蛋白酶，與細(xì)胞死亡密切相關(guān)， CASP3 在人類癌癥中高表達(dá)，且包含由急慢性肺炎等引起的肺癌，實驗證明CASP3 能夠增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的凋亡，降低其增殖、生長、遷移和侵襲能力[12]。分子對接顯示槲皮素、木犀草素和IL6、MAPK8、CASP3有良好的結(jié)合能力。

本研究對柴胡-葛根治療COVID-19的40個靶點進(jìn)行GO富集分析，獲得的生物學(xué)過程(BP)顯示以免疫應(yīng)答為主。SARS-CoV-2為β屬冠狀病毒，與類SARS-CoV基因序列的同源性約為80%，兩者的發(fā)病機(jī)制有著極高相似度，SARS-CoV 感染機(jī)體后,會導(dǎo)致CD3+、CD4+、CD8+ T細(xì)胞數(shù)量水平的下降，使病毒和感染的靶細(xì)胞持續(xù)存在[13]。而柴胡皂苷d和柴胡多糖能分別通過刺激T、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)與抗病毒作用，葛根中成分可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞相關(guān)表面分子如CD3+、CD4+、CD4+/CD8+的表達(dá)[14]來改善COVID-19患者的免疫功能。柴胡-葛根藥對的使用將會起到協(xié)同增效的作用，提高機(jī)體免疫能力。SARS-CoV-2感染機(jī)體后會導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生[15]，分子功能(MF)結(jié)果得到驗證，其中包括IL-1A、IL-1B和INF-γ等。這些炎性因子的異常表達(dá)，導(dǎo)致了免疫系統(tǒng)的紊亂，加重COVID-19患者的臨床癥狀。

通過對 KEGG 富集通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)柴胡-葛根治療COVID-19主要與整合素連接激酶(ILK)信號通路相關(guān)。本研究顯示ILK能與MAPK、ICAM-1、RelA、白細(xì)胞介素(IL-2、IL-6、IL-10)等多個靶點相互作用來激活炎癥反應(yīng)。在上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(EMT)的過程中，ILK本身可能對肺纖維化形成產(chǎn)生了促進(jìn)作用[16]，而肺組織纖維化實變正是COVID-19的主要病理表現(xiàn)。目前研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的S蛋白與人體的ACE2具有極高的親和力，二者結(jié)合后可導(dǎo)致肺組織損傷[17]。同時腎素血管緊張素Ⅱ的生成和表達(dá)受制于ACE2，它與血管緊張素Ⅰ型受體(AT1受體)結(jié)合后能夠激活和擴(kuò)大下游通路的炎癥反應(yīng)。AT1受體酪氨酸途徑中，腎素血管緊張素Ⅱ通過酪氨酸蛋白磷酸化，激活MAPK，誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[18]。細(xì)胞間黏附分子-1 (ICAM-1)來源于組織器官的內(nèi)皮細(xì)胞，受到細(xì)胞因子刺激后其數(shù)量水平會升高，能夠使中性粒細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞上,提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力,從而引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)[19]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，分析了柴胡-葛根藥對治療COVID-19的成分、靶點、生物學(xué)信息，旨在為中醫(yī)藥抗擊COVID-19提供指導(dǎo)。