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    山藥麩炒前后有效成分含量及UPLC指紋圖譜差異性研究

    2021-01-05 03:17:26王碧君黃上書(shū)梁慧楊文惠羅宇琴孫冬梅陳向東

    王碧君,黃上書(shū),梁慧,楊文惠,羅宇琴,孫冬梅,陳向東

    (廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 佛山 528244)

    山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb. 的干燥根莖,主要分布于山西,河北安國(guó),陜西朝邑、華縣、同州,河南新鄉(xiāng)等地,以河南為道地產(chǎn)區(qū)。山藥作為藥食兩用佳品,味甘,性平,具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精之功,臨床用于脾虛食少、肺虛喘咳、腎虛遺精、虛熱消渴等癥[1]。山藥生品長(zhǎng)于補(bǔ)虛,麩炒后健脾和胃功效增強(qiáng),臨床上麩炒山藥主要作為滋陰或補(bǔ)陽(yáng)的臣藥,功偏補(bǔ)益[2-6]。現(xiàn)代研究表明,山藥主要含有山藥多糖、黃酮、山藥堿、尿囊素、腺苷、甾體化合物等成分[7-8],具有抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血糖的作用。

    目前,2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)山藥的質(zhì)量控制缺乏有效成分的限定,本研究對(duì)不同產(chǎn)地山藥及其麩炒品進(jìn)行研究,建立山藥和麩炒山藥飲片尿囊素的HPLC含量測(cè)定方法,及山藥和麩炒山藥飲片UPLC指紋圖譜方法及腺苷的含量測(cè)定方法,并結(jié)合相似度分析對(duì)山藥及其炮制品的指紋圖譜差異進(jìn)行評(píng)價(jià),為全面評(píng)價(jià)山藥的質(zhì)量提供參考。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    Waters e2695高效液相色譜儀;Waters H-class超高效液相色譜儀;ME204E萬(wàn)分之一電子分析天平(梅特勒-托利多公司);XP26百萬(wàn)分之一電子分析天平(梅特勒-托利多公司);KQ500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

    1.2 試藥

    乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)、甲醇(廣東光華科技股份有限公司)為分析純;乙腈(默克股份有限公司)、磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)為色譜純;水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。腺苷(批號(hào)110879-201703,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%,中國(guó)食品藥品檢定研究院);尿囊素(批號(hào)111501-200202,質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%,中國(guó)食品藥品檢定研究院);麩皮(批號(hào)FH1810001,溫縣三方農(nóng)貿(mào)有限公司)。

    10批山藥生品來(lái)源于全國(guó)不同產(chǎn)地,經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖。麩炒山藥為同批山藥的炮制加工品,炮制工藝:每100 kg山藥片用麩皮10~15 kg。樣品采集信息見(jiàn)表1。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 山藥及麩炒山藥指紋圖譜的建立

    2.1.1 色譜條件 色譜柱:YMC Triart 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0~4 min,1%A;4~10 min,1%→3%A;10~25 min,3%→20%A);流速:0.20 mL/min;柱溫:30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng):258 nm;進(jìn)樣量:1 μL。

    表1 樣品信息

    2.1.2 供試品溶液的制備 取飲片粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.5 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,加入10%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇15 mL,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,離心,取上清液,殘?jiān)偌尤?0%甲醇10 mL,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,離心,合并2次上清液,定容至25 mL,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

    2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 取腺苷對(duì)照品適量,加10%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.227 mg/mL的對(duì)照品溶液。

    2.1.4 精密度試驗(yàn) 日內(nèi)精密度:取同一批飲片粉末(S1),按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,并按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,以1號(hào)腺苷色譜峰為參照峰S,計(jì)算得到各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于1.0%,表明儀器精密度良好。日間精密度:取同一批飲片粉末(S1),按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,分別在不同日期內(nèi)按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以腺苷峰為參照峰S,計(jì)算得到各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于2.0%,表明儀器精密度良好。

    2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批飲片粉末(S1),按“2.1.2”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液,并按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件依此進(jìn)樣測(cè)定,以腺苷峰為參照峰S,計(jì)算得到各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于2.0%,表明方法重復(fù)性良好。

    2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批飲片粉末(S1),按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定,以腺苷峰為參照峰S,計(jì)算得到各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于2.5%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.1.7 UPLC指紋圖譜的建立 取上述10批山藥生品和10批麩炒山藥飲片,按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,并按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》進(jìn)行分析,采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動(dòng)匹配(時(shí)間窗0.1 min),提取吸收信號(hào)較強(qiáng)、峰形明顯、穩(wěn)定性較好的共有峰,按中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜,結(jié)果見(jiàn)圖1~4。

    根據(jù)數(shù)據(jù)分析,10批山藥生品標(biāo)定了4個(gè)共有峰,10批麩炒山藥飲片標(biāo)定了7個(gè)共有峰,2號(hào)峰為腺苷峰,其分離度良好,峰面積較大,在圖譜中較穩(wěn)定且為所有樣品共有,所以確定腺苷為參照峰(S)。

    圖1 10批山藥生品的UPLC疊加圖譜

    2.1.8 指紋圖譜相似度計(jì)算 分別通過(guò)10批山藥和麩炒山藥生成的共有模式為對(duì)照指紋圖譜,計(jì)算各批次之間的相似度,結(jié)果見(jiàn)表2??梢?jiàn),10批次山藥生品與對(duì)照指紋圖譜的相似度范圍為0.997~1.000,10批次麩炒山藥飲片與對(duì)照指紋圖譜的相似度范圍為0.950~0.999,表明山藥與麩炒山藥質(zhì)量穩(wěn)定,生品與生品、炮制品與炮制品之間組內(nèi)組成成分差異小。

    圖2 10批麩炒山藥樣品的UPLC疊加圖譜

    圖3 山藥生品對(duì)照指紋圖譜

    圖4 麩炒山藥樣品對(duì)照指紋圖譜

    2.1.9 山藥麩炒前后UPLC指紋圖譜比較 取炮制用輔料麩皮,按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,并按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定,將圖譜結(jié)果與上述山藥、麩炒山藥UPLC指紋圖譜進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)圖5。

    表2 山藥生品及麩炒山藥飲片相似度

    圖5 山藥麩炒前后UPLC指紋圖譜比較

    可見(jiàn),麩炒后的山藥圖譜由5個(gè)共有峰增加至8個(gè)共有峰,其主要差異在a、b、c 3個(gè)區(qū)域。其中,a所示區(qū)域麩炒品中明顯增加了峰3,而山藥生品在該積分條件下未能識(shí)別,且輔料麥麩中響應(yīng)極低;b所示區(qū)域麩炒品中明顯增加了峰5,而山藥生品在該積分條件下未能識(shí)別,且輔料麥麩中無(wú)響應(yīng);c所示區(qū)域麩炒品中明顯增加了峰8,而山藥生品在該積分條件下未能識(shí)別,且輔料麥麩中響應(yīng)較低,進(jìn)一步說(shuō)明了麩炒前后山藥與麩炒山藥差異較大,表明該指紋圖譜方法能應(yīng)用于山藥與麩炒山藥的質(zhì)量控制。

    2.2 腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法

    2.2.1 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項(xiàng)下方法。

    2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 同“2.1.3”項(xiàng)下方法。

    2.2.3 色譜條件 同“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件。分別精密吸取腺苷對(duì)照品、山藥(S1)供試品和麩炒山藥(S11)供試品溶液 1 μL,進(jìn)樣測(cè)定,色譜圖見(jiàn)圖6。

    A.腺苷對(duì)照品; B.山藥樣品; C.麩炒山藥樣品; 1.腺苷。

    2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量,分別置10 mL容量瓶中,用10%甲醇稀釋至刻度,搖勻,制得質(zhì)量濃度分別為0.114、0.056 8、0.022 7、0.005 68、0.002 27、0.001 14 mg/mL的對(duì)照品溶液,按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜峰面積;以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=1.590×107x- 2.389×103,r=0.999 9,線性范圍為0.00 114~0.114 mg/mL。

    2.2.5 精密度試驗(yàn) 日內(nèi)精密度:取同一批飲片粉末(S1),按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液,并按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算得到腺苷峰面積RSD值為0.37%,表明儀器精密度良好。日間精密度:取同一批飲片粉末(S1),按“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液,分別在不同日期內(nèi)按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算得到腺苷峰面積RSD值為1.18%,表明儀器精密度良好。

    2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批飲片粉末(S1),按“2.2.1”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液,分別進(jìn)行測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算得到腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.337 mg/g,RSD值為0.37%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。

    2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批供試品溶液(S1),按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算得到腺苷峰面積的RSD值為0.71%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.2.8 回收率試驗(yàn) 取同一批(S1號(hào))已知含量的樣品約0.25 g,精密稱(chēng)定,按高、中、低3種濃度分別加入腺苷對(duì)照品溶液,分別“2.2.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。計(jì)算得到腺苷平均加樣回收率分別為104.65%,結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 腺苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

    2.3 尿囊素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法

    2.3.1 供試品溶液的制備 取飲片粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.5 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入稀乙醇25 mL,稱(chēng)定質(zhì)量,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

    2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取尿囊素對(duì)照品適量,加稀乙醇使溶解,定容至刻度,制成2.497 mg/mL尿囊素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

    2.3.3 色譜條件 色譜柱:Waters SPHERISORB NH2(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:乙腈-水(體積比90∶10);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):224 nm;進(jìn)樣量:10 μL。分別精密吸取尿囊素對(duì)照品、山藥(S1)供試品和麩炒山藥(S11)供試品溶液 10 μL,進(jìn)樣測(cè)定,色譜圖見(jiàn)圖7。

    2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液適量,分別置5、10、10、20、10、25 mL容量瓶中,用稀乙醇稀釋至濃度,搖勻,制得質(zhì)量濃度分別為1.248、0.624、0.250、0.125、0.075、0.030 mg/mL的對(duì)照品溶液,分別按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜峰面積;以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程y=1.824×106x+2.800×103,r=0.999 9,線性范圍為0.030 0~1.248 mg/mL。

    2.3.5 精密度試驗(yàn) 日內(nèi)精密度:取同一批飲片粉末(S1),按“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液,并按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算得到尿囊素峰面積RSD值為1.01%,表明儀器精密度良好。日間精密度:取同一批飲片粉末(S1),按“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液,分別在不同日期內(nèi)按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算得到尿囊素峰面積RSD值為1.28%,表明儀器精密度良好。

    A.尿囊素對(duì)照品; B.山藥樣品; C.麩炒山藥樣品; 2.尿囊素。

    2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批飲片粉末(S1),按“2.3.1”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液,分別進(jìn)行測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算得到尿囊素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.997 mg/g,RSD值為0.72%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。

    2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批供試品溶液(S1),按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算得到尿囊素峰面積的RSD值分別為1.03%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.3.8 回收率試驗(yàn) 取同一批(S1號(hào))已知含量的樣品約0.25 g,精密稱(chēng)定,按高、中、低 3 種濃度分別加入尿囊素對(duì)照品溶液,分別按“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果計(jì)算得到尿囊素的平均加樣回收率分別為 96.17%,見(jiàn)表4。

    2.4 樣品測(cè)定

    基于上述建立的腺苷及尿囊素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法,對(duì)10批山藥和10批麩炒山藥樣品進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算樣品中的腺苷、尿囊素的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見(jiàn)表5??梢?jiàn),山藥生品、麩炒山藥飲片中腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.196~0.421、0.260~0.410 mg/g,尿囊素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.200~9.160、6.240~8.340 mg/g。

    運(yùn)用SPSS22.0軟件對(duì)山藥生品和麩炒山藥尿囊素、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表6??梢?jiàn),山藥炒制前后尿囊素、腺苷含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表4 尿囊素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

    表5 山藥生品及麩炒山藥飲片中腺苷與尿囊素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

    表6 山藥及麩炒山藥腺苷、尿囊素含量獨(dú)立樣本檢驗(yàn)結(jié)果

    3 討論

    本文對(duì)山藥及麩炒山藥的含量測(cè)定方法及指紋圖譜進(jìn)行了研究,建立了山藥和麩炒山藥飲片UPLC指紋圖譜方法,可同時(shí)測(cè)定腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由于尿囊素極性較大,在反相色譜柱上保留時(shí)間極短,參考文獻(xiàn)[9-10]選用氨基柱進(jìn)行研究,考察不同乙腈-水比例對(duì)尿囊素分離度的影響,當(dāng)乙腈-水比例為(體積比90∶10)時(shí),能較好分離得到樣品中的尿囊素。

    曾對(duì)不同提取方法(超聲、回流)及不同提取溶劑(甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、稀乙醇)進(jìn)行考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用10%甲醇超聲提取的色譜圖信息量最多,峰響應(yīng)較高,且腺苷提取較充分,故選用10%甲醇超聲提取腺苷及指紋圖譜;采用稀乙醇超聲提取時(shí),尿囊素提取較充分,故選用稀乙醇超聲提取尿囊素。

    麥麩含有黃酮類(lèi)、尿囊素等多種成分,炮制過(guò)程可能會(huì)對(duì)山藥中尿囊素質(zhì)量分?jǐn)?shù)產(chǎn)生影響[11],而本文結(jié)果顯示麩炒后尿囊素、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯,可能與麥麩在炒制過(guò)程中,麥麩起中間傳熱作用有關(guān)。楊連菊等[12]發(fā)現(xiàn)麩炒前后山藥中的尿囊素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不大,與本文結(jié)論一致。另外,劉應(yīng)蛟等[13]比較不用炮制方法對(duì)山藥尿囊素、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響,發(fā)現(xiàn)麩炒后尿囊素、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯,而土炒后顯著增大,后續(xù)將對(duì)不同炮制方法下山藥有效成分的變化情況進(jìn)行研究。

    本研究試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),麩炒后山藥特征峰數(shù)量增多,說(shuō)明麩炒后山藥的成分出現(xiàn)一定的變化,在炮制輔料麥麩中能找到其增加3號(hào)、7號(hào)和8號(hào)色譜峰,不能找到5號(hào)色譜峰,說(shuō)明麩炒后增加的3號(hào)、7號(hào)和8號(hào)色譜峰可能由麥麩帶入;而增加的5號(hào)色譜峰,可能因加熱引起某些成分的轉(zhuǎn)化。結(jié)合炒制前后質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果,推測(cè)麩制后補(bǔ)益作用的增強(qiáng)可能不依賴(lài)尿囊素、腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,而麩炒的作用可能使二者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)維持在一定范圍內(nèi)發(fā)揮作用。另外,山藥歸脾、肺、腎經(jīng),而麥麩含有豐富的氨基酸等成分,麩制后可能作為引經(jīng)藥促進(jìn)山藥對(duì)脾胃的親和力,增強(qiáng)其補(bǔ)脾益肺的功效。

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