基于指紋圖譜與多元統(tǒng)計(jì)分析的梔子不同炮制品評(píng)價(jià)

黃躍前，程學(xué)仁，吳文平，朱德全，黃敏燁，楊曉東，羅宇琴，何廣銘

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244)

梔子為傳統(tǒng)藥食兩用資源，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》收載，梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)[2]，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，外用可消腫止痛，用于熱病心煩、濕熱黃疸、淋證澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡瘍；外治扭挫傷痛。每年9～11月對(duì)果實(shí)成熟呈紅黃色時(shí)的梔子進(jìn)行采收，除去果梗和雜質(zhì)，蒸至上氣或置沸水中略燙，取出，干燥。因梔子性味苦寒，容易對(duì)脾胃造成損傷，脾胃較弱者服后易吐，炒制后能降低這種弊端造成的傷害[3-5]，自漢代以來(lái)非常重視對(duì)梔子的炮制處理[6]?，F(xiàn)代常見(jiàn)的梔子炮制方法有清炒法(炒黃、炒焦、炒炭)、酒制法和姜制法等[7]，2015年版《中國(guó)藥典》收錄的炮制品有炒梔子與焦梔子[2]，炒梔子與焦梔子均以梔子照清炒法炮制，二者炒制程度不一樣；炒梔子藥效與梔子相近，而焦梔子涼血止血，并有較強(qiáng)的鎮(zhèn)靜和凝血作用。2015年版《中國(guó)藥典》僅對(duì)梔子、炒梔子與焦梔子的梔子苷含量進(jìn)行限定，不能全面反映梔子、炒梔子與焦梔子飲片的質(zhì)量。

本研究擬建立《中國(guó)藥典》2015年版收錄的梔子炮制品(梔子、炒梔子、焦梔子)的指紋圖譜方法，結(jié)合中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)與SIMCA-P對(duì)3者進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)及多元統(tǒng)計(jì)分析，找出各炮制品的差異組分，為梔子不同炮制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及質(zhì)量標(biāo)志物的選擇提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司)；YMC Triart C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)色譜柱；XP26型百萬(wàn)分之一分析天平、ME204E型萬(wàn)分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ500D型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(美國(guó)默克股份有限公司)。

1.2 試藥

梔子苷(批號(hào)110749-201718，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.6%)、西紅花苷-Ⅰ(批號(hào)111588-201303，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.6%)、西紅花苷-Ⅱ(批號(hào)111589-201705，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.2%)對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；京尼平龍膽雙糖苷(批號(hào)16120502，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.98%)由成都普菲德有限公司提供；甲醇為分析純；乙腈為色譜純；水為超純水。

10批梔子藥材(S01～S10)經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，均為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)，炒梔子(CS01～CS10)與焦梔子(JS01～JS10)是10批梔子藥材經(jīng)炮制得到的飲片，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 10批梔子藥材及其炮制品的來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子炮制品的制備

梔子：取10批梔子原藥材，揀去雜質(zhì)，碾碎。

炒梔子：取10批梔子原藥材，照清炒法(2015年版《中國(guó)藥典》四部通則0213)用文火加熱炒至黃褐色，取出，放涼，即炒梔子。

焦梔子：取10批梔子原藥材，照清炒法(2015年版《中國(guó)藥典》四部通則0213)用中火炒至表面焦褐色，果皮內(nèi)表面或種子表面為黃棕色或棕褐色，取出，放涼[5]，即焦梔子。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱定京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷-Ⅰ、梔子苷、西紅花苷-Ⅱ適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為115.2、42.6、259.3、40.6 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制

取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)適量，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 色譜條件

YMC Triart C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～5 min，5%～20%A；5.01～9.5 min，26%～40%；9.5～11 min，40%～90%A；11.01～18 min，5%A)；流速為0.4 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～6 min為238 nm，6～11 min為440 nm，11～18 min為238 nm。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 以同一供試品溶液按“2.4”項(xiàng)色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，以峰5(梔子苷)為參照峰(S)，計(jì)算其余各共有峰的相對(duì)峰面積RSD值范圍為0.27%～0.35%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 以同一供試品溶液按“2.4”項(xiàng)色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12 h后依次測(cè)定樣品，以峰5(梔子苷)為參照峰(S)，計(jì)算其余各共有峰的相對(duì)峰面積RSD值為0.16%～0.31%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S04樣品6份，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰5(梔子苷)為參照峰，計(jì)算其余各共有峰的相對(duì)峰面積RSD值為0.48%～0.63%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 梔子、炒梔子與焦梔子指紋圖譜的建立和共有峰的標(biāo)定

分別將梔子、炒梔子與焦梔子的UPLC結(jié)果的“.cdf”文件導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012年版)，以中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正再自動(dòng)峰匹配得到3種炮制品的指紋圖譜，其疊加圖見(jiàn)圖1，共有模式指紋圖譜見(jiàn)圖2。梔子、炒梔子與焦梔子均自動(dòng)匹配了7個(gè)共有峰，其中峰4、5、6、7經(jīng)與對(duì)照品比較，分別確認(rèn)為京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ。

分別將10批梔子、炒梔子與焦梔子的UPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，10批梔子的相似度在0.978～0.998之間；10批炒梔子的相似度在0.983～0.998之間；10批焦梔子的相似度在0.983～1.000之間，表明梔子各種炮制品的UPLC指紋圖譜相似度較高。

圖1 梔子(A)、炒梔子(B)與焦梔子(C)UPLC指紋圖譜疊加圖

2.7 偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

3種梔子炮制品的指紋圖譜相似度比較高，為了找出能區(qū)別不同炮制品的主要成分，取3種炮制品7個(gè)共有峰的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 12.0軟件，采用有監(jiān)督模式識(shí)別的OPLS-DA進(jìn)行考察，建立3組OPLS-DA模型。3種炮制品共有峰OPLS-DA得分圖見(jiàn)圖3。OPLS-DA模型中，R2X(cum)與R2Y(cum)分別表示在X軸方向和Y軸方向上，主成分1和主成分2對(duì)變量的解釋能力，Q2(cum)表示模型對(duì)分組的預(yù)測(cè)能力，3者數(shù)值越趨近于 1，模型的解釋與預(yù)測(cè)能力越強(qiáng)[8]。梔子與炒梔子、梔子與焦梔子、炒梔子與焦梔子的R2X(cum)分別為0.940、0.987和0.897，R2Y(cum)分別為0.800、0.818、0.702，說(shuō)明建立的3組OPLS-DA模型中的2個(gè)主成分均能有效解釋3種炮制品之間的差異；梔子與炒梔子、梔子與焦梔子、炒梔子與焦梔子的Q2(cum)分別為0.453、0.616和0.486，說(shuō)明該模型具有一定的預(yù)測(cè)能力。

A.對(duì)照品溶液； B.梔子； C.炒梔子； D.焦梔子； 峰4.京尼平龍膽雙糖苷； 峰5.梔子苷； 峰6.西紅花苷-Ⅰ； 峰7.西紅花苷-Ⅱ。

在建立的OPLS-DA模型下，可生成共有峰相對(duì)峰面積的S-plot圖，縱坐標(biāo) P(corr)代表每個(gè)組分的相關(guān)系數(shù)，P值的絕對(duì)值越大，對(duì)分組的貢獻(xiàn)就越大。由圖4可見(jiàn)，峰4[京尼平龍膽雙糖苷，P(corr)=0.392]和峰6[西紅花苷-Ι，P(corr)=0.302]對(duì)梔子與炒梔子分組貢獻(xiàn)最大；峰6[西紅花苷-Ι，P(corr)=0.809]和峰7[西紅花苷-Ⅱ，P(corr)=0.608]對(duì)梔子與焦梔子分組貢獻(xiàn)最大；峰6[西紅花苷-Ι，P(corr)=0.708]、峰7[西紅花苷-Ⅱ，P(corr)=0.547]和峰3[P(corr)=0.453]對(duì)炒梔子與焦梔子分組貢獻(xiàn)最大。

圖3 梔子與焦梔子(A)、梔子與炒梔子(B)、炒梔子與焦梔子(C)的OPLS-DA得分圖

使用變量權(quán)重值(variable importance inprojection，VIP)也可以篩選出對(duì)組間分類貢獻(xiàn)最大的組分。從圖5可見(jiàn)，峰6(西紅花苷-Ⅰ)對(duì)梔子與炒梔子、梔子與焦梔子、炒梔子與焦梔子的分組均有貢獻(xiàn)，VIP值分別為1.367、1.851、1.674；峰7(西紅花苷-Ⅱ)對(duì)梔子與焦梔子、炒梔子與焦梔子的分組有貢獻(xiàn)，VIP值分別為1.379、1.303；峰4(京尼平龍膽雙糖苷)對(duì)梔子與炒梔子的分組有貢獻(xiàn)，VIP值為1.807。篩選出來(lái)的有貢獻(xiàn)差異組分與S-plot得分圖所得結(jié)果一致。

A.梔子與炒梔子；B.梔子與焦梔子；C.炒梔子與焦梔子。

3 討論

本研究建立了梔子、炒梔子與焦梔子的UPLC指紋圖譜，3個(gè)指紋圖譜均標(biāo)識(shí)出了7個(gè)共有峰，其中峰4、5、6、7分別為京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ。梔子指紋圖譜的相似度在0.978以上，炒梔子指紋圖譜的相似度在0.983以上，焦梔子指紋圖譜的相似度在0.983以上。

A.梔子與炒梔子；B.梔子與焦梔子；C.炒梔子與焦梔子。

OPLS-DA分析可知，西紅花苷-Ⅰ在梔子與炒梔子、梔子與焦梔子、炒梔子與焦梔子均存在明顯差異，對(duì)區(qū)分3者貢獻(xiàn)最大。這可能與梔子在炒制過(guò)程中所用的火候有關(guān)，炒梔子所用的是文火，焦梔所用的是中火，不同的炒制溫度造成生品、炒黃品與炒焦品之間的差異。杜偉峰等[9]比較不同產(chǎn)地及其炮制品中綠原酸、梔子苷和西紅花苷-Ⅰ的量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的梔子經(jīng)炮制后3種成分的量均顯著下降，焦梔子中各成分的量較炒梔子更低，在炒梔子與焦梔子中均檢測(cè)不到西紅花苷-Ⅰ，可能是由于清炒以及炒焦時(shí)的高熱量導(dǎo)致這3種成分降解，焦梔子中西紅花苷-Ⅰ含量最低是由于其受熱的溫度和時(shí)間均大于炒梔子。付小梅等[10]在西紅花苷-I的穩(wěn)定性研究中發(fā)現(xiàn)西紅花苷-Ⅰ對(duì)溫度敏感，隨著溫度的升高其半衰期縮短。西紅花苷-Ⅰ是梔子黃色素的主要成分[12]，具有利膽、抗感染、抗氧化、抗腫瘤等作用[11-13]。2015年版《中國(guó)藥典》中梔子與炒梔子均屬于梔子的飲片，功效相同，均有抗感染、利膽等作用，而焦梔子僅保留涼血止血的功效[2]，這可能與其西紅花苷-Ⅰ的含量偏低有關(guān)。李水清等[14]認(rèn)為梔子生用善于清熱瀉火、涼血，而炒焦之后其收斂之性增強(qiáng)，增加了止血的功效。

本研究所建立的梔子不同炮制品的UPLC指紋圖譜，能有效體現(xiàn)梔子不同炮制品作用差異，可為梔子不同炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供一定的參考價(jià)值。