纖維基介孔SiO2藥物載體的構建及其釋藥性能

段紅梅，汪希銘，黃子欣，高 晶，王 璐

(東華大學 紡織學院，上海 201620)

近年來，慢性難愈合傷口給病患及醫(yī)療系統(tǒng)都帶來了沉重的負擔[1-2]，同時也是全世界非創(chuàng)傷性肢體截肢的主要原因[3]，傷口潰瘍病變嚴重時甚至會導致死亡。目前國際上對于慢性傷口尚無準確定義，根據(jù)我國醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)的一般標準，慢性傷口一般是指在4～8周內無法恢復解剖和功能上的完整性且容易復發(fā)的傷口[4]。針對慢性傷口的難愈性，藥物緩釋體系的建立顯得尤為重要。

自從Vallet-Regi等[5]在2001年報道了將有序介孔材料MCM-41作為新的藥物傳遞系統(tǒng)以來，該領域受到廣泛關注?，F(xiàn)有研究表明，介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs)在藥物遞送系統(tǒng)中具有十分突出的優(yōu)勢，主要包括良好的生物相容性、低細胞毒性、孔徑可調、粒徑均一、高比表面積、易于修飾的表面性質、高熱穩(wěn)定性以及化學穩(wěn)定性等[6-8]，這些特性賦予了介孔二氧化硅顆粒高效的藥物負載與釋放性能。Aghaei等[9]以介孔材料MCM-48為載體，以布洛芬作為藥物模型進行藥物釋放試驗，結果表明，布洛芬在15 d內呈現(xiàn)緩慢釋放趨勢，且無任何細胞毒性。

近年來，靜電紡納米纖維在藥物釋放系統(tǒng)中的應用日益廣泛，其纖維具有直徑細、比表面積大等結構特點[10]，使其作為藥物緩釋載體材料更有利于藥物的吸收與控制釋放[11-12]。此外，其小孔徑結構能夠有效阻隔外界微生物進入病灶部位；高孔隙率能夠保證創(chuàng)面與外界環(huán)境進行充分的液體和氣體交換，更利于維持創(chuàng)面愈合所需的濕度與氧氣含量[13]。Luo 等[14]制備了攜帶抗腫瘤藥物的殼核結構靜電紡纖維，并將纖維膜植入腫瘤位置。由于抗腫瘤藥物被包裹在纖維的內部，在藥物釋放中達到了緩釋的效果，避免了藥物突釋。動物試驗表明，其對腫瘤細胞增殖起到長期明顯的抑制作用，且副作用較小。

基于介孔納米顆粒和靜電紡絲纖維優(yōu)良的結構特征和藥物控釋能力，本文將二者結合，首先采用溶膠-凝膠法[15]制備MSNs，通過改變反應體系的pH值來探究MSNs的表面形貌與pH值的關系，從而優(yōu)化納米顆粒的結構尺度；而后將合成的MSNs利用超聲浸漬法負載抗菌藥物鹽酸環(huán)丙沙星(Cip)[16]，探討了藥物溶液濃度對藥物包封率和負載率的影響；最后，將一定質量分數(shù)的載藥MSNs與聚己內酯(PCL)紡絲液混合，通過靜電紡絲技術制備出Cip-MSNs/PCL復合納米纖維，分別探討了載藥MSNs和復合納米纖維膜中鹽酸環(huán)丙沙星的釋放行為，為針對慢性傷口的藥物緩釋系統(tǒng)的研究及在功能敷料中的應用提供了參考。

1 試驗部分

1.1 材料與儀器

材料：正硅酸乙酯(TEOS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氫氧化鈉、鹽酸環(huán)丙沙星一水合物(Cip)，均購于國藥集團化學試劑有限公司；聚己內酯(PCL，數(shù)均分子量為80 000)，購于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，購于上海泰坦科技股份有限公司。以上試劑均為分析純。磷酸鹽緩沖液(PBS)為實驗室自制。

儀器：集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南予華儀器有限公司；臺式高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；高壓靜電紡絲機，深圳通力微納科技有限公司;Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀，美國賽默飛世爾公司;JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM)，日本電子株式會社;D/max-2550VB/PC型X射線衍射儀(SEM)，日本島津公司;QuadraSorb SI型比表面積分析儀，美國康塔儀器公司; TM-3000型掃描電子顯微鏡，日本日立儀器公司; S-4800型能量色散X射線光譜儀，日本電子株式會社。

1.2 介孔二氧化硅納米顆粒的制備

采用溶膠-凝膠法制備稱取0.5 g CTAB溶于240 mL去離子水中，在40 ℃條件下攪拌，待溶液澄清后分別加入一定量的NaOH溶液，使溶液pH值分別為11.6、11.8和12.0，隨后將溫度升高至80 ℃；30 min后加入2.5 mL TEOS，80 ℃條件下繼續(xù)攪拌2 h；將得到的白色懸濁液靜置冷卻一段時間后，在9 000 r/min條件下離心，并用去離子水和無水乙醇反復洗滌3次，將得到的白色凝膠在真空干燥箱中干燥12 h，再將干燥后的樣品置于馬弗爐中高溫煅燒，在550 ℃條件下焙燒6 h后所得到的白色固體粉末即為介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs)。

1.3 載藥MSNs的制備

1.3.1 鹽酸環(huán)丙沙星的標準曲線

精確稱取鹽酸環(huán)丙沙星固體粉末20 mg于100 mL去離子水中，超聲分散均勻，將所得到的藥物溶液稀釋成合適的濃度梯度，使用紫外分光光度計測量各個濃度的Cip溶液在275 nm處的吸光度，由此得到Cip在水溶液中的標準曲線。鹽酸環(huán)丙沙星在pH=5.4的PBS緩沖液中的標準曲線依照同樣的方法得到。

1.3.2 鹽酸環(huán)丙沙星的載入

精確稱取30 mg合成的MSNs于18 mL水溶液中，超聲分散一段時間后分別加入一定量的Cip，使Cip的質量濃度分別為1、3、5、7、10、12 mg/mL，繼續(xù)超聲5 min后在避光環(huán)境中低速攪拌20 h，經高速離心后在37 ℃條件下真空干燥24 h，即得到載藥MSNs(Cip-MSNs)。取離心后的上清液合并定容并稀釋1 000倍，分別測量其在275 nm處的吸光度，得到殘余的Cip濃度。包封率(E)及載藥量(D)的計算公式[17]分別如式(1)、(2)所示。

(1)

(2)

式中：ma為上清液中藥物的質量，mg；mb為投入體系中藥物的質量，mg；mdl為載藥顆粒的質量，mg。

1.4 Cip-MSNs/PCL復合纖維膜的制備

1.4.1 紡絲液的配制

稱取一定量的載藥MSNs于DMF中，超聲分散一段時間后加入PCL及DCM，使溶液的質量濃度為0.15 g/mL，DCM與DMF的體積比為7∶3，改變MSNs的質量分數(shù)分別為3%、6%和9%。將配制好的溶液在室溫下攪拌12 h以獲得穩(wěn)定均勻的紡絲液。

1.4.2 靜電紡絲工藝

設置紡絲針頭到接收滾筒的距離為20 cm，紡絲電壓為16 kV，推注速度為1 mL/h，紡絲一段時間后得到一定厚度的載藥復合纖維膜(Cip-MSNs/PCL)。紡絲結束后，將制得的纖維膜放入37 ℃的真空干燥箱中干燥24 h，便于后續(xù)試驗。

1.5 藥物的體外釋放

在傷口愈合的炎性階段，由于細菌感染，創(chuàng)面環(huán)境呈酸性[18-19]，因此，本文中的藥物釋放試驗均模擬創(chuàng)面環(huán)境，在酸性條件下進行。

1.5.1 Cip-MSNs中藥物的體外釋放

配制pH=5.4的PBS緩沖液，精確稱取20 mg Cip-MSNs放入裝有5 mL PBS緩沖液的透析袋中，再將透析袋置于150 mL PBS中，在恒溫搖床中進行試驗，試驗條件為37 ℃和60 r/min。分別在一定時間間隔點取出5 mL釋放介質，稀釋至適宜濃度后測量其在275 nm處的吸光度，每次取出后同時補充相同體積、溫度以及pH值的PBS緩沖液。根據(jù)式(3)計算Cip的累積釋放率。

(3)

式中：Cn為第n個取樣時間點釋放介質中Cip的質量濃度，mg/mL；V為釋放時體系的恒定體積，mL；Ci為第i個取樣時間點釋放介質中Cip的質量濃度，mg/mL；Vi為每次測試時取出的介質體積，mL；m0為投入到釋放介質中的藥物質量，mg。

1.5.2 Cip-MSNs/PCL中藥物的體外釋放

將干燥好的復合纖維膜裁剪成相似形狀，質量控制為20 mg，置于離心管中，加入8 mL pH值為5.4的PBS緩沖液，放入同樣條件的恒溫搖床中進行試驗。分別在一定時間間隔取出1 mL釋放介質，其他操作同1.5.1節(jié)，并計算累積釋放率。

1.6 性能測試與表征

使用傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)對焙燒前后的介孔SiO2顆粒的化學組成進行表征，采用KBr壓片法進行測試。

使用透射電子顯微鏡(TEM)對介孔SiO2顆粒的結構及形貌進行直觀表征，將樣品超聲分散于乙醇介質中，滴于銅網上自然干燥后測試。

使用X射線衍射儀對合成的介孔SiO2進行小角X射線衍射(SAXD)試驗，掃描范圍為0.7°～6.0°。

使用比表面積分析儀對介孔SiO2的比表面積和孔徑進行分析。測試氛圍為氮氣，測試溫度為77 K，測試前樣品先進行真空脫氣處理[20]。

使用掃描電子顯微鏡(SEM)對制備的Cip-MSNs/PCL纖維膜的微觀形貌進行觀察，并使用Origin對數(shù)據(jù)進行分析。

使用能量色散X射線光譜儀(EDX)對Cip-MSNs/PCL纖維膜中的硅元素和氯元素進行表征。

2 結果與討論

2.1 MSNs的表征分析

2.1.1 pH值對MSNs形貌的影響

在MSNs合成過程中，通過改變加入NaOH溶液的量使體系在不同pH值條件下反應，所得產物的TEM照片如圖1所示?？梢钥闯觯趐H=11.6時，幾乎無法形成形貌規(guī)則的顆粒；隨著pH值的增大，MSNs的粒徑也隨之增加，且孔道結構逐漸清晰均勻。在pH=11.8時，由TEM觀察到的納米粒子的平均粒徑為(63±9)nm；在pH=12.0時，平均粒徑為(184±31)nm?？紤]到MSNs在靜電紡絲過程中的可操作性，采用粒徑較小的樣品進行后續(xù)試驗。

圖1 不同pH值條件下反應得到的MSNs的TEM照片F(xiàn)ig.1 TEM images of MSNs obtained by reaction at different pH value

2.1.4 載藥前后MSNs的紅外光譜分析

MSNs在550 ℃焙燒前后的紅外光譜圖如圖2所示?？梢钥闯?，焙燒前后的MSNs在801和1 091 cm-1處均有明顯吸收峰，對應的是Si—O—Si的伸縮振動；1 634和955 cm-1處的吸收峰來自水分子和Si—OH的伸縮振動。對比發(fā)現(xiàn)，焙燒后3 000～2 800 cm-1處的尖銳吸收峰基本消失，此處對應的是CTAB中C—H鍵的伸縮振動帶，表明本試驗采用的焙燒方法能基本去除模板劑分子，從而在二氧化硅納米顆粒中形成介孔孔道。

圖2 MSNs在550 ℃焙燒前后的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of MSNs before and after calcination at 550 ℃

2.1.4 載藥前后MSNs的XRD圖譜分析

MSNs的小角X射線衍射圖如圖3所示。在2θ為2.400°處出現(xiàn)衍射峰，說明此材料在一定尺度范圍內出現(xiàn)了規(guī)則排列的結構形態(tài)，存在一定的有序度。結合TEM測試結果分析，可證明該材料中介孔結構的存在。

圖3 MSNs的小角X射線衍射圖Fig.3 SAXD pattern of MSNs

2.1.4 MSNs的比表面積及孔徑分布

MSNs的氮氣吸脫附等溫線及孔徑分布曲線如圖4所示。由圖4(a)可看出，所制備樣品材料的氮氣吸脫附等溫線有一個較小的回滯環(huán)，屬于Ⅳ型等溫線，符合典型的介孔物質的吸附曲線。圖4(b)中縱坐標dV/dD代表孔容隨孔徑的變化率，可看出，樣品材料的孔徑大小較為集中。采用BET模型計算得到的比表面積和孔容分別為821.124 m2/g和0.646 cm3/g，介孔平均孔徑為3.537 nm，適合用作載體材料。

圖4 MSNs的氮氣吸脫附等溫線和孔徑分布圖Fig.4 N2 adsorption-desorption isotherms(a) and pore size distribution of MSNs(b)

2.2 MSNs的載藥性能

2.2.1 Cip的質量濃度-吸光度標準曲線

圖5示出Cip在水溶液和pH值為5.4的PBS緩沖液中的質量濃度(C)-吸光度(A)標準曲線，其線性方程分別為A=106.36C和A=103.76C，擬合度R2分別為0.999 95和0.999 99?？梢?，在這2種介質中，鹽酸環(huán)丙沙星溶液質量濃度與吸光度具有很好的線性相關性。

圖5 Cip在水溶液和pH=5.4的PBS緩沖液中的 標準曲線Fig.5 Standard curve of Cip in aqueous solution(a) and in pH=5.4 PBS buffer(b)

2.2.2 最佳藥物溶液質量濃度

藥物質量濃度梯度設置為1、3、5、7、10、12 mg/mL，分別對應的藥物包封率及載藥量曲線如圖6所示?？梢钥闯觯谒幬锶芤簼舛容^低時，MSNs的載藥量和包封率均隨著藥物溶液質量濃度的增加而增加，這是由載體與介質之間的濃度梯度決定的典型擴散作用，但當藥物溶液質量濃度進一步增加時，二者均出現(xiàn)下降的趨勢，這可能是由于溶液中藥物分子質量濃度過高而形成的二聚體甚至體積較大的多聚體，由此形成的空間位阻效應阻礙了藥物順利進入介孔孔道的緣故[21]。在Cip質量濃度達到7 mg/mL時，測得載藥量為51.5%，包封率為11.4%，均達到相對較高水平。

圖6 藥物溶液質量濃度對MSNs包封率和 載藥量的影響Fig.6 Effect of drug solution concentration on encapsulation efficiency and drug loading of MSNs

2.3 Cip-MSNs/PCL纖維膜的表征分析

2.3.1 MSNs含量對纖維膜表觀形貌的影響

在紡絲液中分別加入質量分數(shù)為3%、6%及9%的MSNs進行靜電紡絲，纖維膜的纖維形貌及直徑分布如圖7所示?？梢钥闯觯w維在3種不同MSNs質量分數(shù)的條件下均呈現(xiàn)表面光滑、平直連續(xù)的狀態(tài)。隨著MSNs質量分數(shù)的增加，纖維直徑呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，分別為1.50±0.27、1.36 ± 0.23及(1.32±0.45) μm。這主要是因為MSNs的引入破壞了PCL鏈之間的分子間相互作用和鏈纏結，降低了紡絲液的黏度，使紡絲液的電導率增加，射流受到較大的電場力作用拉伸，因此，得到的纖維直徑變小[22]。綜合考慮纖維的細度及均勻度，選擇質量分數(shù)為6%的MSNs作為后續(xù)試驗的紡絲條件。

圖7 不同MSNs質量分數(shù)Cip-MSNs/PCL復合 纖維膜的SEM照片F(xiàn)ig.7 SEM images of Cip-MSNs/PCL composite fiber membrane with different MSNs mass fraction

2.3.2 藥物小分子的分布

Cip-MSNs/PCL復合纖維膜的EDX圖譜如圖8所示，可直觀地表征藥物分子在纖維膜中的分布情況。以藥物Cip為例，由于藥物Cip中含有特征性F元素，因此可以根據(jù)F元素的分布狀況來觀察Cip的分布。如圖8(b)所示，F(xiàn)元素呈均勻分布，表明Cip在纖維膜中呈現(xiàn)高度分散的均勻分布。同樣從圖8(a)中可看出，MSNs在纖維膜中分布均勻。

圖8 Cip-MSNs/PCL復合纖維膜的EDX圖譜Fig.8 EDX analysis of Cip-MSNs/PCL composite fiber membrane. (a) Distribution of Si; (b)Distribution of F

2.4 藥物Cip的釋放行為與釋放機制

酸性條件下，Cip分別在MSNs和MSNs/PCL纖維膜中的釋放行為如圖9所示。由圖可知，Cip在2種藥物載體中的釋放趨勢基本一致。在最初的0.5 h內藥物釋放速率較快，在MSNs和MSNs/PCL纖維膜中Cip的累積釋放率分別為10.72%和6.09%；12 h內的累積釋放率分別達到55.51%和16.53%，藥物在纖維膜中的釋放率由于纖維結構的包裹遠低于MSNs中的釋放率；此后Cip在2種藥物載體中緩慢釋放，在72 h時Cip的累積釋放率分別達到69.16%和21.44%，纖維結構中的藥物釋放率僅為MSNs中的1/3；隨著時間的推移，纖維中的Cip將繼續(xù)緩慢釋放，達到長效抗菌的目的。

圖9 不同藥物載體中Cip的釋放曲線Fig.9 In vitro release profile of Cip in different drug carriers

為進一步探索藥物Cip在2種載體中的釋放機制，采用Ritger-Peppas模型(式(4))對藥物釋放結果進行擬合，結果如圖10所示。

(4)

式中：Mt為t時刻時釋放藥物的質量；M∞為t無窮大時釋放藥物的質量；k為常數(shù)，表示釋放系統(tǒng)的結構和幾何特征；n為釋放指數(shù)，用以表征藥物釋放的機制。

圖10 不同載體中藥物Cip釋放動力學模型擬合Fig.10 Fitting of kinetic model of drug Cip release in different carriers

在使用Ritger-Peppas模型進行擬合的過程中，當n≤0.45時，藥物釋放機制為Fick擴散；當n≥0.89時，藥物釋放以骨架溶蝕為主；當0.45

3 結 論

1)采用溶膠-凝膠法制備了MSNs，并探究了反應體系pH值對MSNs表觀形貌的影響，發(fā)現(xiàn)其粒徑大小隨pH值的增大而增大。

2)MSNs負載抗菌藥物鹽酸環(huán)丙沙星的試驗結果表明，當鹽酸環(huán)丙沙星的質量濃度為7 mg/mL時，MSNs的載藥量可以達到51.5%，包封率為11.4%，表現(xiàn)出良好的載藥性能。

3)采用靜電紡絲技術將載藥MSNs紡入PCL納米纖維中，得到Cip-MSNs/PCL復合纖維膜，研究發(fā)現(xiàn)，當載藥MSNs質量分數(shù)為6%時得到的纖維較為均勻，藥物小分子在纖維膜中呈現(xiàn)出均勻分布的特征。

4)Cip-MSNs顆粒和Cip-MSNs/PCL復合纖維膜在酸性條件下的藥物釋放試驗結果表明，鹽酸環(huán)丙沙星在2種載體中的釋放趨勢基本一致，在最初的0.5 h內釋放較快，在MSNs和MSNs/PCL纖維膜中Cip的累積釋放率分別為10.72%和6.09%；12 h內的累積釋放率分別達到55.51%和16.53%；72 h后藥物仍有緩慢釋放，但纖維結構中的藥物釋放率遠低于MSNs中藥物的釋放率。

5)使用 Ritger-Peppas模型對2種藥物釋放模型進行動力學研究，結果表明，擴散是藥物在2種載體中釋放的主要機制。

具有緩釋性能的藥物釋放模型在慢性傷口的治療中研究非常廣泛，本文所制備的復合纖維膜藥物釋放模型有望在功能性敷料中得到應用，后續(xù)有待更深入地研究。