姜黃素生物粘附微球的制備工藝及體外性質(zhì)研究

安蕓，賈莉，李蕾，張?zhí)m英

（1菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校；2山東丹紅制藥有限公司，山東 菏澤 274000）

生物粘附微球是通過將藥物分散或吸附于具有生物粘附作用的高分子材料制備成的微球表面，利用材料的粘附作用，延長和增加與人體粘膜的接觸時(shí)間和面積，從而達(dá)到緩定位、緩釋、提高生物利用度的目的[1-2]。姜黃素（Curcumin）是從姜科姜黃屬植物姜黃（Curcuma longae L）的干燥根莖中提取的具有β-二酮結(jié)構(gòu)的多酚類化合物。姜黃素雖具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血脂等廣泛的藥理作用，但因其水溶性差，體外易氧化、直接口服生物利用度低（約89%以原形藥物排除）等原因，極大地限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用[3-6]。本研究選用卡波姆934P為粘附材料，乙基纖維素為緩釋材料，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備姜黃素-卡波姆-乙基纖維素生物粘附微球（Cur-Cb-EC），單因素考察制備工藝，評價(jià)其體外釋放度、生物粘附性等，為姜黃素生物粘附微球的開發(fā)和應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪高科儀器廠）；ZRS-8智能溶出試驗(yàn)儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；TU-1900紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SHZ-CB型循環(huán)水式多用真空泵（河南鞏義市英峪予華儀器廠）；超聲波分散儀（昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；微孔濾膜（上海興亞凈化材料廠）

1.2 試藥和動(dòng)物 姜黃素對照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黃素（濟(jì)南圣和化工有限公司）；卡波姆934P（武漢市合中生化制造有限公司）；乙基纖維素（泰安瑞泰纖維素有限公司）；液體石蠟（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；Span-85（天津希恩思生化科技有限公司）；石油醚（上海麥克林生化科技有限公司）；無水乙醇及其他分析純試劑（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；SD大鼠（濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。

2 方法

2.1 姜黃素體外分析方法建立（1）確定最大吸收波長：稱取適量姜黃素對照品，溶于無水乙醇，配制姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用紫外可見分光光度法，在200～800 nm內(nèi)，掃描姜黃素、卡波姆和乙基纖維素的紫外吸收光譜。姜黃素在423 nm處有最大吸收。因此確定測定波長為423 nm。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：精密稱取姜黃素對照品10.0 mg置于10 ml容量瓶中，加入無水乙醇定容，得姜黃素母液（1.0 mg/ml）。取姜黃素母液，配制成濃度分別為 1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、15.0 μg/ml的7份姜黃素溶液，在423 nm處測定吸光度值A(chǔ)。以吸光度值對姜黃素濃度（C）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并回歸方程。

取高中低三個(gè)濃度的溶液，連續(xù)3天，每天分別平行測定3次，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。精密量取姜黃素母液，與卡波姆934P、乙基纖維素適量混合于100 ml容量瓶中，超聲溶液，定容，0.45 μm濾膜過濾后，于423 nm處測定吸光度值，計(jì)算回收率。

2.2 姜黃素生物粘附微球制備 取一定比例混合的卡波姆934P與乙基纖維素2 g，分散于無水乙醇50 ml中，靜置，待溶液出現(xiàn)半透明狀后攪拌均勻，加入姜黃素適量。在室溫、攪拌條件下，將上述混懸液緩慢滴加至含有Span-85的液體石蠟中進(jìn)行乳化。室溫?cái)嚢柚劣袡C(jī)溶劑揮干，抽濾，石油醚洗滌3次，室溫真空干燥24 h，篩分，即得姜黃素生物粘附微球。

2.3 載藥量及包封率測定 取姜黃素生物粘附微球，研細(xì)，精密稱取20 mg，置于50 ml容量瓶中，無水乙醇溶解并定容，得樣品溶液。樣品溶液過0.45 μm濾膜過濾后，測定吸光度值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到質(zhì)量。按下列公示計(jì)算載藥量和包封率。

載藥量=生物粘附微球中所含姜黃素的量/微球總重量×100%

包封率=生物粘附微球中所含姜黃素的量/制備時(shí)投入姜黃素的量×100%

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)考察姜黃素生物粘附微球的制備工藝（1）姜黃素加入量：固定其他因素，考察姜黃素加入量分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g時(shí)，對包封率和載藥量及球形的影響。（2）卡波姆934P和乙基纖維素比例：固定其他因素，考察卡波姆934P和乙基纖維素質(zhì)量比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3時(shí)，對生物粘附微球載藥量、包封率和成球效果的影響。（3）Span85濃度的影響：固定其他因素，考察Span 85濃度分別為1%、2%、4%、6%、8%時(shí)，對生物粘附微球載藥量、包封率和成球效果的影響。

2.5 姜黃素生物粘附微球理化性質(zhì)和體外釋藥曲線測定 按照單因素考察最佳制備工藝制備姜黃素生物粘附微球，測定粒徑分布、松密度和休止角。

按照單因素考察最佳制備工藝制備A、B、C三批姜黃素生物粘附微球，參照《中國藥典》（2015年版）釋放度測定第二法“漿法”測定姜黃素生物粘附微球的釋放度：測定溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為75 r/min，溶出介質(zhì)為人工胃液（0.1 mol/L鹽酸溶液，含0.4%吐溫80）900 ml，取樣時(shí)間為0.5、1、2、3、4、6、8、12 h，取樣量為5 ml，取樣同時(shí)補(bǔ)充相同體積溶出介質(zhì)，樣品過濾膜過濾后于423 nm處測定吸光度值，計(jì)算藥物累計(jì)釋放度，繪制體外釋藥曲線，與零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和Higuchi方程擬合。

2.6 生物粘附微球粘附性測定 采用胃黏膜沖洗法[7-8]離體測定生物粘附微球粘附性。取SD大鼠10只，禁食24 h，處死取胃，自胃小彎處剪開，用pH 1.3的鹽酸-氯化鈉溶液（鹽酸7 ml與氯化鈉2.0 g，加水至1000 ml）沖洗胃內(nèi)容物，剪成1 cm×2 cm，鋪于載玻片上。取最優(yōu)工藝制備的姜黃素生物粘附微球30 mg，均勻鋪在固定好的胃粘膜上，生理鹽水潤濕后，置于裝有飽和硝酸鉀（相對濕度為92.5%）的密封容器內(nèi)，使微球充分水化。保濕20 min后，將其45°傾斜，用pH 1.3的鹽酸-氯化鈉溶液沖洗胃粘膜表面5 min，收集沖洗液，定容后測定沖洗液中姜黃素的量，即可計(jì)算得到胃粘膜上姜黃素滯留率。以相同量的姜黃素原料藥為對照實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素體外分析方法建立 通過掃描紫外吸收光譜，確定姜黃素在423 nm處有最大吸收。因此確定測定波長為423 nm。結(jié)果表明姜黃素在1.0～15.0 μg/ml的范圍內(nèi)，回歸方程為：A=0.124C+0.0622，R2=0.9995，線性關(guān)系良好，見圖1?？疾旖S素體外分析方法日內(nèi)和日間精密度，分別為（1.02±0.56）%和（1.67±0.55）%，均符合要求；計(jì)算回收率，符合測定要求。

圖1 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程

3.2 考察姜黃素生物粘附微球的制備工藝考察 見表1、2、3。

表1 姜黃素加入量對載藥量、包封率和成球效果的影響

隨著姜黃素加入量增加，載藥量和包封率均升高，當(dāng)姜黃素的加入量大于0.8 g時(shí)，成球效果降低，因此確定姜黃素加入量為0.6 g。

表2 卡波姆和乙基纖維素的比例對載藥量、包封率和成球效果的影響

卡波姆∶乙基纖維素加入比例對生物粘附微球的載藥量、包封率和成球效果影響較大，當(dāng)兩者質(zhì)量比為1∶1時(shí)，載藥量、包封率及成球效率均較理想。

表3 Span85的濃度對載藥量、包封率和成球效果的影響

Span85作為乳化劑，其用量對載藥量和包封率就有較大影響，當(dāng)Span 85濃度為2%時(shí)，載藥量、包封率及成球效率均較理想。

3.3 姜黃素生物粘附微球的理化性質(zhì)考察 采用篩分法測定粒徑分布為335～920 μm的微球占89.92%；光學(xué)顯微鏡計(jì)算平均算術(shù)徑為658.78 μm；量筒法測定松密度為（0.564±0.003）g/ml；漏斗法測定休止角為（16.53±0.08）°。

A、B、C三批姜黃素生物粘附微球在人工胃液中12 h累積釋放度為（92.97±2.31）%。姜黃素生物粘附微球體外釋藥行與Higuchi方程擬合結(jié)果為Q=84.234+5.2344 t1/2，r=0.8945，說明姜黃素生物粘附微球具有緩釋特征。見如圖2。

圖2 姜黃素生物粘附微球的溶出曲線

3.4 生物粘附微球粘附性測定 生物粘附微球粘附性測定結(jié)果如圖3所示。姜黃素生物粘附微球滯留率為（86.34±9.85）%，與姜黃素原料藥的滯留率（32.3±10.92）%相比，具有顯著性差異（P＜0.0001）。

圖3 姜黃素生物粘附微球粘附性測定

4 討論

生物粘附微球是通過生物粘附性粘附于黏膜表面而發(fā)揮療效的藥物制劑，具有定位、緩釋、提高生物利用度等獨(dú)特的優(yōu)勢[9]。隨著高分子藥用輔料的不斷發(fā)展，生物粘附性材料的不斷涌現(xiàn)，進(jìn)一步促進(jìn)了生物粘附給藥系統(tǒng)的深入發(fā)展[10]。生物粘附微球是一種兼顧生物粘附特征的微球，具有獨(dú)特優(yōu)勢，但其制備方法和工藝對載藥量、包封率及成球效果影響較大。

本研究采用乳化-溶劑揮發(fā)法，單因素實(shí)驗(yàn)考察了姜黃素生物粘附微球制備過程中姜黃素加入量、卡波姆和乙基纖維素及乳化劑Span85濃度3個(gè)因素，得到最佳制備工藝；所得姜黃素生物粘附微球載藥量和包封率較高，成球效果較好，相應(yīng)理化性質(zhì)符合生物粘附性給藥系統(tǒng)的要求，具有緩釋效果，累積釋放度符合要求；與姜黃素原料藥相比，姜黃素生物粘附微球的胃內(nèi)滯留率顯著提高，具有生物粘附性特征。本研究為姜黃素及生物粘附微球的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。