淺談冷凍切片中冰晶的形成和解決方法

范冬梅，許宏烽，沈溪明

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510000)

0 引言

冷凍切片，是通過(guò)各種方法使組織快速降溫后，冷凍成具有一定硬度，切出薄片在顯微鏡下進(jìn)行觀察得出病理診斷結(jié)果[1]。術(shù)中冷凍切片，可為臨床醫(yī)生提供病理診斷結(jié)果以決定手術(shù)方式，因此高質(zhì)量的冷凍切片為病理報(bào)告的準(zhǔn)確性提供可靠的依據(jù)，而低質(zhì)量的冷凍切片往往會(huì)給病理醫(yī)生造成診斷困難，甚至?xí)鹫`診[2-4]。冷凍切片中冰晶形成，是冷凍切片最難避免、也是最容易影響診斷的問(wèn)題之一。冷凍組織迅速玻璃化對(duì)減少冷凍切片中冰晶的形成至關(guān)重要，冰晶的形成一般在切片的空白區(qū)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)空泡增多。鏡下顯示：組織擠壓、形態(tài)難辨，其間夾雜有大小、形態(tài)不一的空隙，給診斷造成困難[5]。如何減少術(shù)中冷凍切片冰晶的形成，一直以來(lái)都是病理技術(shù)員需要克服的一個(gè)技術(shù)難題。本文根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，分享一些減少冰晶形成的解決方法，來(lái)提高冷凍切片質(zhì)量，以期為病理醫(yī)師精確診斷和臨床醫(yī)生選擇手術(shù)方案提供可靠保證。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本

選取我院病理科2020年11月至2020年12月間符合冷凍切片標(biāo)準(zhǔn)的新鮮組織(包括肝、腎、乳腺等組織)。

1.2 器械設(shè)備

LEICA CM1950 冷凍切片機(jī)、OCT包埋劑、樣本托、冷凍錘、一次性刀片、毛筆、載玻片、NQ100冷凍染色機(jī)，顯微鏡。

1.3 方法

分別從組織取材厚度、有無(wú)吸干組織水分、加入OCT包埋劑的量、組織冷凍方式、組織粗修深度和復(fù)溫等多個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，鏡下觀察切片中冰晶形成情況。

1.3.1 組織取材厚度

將新鮮組織標(biāo)本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度分別為0.3cm和0.5cm(用濾紙吸干組織表面水分)，冷凍切片機(jī)機(jī)箱溫度設(shè)置在-20℃～-15℃，將兩組組織放在加了包埋劑的樣本托上，再用冷凍錘速凍壓平，取下托盤(pán)架固定到冷凍切片機(jī)的冷凍頭上開(kāi)始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進(jìn)行固定，之后放在NQ100冷凍染色機(jī)上進(jìn)行常規(guī)HE染色，最后中性樹(shù)膠封片。

1.3.2 有無(wú)對(duì)組織水分進(jìn)行吸干

將新鮮組織標(biāo)本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均為0.3cm，一組對(duì)組織表面水分使用濾紙吸干，另一組不進(jìn)行處理，將兩組組織放在加了包埋劑的樣本托上，再用冷凍錘速凍壓平，取下托盤(pán)架固定到冷凍切片機(jī)的冷凍頭上開(kāi)始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進(jìn)行固定，之后放在NQ100冷凍染色機(jī)上進(jìn)行常規(guī)HE染色，最后中性樹(shù)膠封片。

1.3.3 加入OCT包埋劑的量

將新鮮組織標(biāo)本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均為0.3cm(用濾紙吸干組織表面水分)，一組在組織包埋時(shí)加入適量的OCT包埋劑在其表面，可明顯看到冷凍組織，另一組則加入過(guò)量的OCT包埋劑，使其覆蓋充滿組織表面，無(wú)法看清組織，再用冷凍錘速凍壓平，取下托盤(pán)架固定到冷凍切片機(jī)的冷凍頭上開(kāi)始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進(jìn)行固定，之后放在NQ100冷凍染色機(jī)上進(jìn)行常規(guī)HE染色，最后中性樹(shù)膠封片。

1.3.4 組織冷凍速度

將新鮮組織標(biāo)本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均為0.3cm(用濾紙吸干組織表面水分)，將兩組組織放在加了包埋劑的樣本托上，一組使用冷凍錘對(duì)組織進(jìn)行速凍壓平，另一組不使用冷凍錘，使其自然冷凍，取下托盤(pán)架固定到冷凍切片機(jī)的冷凍頭上開(kāi)始切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進(jìn)行固定，之后放在NQ100冷凍染色機(jī)上進(jìn)行常規(guī)HE染色，最后中性樹(shù)膠封片。

1.3.5 組織粗修深度

將新鮮組織標(biāo)本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均為0.3cm(用濾紙吸干組織表面水分)，將組織放在加了包埋劑的樣本托上，再用冷凍錘速凍，取下托盤(pán)架固定到冷凍切片機(jī)的冷凍頭上開(kāi)始切片，選取表面和不同粗修深度的組織切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進(jìn)行固定，之后放在NQ100冷凍染色機(jī)上進(jìn)行常規(guī)HE染色，最后中性樹(shù)膠封片。

1.3.6 復(fù)溫

將新鮮組織標(biāo)本均以1.5cm×1.5cm取材，取材厚度均為0.3cm(用濾紙吸干組織表面水分)，將組織放在加了包埋劑的樣本托上，再用冷凍錘速凍，選取用手捂(手指輕輕覆蓋1-2秒)組織升溫和不進(jìn)行升溫的組織切片，用3%乙醇冰醋酸固定液進(jìn)行固定，之后放在NQ100冷凍染色機(jī)上進(jìn)行常規(guī)HE染色，最后中性樹(shù)膠封片。

1.4 結(jié)果觀察

由兩名主治以上醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片，鏡下觀察，觀察整張切片中有無(wú)冰晶形成的區(qū)域及冰晶形成的位置。

2 結(jié)果

當(dāng)取材厚度為0.3cm，用濾紙吸干組織表面水分，加入適量的OCT包埋劑，用冷凍錘加速冷凍組織和選取表面組織切片時(shí)，鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)基本完整，薄厚均勻，紅藍(lán)對(duì)比鮮明，透明度較好，極少有冰晶形成，當(dāng)取材厚度為0.5cm、過(guò)量的OCT包埋劑、不使用冷凍錘速凍組織和粗修過(guò)深都會(huì)影響冰晶的形成，導(dǎo)致組織切片中出現(xiàn)空洞及輕微裂隙，使鏡下觀察時(shí)組織形態(tài)變形，難以辨認(rèn)(如圖1、圖2和圖3)。當(dāng)組織質(zhì)地較脆時(shí)，選擇適宜的溫度或粗修之后用手捂組織稍復(fù)溫后進(jìn)行切片，組織結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)基本完整，薄厚均勻，紅藍(lán)對(duì)比鮮明，透明度較好，若未使用復(fù)溫方式切片會(huì)影響切片質(zhì)量(如圖4)，但組織中水分凍融后二次結(jié)晶，會(huì)容易形成大量不規(guī)則分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和核內(nèi)的冰晶(如圖2和圖3)。

3 討論

新鮮組織不經(jīng)任何固定脫水等處理，直接在低溫恒冷切片機(jī)冷凍后馬上進(jìn)行切片，稱(chēng)為冷凍切片。冷凍組織制片的原理是利用物理降溫的方法，借助冷凍切片機(jī)的低溫來(lái)迅速冷凍組織，使組織在短時(shí)間變硬，以用于制備冷凍切片[4]。目前，手術(shù)中需要病理診斷的手術(shù)病例逐年增多，臨床手術(shù)醫(yī)生對(duì)術(shù)中病理報(bào)告的依賴(lài)性也有所增加，所以冷凍切片的質(zhì)量是手術(shù)中病理診斷的重要保證。理想的切片應(yīng)做到切片完整、較薄和均勻、無(wú)皺折、無(wú)刀痕、貼片恰當(dāng)。冷凍切片時(shí)每個(gè)操作都能影響冰晶的形成，從而影響制片質(zhì)量及病理診斷。如何制作出一張能符合診斷要求的高質(zhì)量冷凍切片，需要病理技術(shù)員有豐富的切片經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)以及把控切片制作全過(guò)程。

水冷凍凝結(jié)成為固態(tài)有兩種主要形式：晶體態(tài)(結(jié)晶成核轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)整排列固體的形式)和玻璃態(tài)(無(wú)序固體的形式)。玻璃化是指水轉(zhuǎn)化為非晶體(玻璃態(tài))的固化過(guò)程，其本質(zhì)是冷凍固化溫度降得足夠快時(shí)，水不經(jīng)歷結(jié)晶過(guò)程而直接變成過(guò)冷液體，最終形成玻璃態(tài)。冷凍組織迅速玻璃化對(duì)保證冷凍切片組織形態(tài)至關(guān)重要[5,6]。

在實(shí)際的冷凍切片制片工作中，導(dǎo)致冷凍組織冰晶形成的因素有多種，不同的因素均可不同程度地導(dǎo)致冰晶的形成，在組織進(jìn)行冷凍的過(guò)程中，如果緩慢冷凍，組織中的水分會(huì)逐漸聚集形成冰晶的晶核，并與周?chē)乃肿永^續(xù)凝結(jié)，形成更大的水分子，一旦冰晶形成，便會(huì)對(duì)周?chē)慕M織細(xì)胞進(jìn)行擠壓、破壞，導(dǎo)致組織細(xì)胞形態(tài)破壞[7,8]。冷凍切片中常見(jiàn)的冰晶為細(xì)胞外冰晶和細(xì)胞內(nèi)冰晶，細(xì)胞外冰晶出現(xiàn)在細(xì)胞外，形態(tài)表現(xiàn)為不規(guī)則透明間隙，同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞收縮，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變形，細(xì)胞的收縮導(dǎo)致冷凍切片染色不佳。細(xì)胞內(nèi)冰晶出現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)，以出現(xiàn)的的部位不同，可以分為胞質(zhì)內(nèi)冰晶和胞核內(nèi)冰晶，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，一般僅僅對(duì)細(xì)胞的局部結(jié)構(gòu)造成擠壓，細(xì)胞局部形態(tài)收到影響，但整個(gè)細(xì)胞不出現(xiàn)明顯收縮，組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)不出現(xiàn)明顯變形。在生物體內(nèi)，細(xì)胞中水中占80%～90%，水在各種組織中含量最多，我們對(duì)組織中的水分進(jìn)行吸干，可以減少組織中的水分含量，進(jìn)而減少冰晶的形成，由于我們?nèi)粘Ｊ褂玫睦鋬鰳颖就休^小，含有的致冷能量較少，使用冷凍錘致冷時(shí)，可以使組織溫度迅速降低，加快組織冷凍速率，此外，組織厚度較薄以及適量的包埋劑均可使組織溫度迅速降低，抑制晶核的形成，減少冰晶的形成，對(duì)于同一冷凍組織，在組織進(jìn)行速凍時(shí)，表層的組織迅速降低，先冷凍凝固，內(nèi)層組織溫度逐漸降低，導(dǎo)致組織表面與內(nèi)層在冷凍速度上存在差異，使得內(nèi)部組織有時(shí)間形成晶核，進(jìn)而形成冰晶，導(dǎo)致組織內(nèi)部存在冰晶，在鏡檢組織切片時(shí)，可以看到細(xì)胞之間以及細(xì)胞內(nèi)部存在空洞，破壞了組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。因此，對(duì)冷凍組織取材厚度適中，對(duì)組織表面的體液或水分進(jìn)行吸干處理，加入適量的冷凍包埋劑，并利用冷凍錘對(duì)組織進(jìn)行壓平、速凍后，盡可能切全后切取表層組織，選擇合適的溫度和復(fù)溫進(jìn)行染色制片所制得的切片效果最佳，避免對(duì)組織進(jìn)行粗修、深切，既可減少組織切片中的冰晶影響，又可減少組織損耗，特別是對(duì)于腫瘤病灶較小的組織，可以盡可能保留病變組織用于冷凍后石蠟切片的常規(guī)HE染色及免疫組化染色診斷。