流蘇石斛多糖抗氧化活性研究

萬(wàn)代林, 李秀芳, 李強(qiáng)明, 羅建平

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

石斛屬蘭科石斛屬,是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兼用中藥材,具有益胃生津、滋陰清熱、保肝明目等功效[1]。研究顯示,多糖是石斛發(fā)揮功效的主要活性成分之一,具有顯著的抗氧化作用[2-5]。不同來(lái)源多糖的藥理學(xué)研究表明,多糖對(duì)機(jī)體健康的保護(hù)作用與其抗氧化活性密切相關(guān),多糖可通過減輕活性氧自由基對(duì)機(jī)體的過氧化損傷,達(dá)到抗腫瘤、抗衰老、保護(hù)肝臟、改善心腦系統(tǒng)狀態(tài)等作用[6-7]。流蘇石斛是2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的常用藥用石斛之一[8],但其抗氧化作用鮮有報(bào)道。本文以流蘇石斛多糖(polysaccharides fromDendrobiumfimbriatumHook.,DFP)為材料,以ABTS、DPPH和·OH自由基的清除能力為指標(biāo),測(cè)定流蘇石斛多糖的體外抗氧化活性;并以糖尿病小鼠為模型,以抗超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力和抗還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的量為指標(biāo),研究流蘇石斛多糖對(duì)糖尿病小鼠肝臟和腎臟組織的抗氧化保護(hù)作用,以期為流蘇石斛多糖在抗氧化功能性食品方面的合理開發(fā)提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 動(dòng)物

昆明健康雄性小鼠,體質(zhì)量為(22±2) g,SPF級(jí),購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào)為SCXK(皖)2005-001。

1.2 藥品與試劑

流蘇石斛購(gòu)于西雙版納銀海福林藥業(yè)有限公司;ABTS購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;DPPH購(gòu)置梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司;四氧嘧啶購(gòu)置Sigma公司;鹽酸二甲雙胍購(gòu)于天津太平洋制藥有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

Hei-VAP Advantage旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司)、CT15RT高速冷凍離心機(jī)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)、V1100型分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)、LBJ-18S原位真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)、MVS-1漩渦混合器(北京金紫光科技發(fā)展有限公司)、ACCU-CHEK羅氏血糖儀(北京宏康華泰科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 流蘇石斛多糖的提取

流蘇石斛莖干粉經(jīng)80%～95%乙醇脫脂干燥后,按料液比1∶30加入蒸餾水,100 ℃攪拌提取30 min,重復(fù)2次。提取液在60 ℃下減壓濃縮,經(jīng)離心(20 ℃,10 000 r/min)取上清液,經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇醇沉24 h,離心取沉淀物。將沉淀物用適量蒸餾水溶解后,經(jīng)Sevag法[9]脫蛋白、透析、冷凍干燥,得流蘇石斛粗多糖。

2.2 動(dòng)物分組及模型建立

將實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,禁食(不禁水)24 h,隨機(jī)選取15只注射生理鹽水(200 mg/kg)作為正常對(duì)照組(NC),其余小鼠按200 mg/kg的量一次給予全量四氧嘧啶進(jìn)行腹腔注射(四氧嘧啶用生理鹽水配制成2%的溶液),然后給予正常飲食。3 d后,經(jīng)12 h禁食,從注射了四氧嘧啶的小鼠尾靜脈取血并用羅氏血糖儀測(cè)量血糖,將血糖濃度在11.1 mmol/L以上的小鼠納入實(shí)驗(yàn)組。將75只實(shí)驗(yàn)組小鼠隨機(jī)分成5組,每組15只,即模型對(duì)照組MC、陽(yáng)性對(duì)照組PC(200 mg/kg二甲雙胍)、多糖高劑量組DFP-H(200 mg/kg)、多糖中劑量組DFP-M(100 mg/kg)、多糖低劑量組DFP-L(50 mg/kg),其中多糖用蒸餾水溶解。按照每10 g0.05 mL計(jì)量灌胃,正常組和模型組給予等體積蒸餾水,連續(xù)14 d,自由進(jìn)食。最后一次進(jìn)食10 h后灌胃,2 h后CO2窒息死亡,解剖取出肝臟和腎臟,液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存。

2.3 體外抗氧化活性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10]的方法,通過測(cè)定流蘇石斛多糖對(duì)ABTS、DPPH和·OH自由基的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)DFP的體外抗氧化活性。測(cè)定時(shí),將多糖樣品配制成質(zhì)量濃度梯度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的多糖溶液,并選用2.00 mg/mL的Vc溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組,每個(gè)樣品質(zhì)量濃度測(cè)定3個(gè)平行組。

自由基清除率計(jì)算公式為:

其中,A0為空白對(duì)照組吸光值;A1為陰性對(duì)照組吸光值;Ax為樣品組吸光值。

2.4 體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定

從-80 ℃冰箱取出腎臟和肝臟,分別加入液氮研磨,用生理鹽水稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿液,4 ℃下3 000 r/min離心15 min,取上清,按照試劑盒說明書檢測(cè)SOD、CAT酶活力及GSH、MDA的量。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié) 果

3.1 流蘇石斛多糖體外抗氧化活性

流蘇石斛多糖對(duì)ABTS、DPPH和·OH自由基的清除結(jié)果如圖1所示。

從圖1可看出,陽(yáng)性對(duì)照組(Vc)在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí),對(duì)3種自由基的清除能力均達(dá)到100%。與陽(yáng)性對(duì)照組(Vc)相比,流蘇石斛多糖在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),對(duì)3種自由基均有一定的清除能力,且清除能力隨多糖質(zhì)量濃度的增加而增大,在多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí),ABTS、DPPH、·OH自由基的清除率分別為76.16%、62.66%、80.64%。

3.2 小鼠肝臟和腎臟SOD活力的變化

流蘇石斛多糖對(duì)小鼠肝臟和腎臟SOD活力的影響如圖2所示。

從圖2可以看出,與正常對(duì)照組(NC)相比,四氧嘧啶致糖尿病小鼠肝臟和腎臟中SOD活力顯著降低;與模型對(duì)照組(MC)相比,陽(yáng)性對(duì)照組(PC)可明顯提升小鼠肝臟和腎臟中SOD活力,與正常對(duì)照組(NC)無(wú)顯著性差異。DFP各劑量組對(duì)小鼠肝臟和腎臟SOD活性的影響不同,流蘇石斛多糖可顯著提高小鼠肝臟SOD水平(圖2a),且呈劑量效應(yīng)關(guān)系,其中DFP高劑量組的小鼠肝臟SOD活力與模型對(duì)照組(MC)相比上升了128 %;但與模型對(duì)照組(MC)相比,DFP各劑量組對(duì)小鼠腎臟SOD活力的影響均無(wú)顯著性差異(圖2b)。圖2中,不同字母表示具有顯著性差異,P< 0.05，下同。

圖2 流蘇石斛多糖對(duì)小鼠肝臟和腎臟SOD活力的影響

3.3 小鼠肝臟和腎臟抗CAT活力的變化

流蘇石斛多糖對(duì)小鼠肝臟和腎臟CAT活力的影響如圖3所示。

從圖3可以看出,與正常對(duì)照組(NC)相比,四氧嘧啶致糖尿病小鼠肝臟和腎臟中CAT活力顯著降低;與模型對(duì)照組(MC)相比,陽(yáng)性對(duì)照組(PC)可明顯提升小鼠肝臟和腎臟中CAT活力,與正常對(duì)照組(NC)無(wú)顯著性差異。DFP各劑量組對(duì)小鼠肝臟和腎臟CAT活力的影響不同,DFP可顯著提高小鼠腎臟CAT水平,且呈劑量效應(yīng)關(guān)系,其中DFP高劑量組的小鼠腎臟CAT水平與MC相比上升了78%;但與MC相比,DFP各劑量組對(duì)小鼠肝臟CAT活力的影響均無(wú)顯著性差異。

圖3 流蘇石斛多糖對(duì)小鼠肝臟和腎臟CAT活力的影響

3.4 小鼠肝臟和腎臟GSH量的變化

流蘇石斛多糖對(duì)小鼠肝臟和腎臟中GSH量的影響如圖4所示。

圖4 流蘇石斛多糖對(duì)小鼠肝臟和腎臟中GSH量的影響

從圖4可以看出,與正常對(duì)照組(NC)相比,四氧嘧啶致糖尿病小鼠肝臟和腎臟中GSH水平顯著降低;與模型對(duì)照組(MC)相比,陽(yáng)性對(duì)照組(PC)可以明顯提升小鼠肝臟和腎臟GSH水平;DFP高、中劑量可明顯提升小鼠肝臟GSH水平(圖4a),DFP各劑量組均可顯著提升小鼠腎臟GSH水平(圖4b);與模型對(duì)照組(MC)相比,DFP高劑量組小鼠肝臟和腎臟的GSH水平分別上升了96%和53%,表明DFP能夠增強(qiáng)小鼠肝臟和腎臟組織中非酶體系的抗氧化活力。

3.5 小鼠肝臟和腎臟MDA量的變化

流蘇石斛多糖對(duì)糖尿病小鼠肝臟和腎臟MDA水平的影響如圖5所示。

由圖5可以看出,與正常對(duì)照組(NC)相比,四氧嘧啶致糖尿病小鼠肝臟和腎臟中MDA量顯著上升;與模型對(duì)照組(MC)相比,陽(yáng)性對(duì)照組(PC)可以明顯降低腎臟MDA量,DFP各劑量組可不同程度地降低小鼠肝臟和腎臟MDA的量。由圖5a可知在肝臟中,DFP高劑量組可降低小鼠肝臟MDA的量至正常水平,與模型對(duì)照組(MC)相比降低了40%,表明DFP能夠有效保護(hù)小鼠肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷;由圖5b可知在腎臟中,DFP高劑量組降低小鼠腎臟MDA的量明顯,與模型對(duì)照組(MC)相比降低了25%,但MDA的量仍顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(PC)與正常對(duì)照組(NC),表明DFP對(duì)腎臟的脂質(zhì)過氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。

圖5 流蘇石斛多糖對(duì)小鼠肝臟和腎臟MDA量的影響

4 討 論

正常情況下,機(jī)體內(nèi)部存在的自由基防御系統(tǒng)可及時(shí)清除體內(nèi)過多的自由基,保持機(jī)體中自由基的產(chǎn)生和清除動(dòng)態(tài)平衡,避免發(fā)生氧化損傷[11]。SOD和CAT是組成生物體內(nèi)最主要的酶促防御體系,它們能有效清除活力氧自由基并終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[12]。GSH是生物體重要的抗氧化物質(zhì),其含量高低影響到非酶體系中的抗氧化能力。當(dāng)SOD和CAT活力下降、GSH含量降低時(shí)會(huì)導(dǎo)致自由基積累,引起氧化應(yīng)激,生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA升高,機(jī)體組織發(fā)生氧化損傷[13-14]。目前認(rèn)為,糖尿病及其并發(fā)癥與氧化應(yīng)激有很大關(guān)系,氧化應(yīng)激可導(dǎo)致血糖調(diào)節(jié)機(jī)制受損,血糖水平升高。在高血糖狀態(tài)下,抗氧化酶發(fā)生糖基化,SOD和CAT的活力下降,GSH含量減少,MDA含量增多[15]。研究表明,糖尿病小鼠肝臟、腎臟中SOD和CAT的酶活力顯著低于正常小鼠,經(jīng)過降血糖治療后,其酶活力有所提高,從而提高機(jī)體不同組織的抗氧化防御能力,預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生[16]。

本文研究DFP體內(nèi)外的抗氧化活力,結(jié)果表明DFP具有清除ABTS、DPPH和·OH自由基的能力,對(duì)糖尿病引發(fā)器官組織的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。在肝臟中,DFP能有效清除自由基和緩解脂質(zhì)過氧化作用,保持肝臟內(nèi)抗氧化與氧化動(dòng)態(tài)平衡,DFP顯著升高的SOD活力可將超氧自由基快速轉(zhuǎn)化為H2O2,DFP升高肝臟GSH水平可以與其他酶協(xié)同發(fā)揮作用，進(jìn)而有效催化H2O2分解成H2O和O2,抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng),降低MDA量至正常水平;在腎臟中,DFP升高CAT和GSH水平可有效催化H2O2的分解,但DFP緩解腎臟脂質(zhì)過氧化的作用弱于它對(duì)肝臟的抗氧化作用,表現(xiàn)為腎臟中MDA量的抑制程度低于對(duì)肝臟中MDA量的抑制。

本文研究表明DFP具有較好的體內(nèi)體外抗氧化作用,相同抗氧化指標(biāo)在不同器官中表現(xiàn)出差異性,反映了DFP對(duì)不同器官的抗氧化機(jī)制不同。