高低脂飲食差異對小鼠腸道乳糖酶活力的影響

吳燕婷, 劉 健

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

乳糖酶可將食物中包含的乳糖分解為一分子葡萄糖和一分子半乳糖,分布在哺乳動物小腸黏膜上皮細胞絨毛遠端刷狀緣上。葡萄糖是糖酵解作用的底物,參與到人體各部分代謝中;而半乳糖是人體大腦和黏膜組織代謝中的必要成分,對于嬰幼兒的大腦發(fā)育和成長至關(guān)重要[1]。人在成年后,依然需要在食物中攝入一定量的乳糖,來供機體日常所需。調(diào)查結(jié)果主要將人群分為乳糖耐受型(lactase persistence,LP)和乳糖不耐受型(lactase non persistence,LNP)兩大類,前者在成年后,腸道中的乳糖酶活力依舊很高,而后者相反[2]。有研究[3]表明,LP及LNP是由乳糖酶基因(LCT)決定的,人的LCT基因上游有多個與LCT表達相關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點[4],這些SNP位點會影響LCT的表達,改變?nèi)樘敲富盍Φ母叩?并且這2種人群在世界范圍內(nèi)的分布存在著明顯的地理差異,北歐等西方國家的人群大多為LP,而亞洲等東方國家的人群大多為LNP[5-6]。也有研究[7-9]表明,哺乳動物腸道中的乳糖酶活力會受到飲食的調(diào)控,改變食物中糖脂的含量,會影響LCT的表達,影響腸道中的乳糖酶活力。流行病學(xué)研究[10-12]表明LP及LNP人群的肥胖發(fā)生幾率不同,這2種人群在日常生活中攝入食物的種類也不同。但是,飲食成分尤其是脂質(zhì)含量的改變,是否影響腸道乳糖酶的活力仍不清楚。

本文考察了在當(dāng)代小鼠3周斷乳后、親代小鼠哺乳期間和親代小鼠孕前孕中期間,對各組小鼠分別喂養(yǎng)高低脂飲食,觀察對當(dāng)代或子代雄性和雌性小鼠腸道乳糖酶活力的改變。揭示高脂飲食(high-fat diet,HFD)相比于低脂飲食(low-fat diet,LFD)對于小鼠腸道乳糖酶活力的影響,為進一步探究不同飲食對于人體中乳糖酶活力影響提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

周齡為3、8周的SPF級C57BL/6小鼠購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司;小鼠LFD飼料按Research Diets D12450B配制,小鼠HFD飼料按Research Diets D12451配制,制成的飼料經(jīng)真空包裝,60Co輻照殺菌,于-20 ℃貯藏。

本實驗所用的乳糖酶測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所;玻璃研磨棒和氯化鈉購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司?？捡R斯亮藍G-250粉末購于生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠飼養(yǎng)與分組

小鼠飼養(yǎng)于食品與生物工程學(xué)院SPF級動物房中,溫度維持于22 ℃,12 h/12 h光暗周期下,自由攝取食物和水。各組小鼠分組處理如下:

當(dāng)代飲食差異組。3周的雄性和雌性小鼠各被分為2組,分別喂養(yǎng)LFD和HFD,收取周齡分別為3、6、9周的當(dāng)代雄性和雌性小鼠的小腸組織。

親代哺乳期飲食差異組。8周的雄性和雌性小鼠作為親代小鼠,在孕前孕中期間,親代小鼠飲食均為LFD,在其哺乳期間(即子代小鼠0～3周期間),分別喂養(yǎng)LFD和HFD,3周哺乳期后,子代3周斷乳小鼠均喂養(yǎng)HFD。收取周齡分別為3、6、9周的子代雄性和雌性小鼠的小腸組織。

親代孕前孕中飲食差異組。8周的雄性和雌性小鼠作為親代小鼠,分為2組,在親代小鼠產(chǎn)下子代小鼠之前(即子代小鼠0周之前),分別喂養(yǎng)LFD和HFD,收取周齡分別為3、6、9周的子代雄性和雌性小鼠的小腸組織。

1.2.2 小鼠腸道收取及腸道黏膜勻漿制備

CO2窒息處死動物,立即取其胃幽門以下10 cm腸段作為待測標(biāo)本,加入2倍腸質(zhì)量的生理鹽水,用DY89-I型玻璃勻漿器于冰浴中低速勻漿1 min,然后低溫3 000 r/min離心10 min。取上清液待測或置于-80 ℃保存。

1.2.3 小鼠腸道乳糖酶活力的測定

測定方法參考Dahlqvist 法[13]。以各小鼠腸道黏膜勻漿上清為待測樣本,進行酶活力測定。第1步為酶促反應(yīng),在各管中依次加入底物(乳糖溶液)和酶(待測樣本),混勻后37 ℃孵育20 min,反應(yīng)結(jié)束后加入終止劑,混勻后,4 000 r/min離心10 min;第2步為顯色反應(yīng),取出各樣本上清液于96孔板中,各孔中加入顯色液,混勻后37 ℃孵育15 min,反應(yīng)結(jié)束后,酶標(biāo)儀上讀取各孔505 nm處吸光值。每個待測樣本的測定管需與一個空白管作為對照。標(biāo)準(zhǔn)曲線以5.55 mmol/L葡萄糖溶液制作。利用BCA法測定各鼠腸黏膜勻漿的蛋白含量。乳糖酶活力(U)定義為:在37 ℃、pH=6.0的條件下,每mg組織蛋白每min水解1 nmol乳糖,記為1個乳糖酶活力單位。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果以(x±se)表示。采用Origin9統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,2組之間比較采用Mann-Whitney檢驗,P<0.05為差異顯著(*),P<0.01為差異極顯著(**)。

2 結(jié)果與討論

2.1 當(dāng)代小鼠高脂飲食改變?nèi)樘敲富盍?/h3>

當(dāng)代飲食差異組實驗設(shè)計如圖1所示。當(dāng)代小鼠高脂飲食改變?nèi)樘敲富盍Φ慕Y(jié)果如圖2所示。

圖1 當(dāng)代飲食差異組實驗設(shè)計

圖2 當(dāng)代高脂飲食對雄性和雌性小鼠體質(zhì)量和乳糖酶活力的影響

圖2中,*表示與3周組相比,有顯著性差異;#表示不同飲食相同周齡間的比較,有顯著性差異。從圖2a、圖2c可以看出,當(dāng)代雄性和雌性小鼠隨著周齡的增加,小鼠的體質(zhì)量明顯升高,在喂養(yǎng)HFD后,小鼠的體質(zhì)量相較于LFD組顯著性升高。而在圖2b中,雄性小鼠腸道中乳糖酶的活力隨著周齡的增加逐漸降低,在HFD喂養(yǎng)后,6周、9周的小鼠的乳糖酶活力比3周下降得更多。但圖2d中,LFD的雌性小鼠腸道乳糖酶活力并沒有表現(xiàn)出同雄性小鼠相同的生理性降低,在HFD喂養(yǎng)后,6、9周小鼠腸道中的乳糖酶活力比同周齡喂養(yǎng)LFD的反而有顯著性升高。而雄性小鼠在3周斷乳時,乳糖酶活力值為(63.13±3.93) U,與雌性小鼠的(21.93±2.64) U相比,有顯著性差異,P=0.001，雄性小鼠在斷乳時的乳糖酶活力顯著高于雌性。

結(jié)果表明,當(dāng)代高脂飲食會增加雄性和雌性小鼠的體質(zhì)量。雄性小鼠中,腸道乳糖酶活力會出現(xiàn)生理性的降低,而在雌性小鼠中,HFD會提高小鼠的乳糖酶活力。

2.2 哺乳期高脂飲食改變子代小鼠乳糖酶活力

研究表明,在哺乳動物3周(斷乳)時,腸道中的乳糖酶活性較高,而斷乳后,大部分哺乳動物腸道中的乳糖酶活力都會降低(圖2b),這可能與哺乳動物的乳汁成分相關(guān)聯(lián),而親代哺乳期的飲食不同,會改變?nèi)橹某煞?為了進一步驗證高脂飲食對小鼠腸道乳糖酶活力的影響,親代哺乳期飲食差異組實驗設(shè)計如圖3所示。

圖3 親代哺乳期飲食差異組實驗設(shè)計

親代哺乳期喂養(yǎng)HFD,對子代小鼠體質(zhì)量與乳糖酶活力的影響如圖4所示,圖4中,*表示不同飲食同周齡之間的比較,有顯著性差異。在圖4a和4c中,親代哺乳期喂養(yǎng)HFD后,子代雄性和雌性小鼠的體質(zhì)量同親代哺乳期飲食為LFD的子代小鼠相比,在3、6、9周時,體質(zhì)量均升高,且在3周時有顯著性差異。在圖4b中,當(dāng)親代哺乳期喂養(yǎng)HFD后,子代3周雄性小鼠的乳糖酶活力與親代哺乳期為LFD的子代小鼠相比有顯著性降低,子代6、9周雄性小鼠比LFD組也有降低趨勢,但沒有顯著性差異。圖4d中,在親代哺乳期飲食為HFD后,子代6周的雌性小鼠比LFD組的乳糖酶活力有顯著性降低,而子代3、9周的雌性小鼠與LFD組相比,則沒有顯著性變化。在親代哺乳期飲食為HFD后,子代3周的雄性小鼠的乳糖酶活力為(44.92±13.97) U,與雌性小鼠的(34.72±6.45) U相比無顯著性差異,P=0.54。

結(jié)果表明,親代哺乳期喂養(yǎng)HFD會增加子代雄性和雌性小鼠的體質(zhì)量,并且在雄性小鼠中,親代哺乳期喂養(yǎng)HFD會顯著降低子代3周的雄性小鼠的腸道乳糖酶活力,而在雌性小鼠中,親代哺乳期喂養(yǎng)HFD則會顯著降低子代6周的雌性小鼠的腸道乳糖酶活力。親代哺乳期喂養(yǎng)HFD,子代3周的雄性和雌性小鼠的乳糖酶活力水平的差距縮小。

圖4 親代哺乳期高脂飲食對子代不同周齡雌雄小鼠體質(zhì)量和腸道乳糖酶活力的影響

2.3 親代高脂飲食改變子代小鼠乳糖酶活力

為了進一步驗證高脂飲食對小鼠腸道乳糖酶活力的影響以及親代飲食對于子代小鼠乳糖酶活力的影響,親代孕前孕中飲食差異組實驗設(shè)計如圖5所示。

圖5 親代孕前孕中飲食差異組實驗設(shè)計

親代孕前孕中期間喂養(yǎng)HFD,對子代小鼠體重和乳糖酶活力的影響如圖6所示,圖6中,*表示不同飲食同周齡間的比較,有顯著性差異。由圖6a、圖6c可知,親代孕前孕中飲食為HFD,子代雄性和雌性小鼠的體質(zhì)量與親代小鼠飲食為LFD的子代小鼠的體質(zhì)量相比,沒有顯著性差異。由圖6b可知,當(dāng)親代孕前孕中飲食為HFD,雄性3、6周的子代小鼠的乳糖酶活力比親代小鼠飲食為LFD的同周齡子代小鼠均顯著性降低。由圖6d可知,子代雌性3、6、9周小鼠的乳糖酶活力在親代孕前孕中飲食為HFD后,比LFD組的子代雌性小鼠有與雄性小鼠相同的降低趨勢,但沒有顯著性。

圖6 親代孕前孕中期高脂飲食對子代不同周齡雌雄小鼠體質(zhì)量和腸道乳糖酶活力的影響

3 結(jié) 論

本文研究表明喂養(yǎng)正常低脂飲食的雄性小鼠,伴隨著小鼠周齡的增加,腸道中乳糖酶的活力顯著降低,這與之前的報道也是一致的[14]。而改變小鼠的飲食為高脂飲食后,不論是改變當(dāng)代小鼠的飲食,還是改變親代小鼠孕前孕中或哺乳期的飲食,雄性小鼠小腸中的乳糖酶活力都會比對照的低脂飲食小鼠的乳糖酶活力更低。這可能是由于高脂飲食相比于低脂飲食,脂肪含量高，碳水化合物的含量低,尤其是蔗糖的含量較低。高脂肪油膩的飲食,對于小鼠腸道具有一定的刺激作用,會影響小鼠腸道的消化與吸收。而有研究表明,飲食中的蔗糖會刺激小鼠腸道中乳糖酶mRNA水平的升高,進而提高腸道中乳糖酶的活力[8]。長期喂養(yǎng)低脂高碳水的飲食相比于長期喂養(yǎng)高脂飲食,小鼠腸道中的乳糖酶水平可以維持得更好,這是由于碳水化合物的代謝產(chǎn)物能夠在一定程度上對于乳糖酶基因具有一定的調(diào)節(jié)作用。雖然乳糖酶的作用底物是乳糖,但有研究[15]表明,蔗糖的代謝產(chǎn)物之一果糖,能夠影響LPH和GLUT5基因的轉(zhuǎn)錄,從而影響腸道中碳水化合物的消化和吸收,改變腸道中雙糖酶的活力,包括蔗糖酶和乳糖酶的改變。而雌性小鼠的乳糖酶變化規(guī)律不同,且在正常低脂飲食喂養(yǎng)下,檢測不到小鼠腸道中的乳糖酶活力隨著周齡增長而出現(xiàn)的生理性降低的現(xiàn)象,這可能是雌性小鼠在生長過程中,由于體內(nèi)的雌性激素的存在,對小鼠腸道中的消化酶產(chǎn)生了一定的作用,研究[16]表明,雌激素有一種潛在的對于腸道中消化酶,包括雙糖酶(乳糖酶等)和脂酶的抑制作用,這也可能是造成檢測到的雌性小鼠腸道中的乳糖酶活力比雄性小鼠較低的原因。

綜上所述,本實驗證明了在雄性C57BL/6小鼠生長發(fā)育過程中,腸道中的乳糖酶活力會出現(xiàn)生理性的降低,而雌性小鼠的乳糖酶活力隨著周齡的增加沒有規(guī)律性的變化;親代小鼠孕前孕中期間以及哺乳期間喂養(yǎng)高脂飲食,會導(dǎo)致子代雄性小鼠腸道乳糖酶活力的降低。而在雌性小鼠中,可能由于激素水平等因素的影響,小鼠腸道中乳糖酶的變化與雄性小鼠不一致。