基于不同測序技術(shù)的微生物群落結(jié)構(gòu)比較

黃 紛, 岳正波, 李玉龍, 譚 娟, 王 進(jìn)

(合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

20世紀(jì)90年代,不依賴于純培養(yǎng)的DNA測序技術(shù)得到了迅速的推廣,變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)、DNA克隆文庫(clone library,CL)等分子生物學(xué)技術(shù)得到快速發(fā)展,能夠直接從分子水平上研究微生物資源,避免了傳統(tǒng)微生物分析方法的局限性[1]。DGGE方法在同一條帶位置上表示相同的菌種,能直觀地反映微生物群落的變化情況。CL技術(shù)操作簡單,在單個(gè)或2個(gè)檢測樣品中具有省時(shí)、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)[2]。文獻(xiàn)[3]用聚合酶鏈反應(yīng)變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)的方法分析合肥市塘西河表層沉積物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，表征塘西河流域城鎮(zhèn)化程度以及生態(tài)恢復(fù)效果;文獻(xiàn)[4]用CL方法分析鎮(zhèn)江香醋醋醅中乙偶姻合成途徑的關(guān)鍵酶，為解析多菌種醋酸發(fā)酵過程中乙偶姻微生物合成機(jī)理奠定了研究基礎(chǔ)。然而,傳統(tǒng)的分子指紋圖譜，如DGGE和CL,獲得的微生物DNA序列通常低于100條,檢測限低、工作量大,故對研究樣品量少的污泥來說有較大的局限性。

21世紀(jì)以來,新一代高通量測序(high-throughput sequencing,HS)技術(shù)快速發(fā)展,能夠?qū)?6S rRNA基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序,每次分析獲得的基因序列數(shù)以百萬甚至億萬計(jì),不僅通量高,而且能夠同時(shí)分析上百個(gè)不同的樣品,成為解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落物種組成和相對豐度的重要工具[5]。文獻(xiàn)[6]用HS技術(shù)分析了樂安江從上游至下游水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成變化。

事實(shí)上,HS微生物多樣性的基本原理與傳統(tǒng)的分子指紋圖譜基本一致,兩者都以樣品DNA作為模板獲得微生物群落16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后,開展下游分析[7]。文獻(xiàn)[5,8]比較了16S rRNA HS、DGGE、CL在環(huán)境微生物分析中的應(yīng)用效果。關(guān)于DGGE、CL及HS之間的差異,相關(guān)研究很少。

本文作者所在課題組構(gòu)建了厭氧-缺氧-好氧(anaerobic-anoxic-oxic, A2/O)反應(yīng)器系統(tǒng)對垃圾滲濾液和酸性礦山排水進(jìn)行混合處理。A2/O反應(yīng)器連續(xù)運(yùn)行450 d后,化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand,COD)去除率達(dá)到98.0%以上,硫酸根(SO42-)去除率約為91.0%,氨氮去除率高達(dá)99.6%[8]。本文采集A2/O穩(wěn)定運(yùn)行階段各反應(yīng)器樣品,利用DGGE、CL及16S rRNA HS研究微生物群落多樣性,并分析比較了3種分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

垃圾滲濾液取自安徽省某垃圾填埋場,酸性礦山廢水取自某尾礦庫,將兩者混合并調(diào)整其pH值為中性后作為厭氧反應(yīng)器的進(jìn)水。A2/O反應(yīng)器流程如圖1所示,進(jìn)入?yún)捬醴磻?yīng)器的混合調(diào)節(jié)廢水ρ(COD)、ρ(SO42-)分別為(7 500±500)、(2 500±65) mg/L,在穩(wěn)定運(yùn)行階段檢測到出水ρ(COD)、ρ(SO42-)分別為(1 089±45)、(580±40) mg/L,去除率分別達(dá)到89.0%、76.8%,同時(shí)檢測到甲烷(CH4)生成量為(280±18) mL。在反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定階段采集厭氧、缺氧、好氧3個(gè)反應(yīng)器單元的泥水混合液進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析。

圖1 A2/O反應(yīng)器流程

1.2 污泥樣品DNA提取

針對3個(gè)反應(yīng)器的污泥樣品,分別稱取0.5～1.0 g污泥,重復(fù)3次,利用OMEGA公司的E.N.Z.A土壤DNA抽提試劑盒提取DNA。對得到的DNA采用1%瓊脂糖電泳,電泳電壓100 V,電泳時(shí)間45 min,利用紫外凝膠成像系統(tǒng)成像,保存圖譜,觀察所提取DNA的完整性和濃度,DNA 保存于-20 ℃冰箱待用。

1.3 3種測序方法

3種測序方法的細(xì)菌PCR引物見表1所列,古菌PCR引物見表2所列。

表1 細(xì)菌PCR引物

表2 古菌PCR引物

(1) DGGE測序。采用傳統(tǒng)的巢式PCR,細(xì)菌引物為F338-GC/R518,大約的擴(kuò)增片段為230 bp;古菌引物為F787-GC/R1 059,大約的擴(kuò)增片段為320 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(簡稱“上海生工”)合成。細(xì)菌PCR擴(kuò)增程序?yàn)?① 94 ℃變性5 min;② 30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(94 ℃變性30 s,56 ℃退火60 s,72 ℃延伸 30 s);③ 72 ℃延伸5 min。古菌PCR擴(kuò)增程序?yàn)?① 94 ℃變性4 min;② 31個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸 30 s); ③ 72 ℃延伸7 min。

按照TaKaRa Taq酶說明書配制PCR反應(yīng)體系50 μL。 取PCR產(chǎn)物5 μL,與1 μL上樣染料混勻,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,恒壓100 V 45 min,紫外凝膠成像系統(tǒng)成像,保存圖譜。

采用Bio-Rad公司D-code Universal Mutation System DGGE電泳系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。具體步驟如下:① 凝膠制備,凝膠均采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%,梯度為40%～60%;② 上樣及電泳,上樣體積25～30 μL,75 V電泳14 h;③ 染膠;④ 使用凝膠成像系統(tǒng)拍照;⑤ 切膠后送上海生工進(jìn)行克隆測序。

(2) CL構(gòu)建并測序。CL采用的細(xì)菌引物為8F/1 492R, 大約的擴(kuò)增片段為1 500 bp；古菌引物為21F/958R, 大約的擴(kuò)增片段為1 500 bp。細(xì)菌擴(kuò)增程序?yàn)?① 94 ℃變性5 min;② 31個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(95 ℃變性35 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s);③ 72 ℃延伸5 min。古菌擴(kuò)增程序?yàn)?① 94 ℃變性5 min;② 34個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(95 ℃變性30 s,58 ℃退火40 s,72 ℃延伸60 s);③ 72 ℃延伸10 min。

利用Peasy-T3載體和E.coliDH5α菌株建立16S rDNA文庫?？寺【杲?jīng)藍(lán)白斑篩選后,選取陽性菌株過夜搖菌培養(yǎng),菌液送至上海生工測序。測序序列與GenBank中的序列比對,得到該片段的系統(tǒng)發(fā)育地位及其分類。通過其分類把所有的克隆子分為多個(gè)操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU), OTU反映了所分析樣品中微生物群落的種類,而每個(gè)OTU所占的比例反映了該種類在群落中的相對豐度,從而反映了整個(gè)群落的微生物結(jié)構(gòu)。

(3) 16S rRNA HS。對于HS的PCR引物,細(xì)菌引物為515F/806R,大約的擴(kuò)增片段為300 bp；古菌引物為349F/806R,大約的擴(kuò)增片段為460 bp。使用 Illumina Hiseq2500 平臺對構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫進(jìn)行 PE250 測序(廣東美格基因科技有限公司),對測序結(jié)果進(jìn)行基本的質(zhì)控,去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù),然后將得到的序列按照97%的相似度進(jìn)行聚類,篩選出代表序列,同時(shí)比對RDP(Ribosomal Database Project)、Greengene等數(shù)據(jù)庫,得到代表序列的分類信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 門水平微生物群落分析

門水平細(xì)菌群落組成如圖2所示。

在厭氧反應(yīng)器中,DGGE的測序結(jié)果共得到6個(gè)門水平的微生物,其中Proteobacteria(34.60%)和Thermotogae(39.00%)是優(yōu)勢菌,其次是Firmicutes(7.70%)、Planctomycetes(7.70%)及Bacteroidetes(6.50%);CL方法共得到4個(gè)門水平的微生物,優(yōu)勢菌為Proteobacteria(33.82%)和Firmicutes(62.5%),其次是Planctomycetes(2.20%)和Thermotogae(1.47%);16S rRNA HS共檢測到8個(gè)門水平微生物,其中Firmicutes(23.91%)、Proteobacteria(23.54%)及Thermi(29.70%)為優(yōu)勢菌,此外還檢測到了Bacteroidetes(5.84%)、Planctomycetes(8.10%)、Acidobacteria(3.362%)及Chloroflexi(2.08%)。

缺氧反應(yīng)器中,DGGE測序共得到5個(gè)門水平的微生物,分別為Proteobacteria(48.50%)、Thermotogae(18.60%)、Bacteroidetes(15.50%)、Spirochaetes(11.10%)及Planctomycetes(6.30%);CL方法共得到2個(gè)門水平的微生物,分別為Proteobacteria(58.82%)和Bacteroidetes(41.18%);16S rRNA HS共檢測到10個(gè)門水平微生物,包括DGGE和CL檢測到的所有門類,此外還有Actinobacteria(2.91%)、Chloroflexi(8.12%)及Firmicutes(14.32%)、Synergistetes(1.32%)。

好氧反應(yīng)器的門水平微生物優(yōu)勢菌種類用3種方法測得的結(jié)果與厭氧和缺氧反應(yīng)器的結(jié)果一致。

由此可知,DGGE和CL技術(shù)都能檢測到污泥樣品中的優(yōu)勢微生物,兩者結(jié)合分析能更全面地概括菌種信息,而HS技術(shù)在讀取序列方面具有信息量大的優(yōu)點(diǎn),不僅能將DGGE和CL技術(shù)分析到的微生物檢測到,還能檢測到豐度較低的物種,因此運(yùn)用HS技術(shù)能更加全面地獲得物種信息。

圖2 門水平細(xì)菌群落組成

2.2 屬水平厭氧反應(yīng)器微生物群落分析

厭氧反應(yīng)器中微生物的作用是COD去除的主要途徑,硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)將SO42-還原為硫化物,能與酸性礦山廢水中的銅、鐵等金屬離子形成硫化物沉淀從而固定在污泥中。屬水平厭氧反應(yīng)器細(xì)菌和古菌微生物群落組成如圖3所示。用3種測序方法分析厭氧反應(yīng)器中細(xì)菌和古菌的群落組成。

圖3 屬水平厭氧反應(yīng)器細(xì)菌和古菌群落組成

2.2.1 DGGE測序的細(xì)菌與古菌群落結(jié)構(gòu)

由圖3a所示厭氧反應(yīng)器中細(xì)菌的測序結(jié)果可知:

(1)Mostoga相對豐度為26.00%。該屬細(xì)菌嚴(yán)格厭氧,生長周期較長,并可以將碳水化合物和蛋白質(zhì)類物質(zhì)用于自身菌體生長[9]。

(2)Kosmotoga、Actinobacterium、Euplotes相對豐度分別為7.90%、4.50%、10.20%。該屬細(xì)菌具有水解發(fā)酵功能,主要發(fā)酵產(chǎn)物為H2、CO2、乙酸及少量的乙醇和丙酸[10]。

(3)Syntrophococcus相對豐度為7.70%。該屬細(xì)菌是一種厭氧產(chǎn)酸細(xì)菌[11],能將Mostoga等水解菌產(chǎn)生的小分子有機(jī)物質(zhì)進(jìn)一步分解為乙酸、CO2等。

(4) SRB菌Desulfovibrio相對豐度為3.70%。該屬細(xì)菌能利用產(chǎn)酸菌產(chǎn)生的H2、CO2等將SO42-還原為硫化物。

由圖3b所示厭氧反應(yīng)器中古菌的測序結(jié)果可知,2種產(chǎn)甲烷古菌Methanosaeta和Methanosarcina相對豐度分別為22.90%、49.10%。這2種古菌均能利用乙酸產(chǎn)生CH4。

2.2.2 CL測序的細(xì)菌與古菌群落結(jié)構(gòu)

通過CL技術(shù)檢測到多種微生物,包括Proteobacteria門的大量細(xì)菌(如Pelospora屬、Syntrophococcus屬)以及Desulfococcus屬。

(1)Pelospora(59.56%)、Syntrophococcus(25.74%)可以降解多種復(fù)雜的有機(jī)物。

(2)Desulfococcus(8.09%)是典型的SRB菌。

(3)Candidatus(2.21%)具有厭氧氨氧化功能,是廣為人知的厭氧氨氧化菌。

(4)Methanosaeta是檢測到的唯一一種產(chǎn)甲烷古菌。

在厭氧反應(yīng)器中檢測到的菌種和其中進(jìn)水水質(zhì)情況基本相符,且達(dá)到了一定的去除率。

DGGE和CL方法檢測到的微生物互為補(bǔ)充,能大致反映厭氧反應(yīng)器中的微生物群落組成。

2.2.3 HS測序的細(xì)菌與古菌群落結(jié)構(gòu)

由16S rRNA HS可知:

(1)Pseudomonas、Kosmotoga相對豐度分別為8.22%、3.76%。該菌屬為水解細(xì)菌,能夠使大分子復(fù)雜有機(jī)物分解成易被功能微生物利用的小分子物質(zhì)。

(2)Acholeplasma、Ferruginibacter、Flavonifractor及Saccharibacteria相對豐度分別為13.89%、7.92%、4.61%、6.91%。該菌屬為發(fā)酵產(chǎn)酸細(xì)菌,產(chǎn)物主要有甲酸、乙酸等[12-13]。

(3)Desulfobulbus與Desulfomicrobium相對豐度分別為6.84%、3.01%。該菌屬是SRB菌,能利用有機(jī)物作為電子供體將廢水中的硫酸鹽還原成硫代硫酸鹽等中間產(chǎn)物和硫化物。

(4) 產(chǎn)甲烷古菌主要有Methanosaeta(59.21%)、Methanobacterium(2.11%)及Methanobrevibacter(3.32%)。

2.2.4 3種方法測序結(jié)果分析

垃圾浸出液與礦山廢水混合后有助于強(qiáng)化微生物間的協(xié)同作用并促進(jìn)污染物的去除。如在水解發(fā)酵菌Mostoga、Kosmotoga、Pelospora及Syntrophococcus屬的作用下,不溶性有機(jī)物、復(fù)雜有機(jī)物分解為小分子的有機(jī)物,其中一部分被產(chǎn)甲烷菌作為底物產(chǎn)CH4。Methanosaeta是3種方法檢測到的優(yōu)勢菌種,因此在厭氧反應(yīng)器中以乙酸型產(chǎn)甲烷菌為主導(dǎo)。這些微生物的種屬組成和數(shù)量分布決定了反應(yīng)器的運(yùn)行性能。另外一部分有機(jī)物則被SRB菌利用,DGGE檢測到的SRB菌為Desulfovibrio(3.70%),CL檢測到的SRB菌為Desulfococcus(8.09%),而HS檢測到的SRB菌為Desulfobulbus(6.84%)和Desulfomicrobium(3.01%),由此可知,針對相對豐度低的菌種(SRB菌),3種分子生物學(xué)方法可結(jié)合分析,能更加準(zhǔn)確地反映污泥樣品的微生物群落組成。厭氧反應(yīng)器中存在的SRB將SO42-還原為硫化物,混合液中的銅、鐵等金屬離子可與硫化物形成沉淀,因而為重金屬離子和硫酸根離子的去除提供了一種生物處理法。

2.3 屬水平缺氧反應(yīng)器微生物群落分析

根據(jù)圖1可知,缺氧反應(yīng)器進(jìn)水是由厭氧反應(yīng)器出水與好氧反應(yīng)器回流液混合組成，進(jìn)水的氨氮質(zhì)量濃度為83～100 mg/L，在有機(jī)碳源的條件下進(jìn)行反硝化作用,同時(shí)去除部分COD。缺氧反應(yīng)器中硫酸鹽的降幅很小,可忽略不計(jì)。

缺氧反應(yīng)器屬水平細(xì)菌群落組成如圖4所示。

圖4 缺氧反應(yīng)器屬水平細(xì)菌群落組成

(1) 缺氧反應(yīng)器中PCR-DGGE方法結(jié)果。Bacteroidetes門Proteiniphilum屬的相對豐度為6.00%,Thermotogae門Mesotoga屬的相對豐度為18.60%,Spirochaetes門的相對豐度為12.90%。還存在部分兼性細(xì)菌,如Proteobacteria門的Deinococci屬,Bacteroidetes門的Ferruginibacter屬,但其總量只占總菌群的15.80%。反硝化細(xì)菌Thauera(11.70%)和Paracoccus(7.30%),在硝酸鹽作為受體存在時(shí)可以進(jìn)行厭氧生長并具有反硝化功能[14]。

(2) CL分析結(jié)果。缺氧反應(yīng)器檢測到Sphingobacteriales(22.06%)、Ferruginibacter(19.12%)、Comamonas(13.24%)及Thermomonas(13.24%)。Ferruginibacter也具有水解有機(jī)物的作用,是缺氧反應(yīng)器中COD去除的承擔(dān)者。Comamonas有反硝化功能,在文獻(xiàn)[15]的硝化-反硝化反應(yīng)器中也發(fā)現(xiàn)了一定量的Comamonas屬細(xì)菌。

(3) 16S rRNA HS結(jié)果。Thauera(12.29%)、Thiobacillus(20.61%)及Kosmotoga(21.01%)為缺氧反應(yīng)器中的優(yōu)勢菌種。Thauera和Thiobacillus已被研究證實(shí)具有異養(yǎng)反硝化功能,因此可認(rèn)為是反硝化脫氮的主要微生物;推測Kosmotoga為缺氧反應(yīng)器水解有機(jī)物質(zhì)的主要承擔(dān)者。缺氧反應(yīng)器可以代謝氮的細(xì)菌主要為Comamonas、Thauera、Paracoccus、Thiobacillus及Pseudomnas,可以降解有機(jī)物的微生物有Mesotoga、Ferruginibacter及Kosmotoga。

由此可知,對于缺氧反應(yīng)器中微生物群落組成,用3種方法分析能更加全面地掌握微生物的信息;對廢水進(jìn)行反硝化脫氮處理可以富集Comamonas和Thauera等細(xì)菌,提高反硝化反應(yīng)器的功能。

2.4 屬水平好氧反應(yīng)器微生物群落分析

好氧反應(yīng)器出水ρ(COD)穩(wěn)定在85 mg/L,整個(gè)A2/O反應(yīng)器中COD的去除率達(dá)到98.0%;好氧反應(yīng)器通過活性污泥在曝氣的作用下將氨氮氧化成硝態(tài)氮,完成硝化作用,最終出水氨氮質(zhì)量濃度為(1.01±0.36) mg/L,去除率達(dá)到99.0%。

好氧反應(yīng)器屬水平細(xì)菌群落組成如圖5所示。

圖5 好氧反應(yīng)器屬水平細(xì)菌群落組成

(1) 好氧反應(yīng)器DGGE測序得到的細(xì)菌群落組成與缺氧反應(yīng)器基本相同。

(2) 通過CL技術(shù),在好氧反應(yīng)器中檢測到Dokdonella(39.81%)、Deinococci(23.30%)及Thauera(8.74%)。Dokdonella、Thauera及Deinococci屬都有水解有機(jī)物的作用。

(3) 16S rRNA HS結(jié)果表明,好氧反應(yīng)器中主要是好氧微生物,如Pseudomnas(7.67%)、Gemmatimonas(8.59%)、Pusillimonas(12.94%)及Ohtaekwangia(30.94%)。Pseudomnas能以硫酸銨作為氮源進(jìn)行生長,Gemmatimonas是生物除磷固氮過程中的重要菌屬。

好氧反應(yīng)器中大部分為好氧微生物,如Dokdonella、Deinococci及Ohtaekwangia;還有一部分兼性厭氧菌,其主要功能是去除殘留的COD;代謝氮的細(xì)菌為Pseudomnas及Thauera,這2種細(xì)菌可能參與好氧條件下的硝化作用。

2.5 3種測序方法比較

3種分子生物學(xué)方法檢測結(jié)果表明,Proteobacteria門、Firmicutes門、Bacteroidetes門等微生物為主要優(yōu)勢菌群,還原硫酸鹽的種群主要包括Proteobacteria門。CL和HS方法同時(shí)檢測到厭氧反應(yīng)器污泥樣品中含有具有厭氧氨氧化功能的Planctomycetes門細(xì)菌，HS還檢測到了Thermi和Chloroflexi等門類微生物。DGGE和CL都能檢測到污泥樣品中的優(yōu)勢微生物,兩者結(jié)合分析能更全面地概括菌種信息,而HS還能檢測到豐度較低的門類,因此HS能更加全面地反映物種信息。

厭氧反應(yīng)器降解復(fù)雜有機(jī)物的菌種為Mostoga、Kosmotoga、Pelospora及Syntrophococcus屬等,硫酸鹽還原菌主要為Desulfovibrio、Desulfococcus、Desulfobulbus及Desulfomicrobium,產(chǎn)甲烷古菌主要是Methanosaeta。細(xì)菌分析中,HS比DGGE多檢測出了21.42%,比CL多檢測出了50.00%;古菌分析中,HS比DGGE多檢測出了50.00%,比CL多檢測出了83.00%。由此可知,HS相比于其他2種方法靈敏度較高,HS能夠較為全面和準(zhǔn)確地反映反應(yīng)器污泥微生物群落結(jié)構(gòu);而DGGE和CL僅能夠反映有限的優(yōu)勢微生物類群,一定程度上可能低估反應(yīng)器中微生物的物種組成并高估其豐度。因此,在屬水平上HS與其他2種方法所測到的物種數(shù)相差較大。

在缺氧反應(yīng)器和好氧反應(yīng)器中,3種方法測得的微生物種類數(shù)目差別不大,DGGE和CL分析得到的反硝化菌分別為Comamonas和Thauera,HS分析得到的反硝化功能細(xì)菌為Thiobacillus及Pseudomnas,缺氧-好氧反應(yīng)器氨氮去除率達(dá)到99.0%,水解微生物為Mesotoga、Ferruginibacter及Kosmotoga,因此缺氧-好氧反應(yīng)器的功能是去除殘留部分的COD和氨氮。

綜上所述,3種測序方法結(jié)合分析能更加真實(shí)地反映污泥樣品的微生物群落組成。

3 結(jié) 論

(1) 厭氧反應(yīng)器中主要的功能細(xì)菌是水解發(fā)酵菌和硫酸鹽還原菌。前者主要為Mostoga、Kosmotoga、Pelospora及Syntrophococcus屬;后者主要為Desulfovibrio、Desulfococcus、Desulfobulbus及Desulfomicrobium屬;缺氧和好氧反應(yīng)器中可以代謝氮的細(xì)菌主要為Comamonas、Thauera、Thiobacillus及Pseudomnas屬。

(2) 厭氧反應(yīng)器細(xì)菌分析中HS比DGGE和CL分別多檢測出21.42%、50.00%;古菌分析中HS比DGGE和CL分別多檢測出50.00%、83.00%。HS相比于其他2種方法靈敏度較高,能更全面和準(zhǔn)確地反映反應(yīng)器污泥微生物群落結(jié)構(gòu)。

(3) 宏觀上A2/O反應(yīng)器的處理功能與微觀上微生物的功能菌群有很強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系。厭氧反應(yīng)器中可富集Mostoga等細(xì)菌,達(dá)到去除有機(jī)物的目的;缺氧和好氧反應(yīng)器中可富集Thauera等菌種進(jìn)行硝化和反硝化作用。

(4) CL操作簡單,適用于樣品量少的情況;DGGE適用于樣品較多的情況,它能直觀地反映微生物群落的變化情況。對于相對豐度低的菌種,3種方法結(jié)合分析能更加真實(shí)地反映污泥樣品的微生物群落組成。