膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展

敬聰 丁向前 王君 鄒楊鴻 王志剛 余化霖 耿鑫

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)腫瘤中最常見的惡性腫瘤。神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤中，膠質(zhì)瘤約占80%，目前最常見的治療方法是手術(shù)切除、放療、化療[1]。高級(jí)別惡性膠質(zhì)瘤在成人原發(fā)性腦腫瘤中最常見，通過外科手術(shù)、放化療等積極治療，1年和5年生存率分別為30%和13%[1]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲程度最高，確診后患者僅有15個(gè)月左右的的中位生存期，5年生存率為也僅為6.8%[2]。而引起這個(gè)結(jié)果的原因是膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有高度侵襲性，使得外科手術(shù)難以完整切除膠質(zhì)瘤腫瘤組織；同時(shí)，由于膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性復(fù)雜，對(duì)常規(guī)放、化療不敏感，導(dǎo)致治療效果極差，常容易復(fù)發(fā)[1]。手術(shù)切除后，大部分患者在手術(shù)切緣2～3 cm內(nèi)復(fù)發(fā)，因此，需要探索一些新的治療方法。通過對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)，可以從從分子、基因等水平等揭示膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性。神經(jīng)瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)在腫瘤研究方面具有很多獨(dú)特的優(yōu)勢，在神經(jīng)科學(xué)研究中占據(jù)重要地位。但神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)條件要求高、難度極大又制約了其發(fā)展。因?yàn)槟z質(zhì)細(xì)胞瘤具有高度異質(zhì)性，在腫瘤內(nèi)部的不同細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境之間具有復(fù)雜的相互作用，因此，我們需要找到一個(gè)最佳的培養(yǎng)條件，保持分子基因型和表型以及原始腫瘤在體外和體內(nèi)的異質(zhì)性。下面本文回顧常見膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)及膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)在常用研究中的應(yīng)用作一綜述。

1 細(xì)胞來源

細(xì)胞培養(yǎng)為研究過程中維護(hù)細(xì)胞提供了體外環(huán)境，許多培養(yǎng)技術(shù)可用于腫瘤和非腫瘤細(xì)胞的生長和維護(hù)。選擇合適的細(xì)胞來源和體外試驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)程序與試驗(yàn)本身同樣重要[3]。

1.1 經(jīng)典細(xì)胞系 膠質(zhì)瘤的細(xì)胞多來自人類和大鼠膠質(zhì)瘤的細(xì)胞株，經(jīng)典的細(xì)胞系如U87MG、U251、U6和T98G等，培養(yǎng)在含有血清的培養(yǎng)基中，隨著傳代次數(shù)的增加，其細(xì)胞在表型和基因型上與原發(fā)性腫瘤存在差異。盡管血清培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以隨著傳代次數(shù)的增加顯示出潛在的致癌能力，但它卻不能反映親本腫瘤的表型[4]。許多目前可用的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株缺乏與腫瘤類型、分級(jí)、位置、患者年齡等相關(guān)的臨床信息，因此難以將研究結(jié)果與患者病情和臨床病程相聯(lián)系[3]。由于這些原因，傳統(tǒng)建立的細(xì)胞系不能提供可靠的模型系統(tǒng)來了解膠質(zhì)瘤的機(jī)制和治療的相互作用。

1.2 患者來源的細(xì)胞系 由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)因成功率較低，因此過去大多數(shù)研究人員未采用原代培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，如今，研究人員更喜歡從原代細(xì)胞培養(yǎng)，而不是使用已建立的細(xì)胞株，因?yàn)樗鼈兙哂懈叩纳飳W(xué)和表型相關(guān)性[3]，更適合用于侵襲性、敏感性等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果更能接近人體的真實(shí)情況，這是未來研究的細(xì)胞選擇趨勢。原代細(xì)胞通常來自于手術(shù)切換的患者標(biāo)本。組織首先洗去多余的碎屑和血液，被機(jī)械碾碎，然后用胰酶和脫氧核糖核酶消化，經(jīng)過幾次洗滌和離心步驟后，消化的組織被滴定并通過細(xì)胞過濾器，最后，細(xì)胞通過離心、重新懸浮和培養(yǎng)在神經(jīng)基質(zhì)介質(zhì)中。原代細(xì)胞可以在空白的平板中作為非粘附性神經(jīng)球生長，也可以在層粘連蛋白或聚賴氨酸包被的平板中作為粘附細(xì)胞生長[4]。然而，隨著傳代數(shù)量的增加(20～30傳代)，培養(yǎng)的患者來源的膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的基因組和轉(zhuǎn)錄變化[5]。另外，可以將源自患者的神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為異種移植物直接移植到小鼠體內(nèi)，而不是保持培養(yǎng)瓶中，然后作為系列異種移植物來保持。這些方法受到某些人的青睞，因?yàn)檫@些條件可再現(xiàn)地保持原始腫瘤的組織病理學(xué)，基因組和表型特征[6]。

2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)

傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)屬于二維(two-dimensional，2D)培養(yǎng)技術(shù)，因?yàn)槠涑杀镜?，可操作性?qiáng)而普及。但隨著研究的深入，研究這發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下是三維(three-dimensional，3D)結(jié)構(gòu)，且3D結(jié)構(gòu)的微環(huán)境較2D差異較大，所以隨著材料、技術(shù)的進(jìn)步，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)正逐步普及。

2.1 2D培養(yǎng)技術(shù) 單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是2D培養(yǎng)技術(shù)的一種，它是將離體組織塊通過物理法(金屬網(wǎng)擠壓和尖吸管吹打)或化學(xué)法(胰蛋白酶)或兩者結(jié)合，以分離出單個(gè)細(xì)胞，然后接種在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。還有一種是利用新采集的膠質(zhì)瘤組織，將其附著在培養(yǎng)瓶內(nèi)，大約1～2 d后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞會(huì)游離出來，然后再利用游離的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)[7]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞最初采用懸浮培養(yǎng)法，然而，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特征并不是懸浮生存，也不是它增殖的必要條件。大部分細(xì)胞是貼壁生長。貼壁單層細(xì)胞有很多實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢，特別是在培養(yǎng)同質(zhì)性、成像方法、克隆繁殖/挑選、篩選和定量方面，從而克服了懸浮培養(yǎng)的一些固有限制。傳代培養(yǎng)就更簡單，一般將需要的細(xì)胞種植在培養(yǎng)瓶，待其達(dá)到需要的密度，再是使用胰蛋白酶吹打膠質(zhì)瘤細(xì)胞，然后根據(jù)研究需要將膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)器械中。

在此基礎(chǔ)上，加支持物進(jìn)行培養(yǎng)、單細(xì)胞分離培養(yǎng)法、球體細(xì)胞培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)方法等培養(yǎng)方法在也膠質(zhì)瘤細(xì)胞單層細(xì)胞培養(yǎng)上得到運(yùn)用，如：加入支持物培養(yǎng)就是預(yù)先在培養(yǎng)器械中添加支持物，這樣是為了更好的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究及觀察。爬片，就是為了做細(xì)胞免疫組織化學(xué)分析而設(shè)計(jì)的，其方法是預(yù)先在培養(yǎng)板上放一個(gè)小載玻片，然后在其上培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，待條件成熟后再取出、固定并染色的一系列過程。單細(xì)胞分離培養(yǎng)也稱克隆培養(yǎng)，我國研究者通過虹吸法將SHG-44單克隆化，建立了具有3種不同分化水平的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系[8]。球形培養(yǎng)，是將生長成片狀的細(xì)胞移動(dòng)到不容易附著的基底部，并且使細(xì)胞片卷曲生長成球狀。馮利強(qiáng)等[9]還運(yùn)用懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中腦腫瘤干細(xì)胞，并認(rèn)為該方法與其他方法培養(yǎng)的細(xì)胞在形態(tài)上無差別。

2.2 3D培養(yǎng)技術(shù) 盡管單層細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)在應(yīng)用廣泛，但培養(yǎng)的細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定；它是2D結(jié)構(gòu)，而人體是3D結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化中，細(xì)胞的微環(huán)境起著至關(guān)重要的作用，針對(duì)這些問題，研究人員開始嘗試使用3D系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞，如腫瘤衍生器官、有機(jī)多細(xì)胞球體、多細(xì)胞腫瘤球體或腫瘤衍生球體，以更好地展示膠質(zhì)瘤異質(zhì)性和微環(huán)境。此外，在細(xì)胞形態(tài)上，因?yàn)?D培養(yǎng)更能重現(xiàn)人腦微環(huán)境，所以通過3D培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞在形態(tài)、功能、生物學(xué)特性上更接近于體內(nèi)存活狀態(tài)。Wei等[10]研究顯示，與單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，用3D系統(tǒng)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平、侵襲能力、惡性膠質(zhì)瘤和治療耐藥均有所增加。盧虎生等[11]利用2D及3D培養(yǎng)分別對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過3D培養(yǎng)的U251細(xì)胞系增殖速度更快，增殖指數(shù)、細(xì)胞周期、免疫組化等結(jié)果更接近于臨床標(biāo)本。所以，在3D培養(yǎng)中培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞更能反映出細(xì)胞本身的行為及特性[12]。Gomez-Roman等[13]利用2D和3D系統(tǒng)中培養(yǎng)出相同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，對(duì)放射敏感性的結(jié)果卻相反，3D系統(tǒng)培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)放射線敏感，而2D系統(tǒng)培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)放射線無反應(yīng)。這些結(jié)果為傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的結(jié)果經(jīng)常未能預(yù)測臨床療效提供了潛在的解釋，而且這種現(xiàn)象也會(huì)導(dǎo)致不當(dāng)和過度使用動(dòng)物試驗(yàn)。

然而，3D培養(yǎng)也有不足之處，如它不能100%模擬人體內(nèi)微環(huán)境、細(xì)胞生長到已成程度時(shí)營養(yǎng)缺乏等，但是這些問題現(xiàn)在我們已經(jīng)在慢慢解決。如生物打印技術(shù)的進(jìn)步，使得我們現(xiàn)在可以進(jìn)行復(fù)雜的多細(xì)胞3D環(huán)境組裝。Duarte等[14]利用生物打印將內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和永生化的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞排列成膠質(zhì)瘤樣水凝膠，其具有獨(dú)特的空間特征模仿了人類大腦的解剖結(jié)構(gòu)。在腦類器官內(nèi)共培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致腫瘤形成和侵襲，其模式與患者的手術(shù)標(biāo)本相似。從準(zhǔn)確的解剖學(xué)模型上得的藥物和侵襲研究，但仍缺少生物學(xué)相互作用。

2.3 其他培養(yǎng)方法 將兩種或兩種以上的細(xì)胞一起培養(yǎng)，稱為共培養(yǎng)方法，不過其本質(zhì)也是單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。李振業(yè)等[15]利用共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞研究CD、VEGFR-1基因，結(jié)果顯示該基因?qū)?xì)胞VEGF的表達(dá)及細(xì)胞增殖有抑制作用。另有將球狀細(xì)胞培養(yǎng)和單層培養(yǎng)相結(jié)合，以提高在無血清條件下的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的衍生效率。所以體外共培養(yǎng)模型為現(xiàn)在不能解決的問題提供了一個(gè)獨(dú)特的思路。除了上述培養(yǎng)方法以外，還有研究人員將兩種及兩種以上的方法聯(lián)合應(yīng)用，如同時(shí)采用單層培養(yǎng)及3D培養(yǎng)。還有學(xué)者利用將水凝膠使用在體外培養(yǎng)體系中作為涂層材料或3D生長系統(tǒng)來模擬腫瘤微環(huán)境，較普通培養(yǎng)瓶效果明確。還有目前一些新的培養(yǎng)技術(shù)如人源腫瘤異種移植模型、迷你大腦模型、腦片技術(shù)等等。這些方法其本質(zhì)仍是上述培養(yǎng)技術(shù)，僅是利用很多新技術(shù)來改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境，不過這些新穎的模型可以更好地概括腫瘤動(dòng)力學(xué)和微環(huán)境的相互作用，從而能夠更準(zhǔn)確地了解膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性。

3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞在各類研究中的應(yīng)用

3.1 藥物研究 膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療敏感性差，主要是因?yàn)槟壳吧腥狈γ舾杏行У幕熤委熕幬铮矣捎谘X屏障及耐藥性的存在，使得膠質(zhì)瘤的治療效果相對(duì)較差[1]。因此我們需要新的藥物來治療膠質(zhì)瘤，這使細(xì)胞培養(yǎng)顯得尤其重要。

胡燕玲等[16]研究顯示，地塞米松可在G1到S轉(zhuǎn)折點(diǎn)阻滯C6 細(xì)胞周期，從而抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Das等[17]通過對(duì)U87-MG細(xì)胞系研究，先使用地塞米松，再使用莫奈唑胺，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系不會(huì)凋亡，從而指導(dǎo)我們在臨床治療膠質(zhì)瘤患者中，合理使用地塞米松。趙艦等[18]研究發(fā)現(xiàn)，百消安可以膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)，從而抑制U87細(xì)胞系的增殖，促進(jìn)其凋亡形成。

中藥是我國的傳統(tǒng)文化，中藥治療膠質(zhì)瘤也是目前的熱門研究方向。陳雪等[19]研究表明，五味子甲素通過下調(diào)CyclinD1蛋白表達(dá)水平、上調(diào)促凋亡因子Bax和Bcl-2表達(dá)水平而抑制C6細(xì)胞的生長。Liu等[20]對(duì)雷公藤的研究中發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素在U251、U87-MG和C6細(xì)胞系以及動(dòng)物模型中可誘導(dǎo)G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡，增加自噬體形成，進(jìn)一步研究顯示雷公藤通過激活ROS/JNK信號(hào)通路，阻斷Akt/mTOR信號(hào)通路，引起G2/M期阻滯，觸發(fā)細(xì)胞凋亡和自噬。吳海霞[21]在膠質(zhì)瘤動(dòng)物和細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)，川芎揮發(fā)油聯(lián)合莫奈唑胺與莫奈唑胺單獨(dú)給藥相比，聯(lián)合用藥組的腫瘤抑制效果更好，而且抑瘤效果與川芎揮發(fā)油的濃度呈正相關(guān)。趙亞鵬等[22]對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G和LN18予以不同濃度的重樓皂苷Ⅱ處理，發(fā)現(xiàn)其可降低膠質(zhì)瘤的增殖及侵襲性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其還能增加替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制。

3.2 放射敏感性研究 不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系特點(diǎn)不一樣，研究顯示T98和MO54細(xì)胞系對(duì)輻射敏感性完全相反[23]。Ostruszka等[24]研究發(fā)現(xiàn)，U251細(xì)胞系比D54細(xì)胞系在受到放射線時(shí)更敏感，存在這種差異的原因是P53基因是突變型還是野生型。Chen等[25]在靶向輻射增敏的研究中也運(yùn)用了突變型和野生型P53兩個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，證明P53基因是膠質(zhì)瘤細(xì)胞系放射線敏感與否的關(guān)鍵因素。劉宇馳等[26]對(duì)U373細(xì)胞進(jìn)行研究顯示，下調(diào)磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，可以影響CIN、切絲蛋白1表達(dá)，從而使U373細(xì)胞的對(duì)放療更敏感。王冉冉等[27]研究顯示，通過對(duì)膠質(zhì)瘤U251和RR-U251細(xì)胞系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，升高 TPM1的表達(dá)，可以明細(xì)提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性，提示TPM1可能是膠質(zhì)瘤放射敏感相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。李文清等[28]研究顯示，對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系給予放射治療，發(fā)現(xiàn)CDK7抑制劑THZ1具有降低細(xì)胞修復(fù)的能力，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，增加放射敏感性。

3.3 免疫治療研究 目前，膠質(zhì)瘤的免疫治療是一大熱門，因膠質(zhì)瘤的自身生物學(xué)特性，即使在外周血中檢測到循環(huán)腫瘤細(xì)胞，但其幾乎不會(huì)轉(zhuǎn)移到顱外。進(jìn)一步的研究證實(shí)外周環(huán)境對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有免疫作用，所以現(xiàn)在亟需明確其免疫學(xué)機(jī)制。Friese等[29]使用人和鼠的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系來研究NK，γδT和CD8+T細(xì)胞的腫瘤免疫刺激腫瘤細(xì)胞表達(dá)，激活免疫受體NKG2D。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，PD-L1高表達(dá)[30]。在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中，PD1/PD-L1信號(hào)傳導(dǎo)可以影響早期T細(xì)胞活化，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞毒性、增生和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)低，膠質(zhì)瘤與其他腫瘤相比在以PD-1為靶點(diǎn)治療的效果較差。同時(shí)，由于膠質(zhì)瘤的多樣性，不同膠質(zhì)瘤存在異質(zhì)性，導(dǎo)致微環(huán)境也具有差異性，也使得利用PD1/PD-L1的治療方法出現(xiàn)更多挑戰(zhàn)。單克隆抗體是腫瘤免疫治療的主要方向，mAbs具有誘發(fā)直接細(xì)胞殺滅和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)的潛力，表皮生長因子受體 (EGFR) 的突變代表了膠質(zhì)瘤關(guān)鍵遺傳特征，直接針對(duì) EGFR 的 mAb 被用作膠質(zhì)瘤中眾所周知的治療方法。

腫瘤疫苗也是免疫研究的一部分，因其能夠激勵(lì)宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞，如膠質(zhì)瘤疫苗可以使用樹突細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)制備，主要是因?yàn)镈Cs作為傳遞細(xì)胞，激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞的抗腫瘤作用。陳興勝等[31]通過研究顯示，通過上調(diào)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞DCs中凝血酶敏感蛋白1的表達(dá)，可以抑制DCs的成熟，使其分泌的細(xì)胞因子具有免疫抑制作用。曾山等[32]將C6細(xì)胞、9L細(xì)胞及其裂解物作為免疫原來制備疫苗，用它來降低載瘤大鼠膠質(zhì)瘤組織的侵襲性，延長大鼠的生存期。Tang等[33]對(duì)具有免疫活性小鼠上的GL261腫瘤采用疫苗 IL15Rα聯(lián)合T細(xì)胞治療、雷帕霉素和塞來昔布治療，發(fā)現(xiàn)很好的抗腫瘤效果。

溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)治療是近年來新型的具有特異性腫瘤治療方法，其基于病毒在癌細(xì)胞中的選擇性復(fù)制和隨后的破壞作用，其最初被認(rèn)為是與免疫治療分開的一種治療策略，然而，溶瘤病毒感染引起的抗腫瘤免疫反應(yīng)模糊了這一區(qū)別[34]。由于血腦屏障的存在，導(dǎo)致化療無法達(dá)到滿意的效果，而OV由于其具有較小結(jié)構(gòu)，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢。歐陽一彬等[35]利用膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，重組溶瘤腺病毒Ad3-aLAC可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示其可增強(qiáng)抗腫瘤的免疫反應(yīng)，為膠質(zhì)瘤的OV治療提供新的思路。

3.4 建立動(dòng)物模型 動(dòng)物模型在研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、特征等方面有重要意義，而動(dòng)物模型的建立同樣需要應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)。汪柳旭等[36]在Balb/c裸鼠右側(cè)背部下方接種U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，建立鼠膠質(zhì)瘤載瘤模型，用于膠質(zhì)瘤治療方面的研究。Kim等[37]研究PD-1、抗TIM-3與放射治療的聯(lián)合治療效果，為免疫治療與放射治療的聯(lián)合治療提供了新的策略。雖然動(dòng)物模型可以提供與人體十分接近的膠質(zhì)瘤生存的微環(huán)境，但是腫瘤細(xì)胞難以直接觀察和追蹤，造模價(jià)格通常十分昂貴，且缺乏可重復(fù)性。

3.5 其他研究中的應(yīng)用 除了上述研究外，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)還廣泛用于其他研究領(lǐng)域，例如探索膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡與侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制研究。Zhang等[38]使用原代培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和原代培養(yǎng)的星形細(xì)胞研究惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的直接間隙連接，發(fā)現(xiàn)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的直接細(xì)胞耦合會(huì)導(dǎo)致星細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，從而增加膠質(zhì)瘤對(duì)周圍組織的易感性。胡斌[39]通過研究對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt通路，能增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。江曉珍等[40]對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG、U251研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞移動(dòng)因子通過PI3K/Akt途徑抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。劉紀(jì)營等[41]對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，利用RNA技術(shù)下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的KIF20A表達(dá)，可以抑制其增殖、遷移及侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1期阻滯，促進(jìn)其凋亡形成。李梅等[42]首次發(fā)現(xiàn)光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有殺傷作用。還有一些如長鏈非編碼RNA，微小RNA等對(duì)膠質(zhì)瘤的治療或侵襲性機(jī)制的研究。還有一些未列出的研究，其都顯示了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在研究中的重要性。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤因其獨(dú)特的侵襲性而困擾研究人員，為了延長膠質(zhì)瘤患者生存率，明確驅(qū)動(dòng)遷移和侵襲的關(guān)鍵機(jī)制十分重要。體外方法是預(yù)測膠質(zhì)瘤細(xì)胞如何侵襲的重要手段，與體內(nèi)模型相比，更容易操作和復(fù)現(xiàn)，且成本較低。目前膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法眾多。目前最熱門的培養(yǎng)方法是3D培養(yǎng)技術(shù)，因其可以近似的模擬腦內(nèi)微環(huán)境，更準(zhǔn)確的反映膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，更有效的尋找藥物治療靶點(diǎn)及藥物開發(fā)。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞如今也是一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，該研究未來可能稱為治療膠質(zhì)瘤的新的方向。相信隨著生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)的進(jìn)步，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以得到升級(jí)，也會(huì)應(yīng)用到一些目前未知的新的領(lǐng)域。

而且，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)條件對(duì)于保持神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤的侵襲行為至關(guān)重要。例如，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中干細(xì)胞和非干細(xì)胞群體的組成受微環(huán)境影響并影響遷移潛力，因此以維持這些細(xì)胞群體的培養(yǎng)方式至關(guān)重要[43]。此外，患者來源神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以更好的顯示膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性，在研究腫瘤的藥物敏感性和反應(yīng)性時(shí)可能更有益。

使用體外測定的目的是在不顯著損害體內(nèi)環(huán)境的情況下平衡成本和可重復(fù)性，以更準(zhǔn)確和有效地解決特定的生物學(xué)問題。只有當(dāng)體外的培養(yǎng)體系與人體環(huán)境更相似時(shí)，我們針對(duì)膠質(zhì)瘤的治療方法的研究才能更加深入，且更具有針對(duì)性，且更加有效。因此，在選擇培養(yǎng)方法時(shí)，必須考慮其能多大程度上重建體內(nèi)環(huán)境，而且必須權(quán)衡其可重復(fù)性、難易程度和成本。