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    縫隙連接細(xì)胞間通訊在丙戊酸誘導(dǎo)大鼠脂肪源干細(xì)胞向許旺細(xì)胞分化中的作用

    2021-01-05 12:41:38吳飛焦傳杰楊越劉豐孫志博
    神經(jīng)損傷與功能重建 2020年12期

    吳飛,焦傳杰,楊越,劉豐,孫志博

    丙戊酸是經(jīng)典的抗癲癇藥,本課題組前期研究顯示其具有神經(jīng)元保護(hù)作用[1,2],并能有效地誘導(dǎo)大鼠脂肪源干細(xì)胞(adipose derived stem cells,ADSCs)向許旺細(xì)胞分化[3],但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討縫隙連接細(xì)胞間通訊在丙戊酸誘導(dǎo)ADSCs 向許旺細(xì)胞分化中的作用,以進(jìn)一步闡明其在神經(jīng)誘導(dǎo)中的作用機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于GIBCO公司,油酸酰胺、丙戊酸鈉、胰蛋白酶、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司,兔抗鼠神經(jīng)組織蛋白S100、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、巢蛋白(Nestin)、縫隙連接蛋白43(Connexin 43,Cx43)抗體購(gòu)于Santa Cruz公司,RT-PCR試劑盒購(gòu)于TOYOBO公司,2×Taq PCR MasterMix購(gòu)于Fermentas公司,羊抗兔IgG、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠ADSCs 的分離、培養(yǎng)、鑒定 取4 周齡SD大鼠10只,無(wú)菌取出適量的背部皮下脂肪,PBS漂洗,剪碎,用0.075% I 型膠原酶消化30 min,等量低糖DMEM 培養(yǎng)基終止消化,1500 r/min 離心10 min 后棄上清,以DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次,細(xì)胞接近融合狀態(tài)時(shí),以0.25%胰酶消化、傳代,取第3 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 誘導(dǎo)大鼠ADSCs 向許旺細(xì)胞分化 以含10 ng/mL 堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的培養(yǎng)液預(yù)誘導(dǎo)24 h,再用PBS 液漂洗,根據(jù)分組情況,將ADSCs分別用不含丙戊酸(A組)、含1.0 mmol/L丙戊酸(B組)、1.0 mmol/L丙戊酸+2.5 μmol/L油酸酰胺(C組)的誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d,每隔24 h換液。

    1.2.3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況 調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL,接種至96孔板,每組各10孔。在24、48、72 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)每孔各加入20 μL MTT溶液,孵育4 h離心后棄上清,加入150 μL DMSO,在波長(zhǎng)490 nm 下使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄各孔吸光值。

    1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將ADSCs用4%多聚甲醛固定1 h,然后PBS 漂洗,3% 雙氧水甲醛浸泡15 min以滅活過(guò)氧化物酶;PBS 漂洗后滴入山羊血清封閉液10 min;再分別加入S100 一抗(1:500)、NSE 一抗(1∶500)、Nestin 一抗(1∶200)、Cx43 一抗(1∶200)后于4 ℃下孵育過(guò)夜;PBS 漂洗后加入生物素化二抗,37℃孵育1 h;SABC孵育,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。封片后置于倒置顯微鏡下觀(guān)察。

    表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

    1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè) 根據(jù)GenBank 公布的S100、NSE、Nestin 及Cx43 的cDNA 序列,采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,由Invitrogen公司合成,引物序列見(jiàn)表1。提取各組細(xì)胞的總RNA,行RT-PCR。然后行熒光實(shí)時(shí)定量反應(yīng),結(jié)果表示為2(—△△Ct)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 13.0 軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以(±s)表示,組間比較采用方差分析及LSD檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 ADSCs形態(tài)學(xué)觀(guān)察

    原代培養(yǎng)6 h后顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),呈圓形分布;24 h后貼壁細(xì)胞變成短梭形,見(jiàn)圖1A;傳代后大部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,增殖迅速,3 d后達(dá)85%融合,見(jiàn)圖1B、C。

    圖1 大鼠ADSCs形態(tài)學(xué)觀(guān)察(光學(xué)顯微鏡,×200)

    2.2 各組ADSCs增殖能力比較

    MTT 檢測(cè)顯示,在3 個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn),3組細(xì)胞的增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示2.5 μmol/L油酸酰胺無(wú)明顯的細(xì)胞毒作用,見(jiàn)圖2。

    圖2 培養(yǎng)24、48、72 h后各組細(xì)胞增殖能力比較(MTT法)

    2.3 各組S100、NSE、Nestin及Cx43蛋白表達(dá)水平比較

    免疫細(xì)胞化學(xué)染色示,3組均有S100、NSE 和Nestin陽(yáng)性細(xì)胞,B、C組S100、NSE、Nestin平均光密度值顯著高于A組(P<0.01),C組低于B組(P<0.01);3組均有Cx43 陽(yáng)性細(xì)胞,B、C組Cx43 平均光密度值顯著高于A組,B、C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2、圖3。

    表2 各組S100、NSE、Nestin及Cx43免疫細(xì)胞化學(xué)染色光密度值比較(±s)

    表2 各組S100、NSE、Nestin及Cx43免疫細(xì)胞化學(xué)染色光密度值比較(±s)

    注:與A組比較,①P<0.01;與B組比較,②P<0.01

    組別A組B組C組例數(shù)555 S1000.1068±0.00980.2355±0.0224①0.1653±0.0183①②NSE 0.1352±0.01360.3176±0.0362①0.2158±0.0212①②組別A組B組C組Nestin 0.1613±0.01730.3578±0.0284①0.2361±0.0146①②Cx430.1206±0.01020.2102±0.0185①0.2031±0.0146①

    圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)各組S100、NSE、Nestin、Cx43蛋白表達(dá)(光學(xué)顯微鏡,×200)

    2.4 各組S100、NSE、Nestin 及Cx43 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平比較

    實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,B、C組S100、NSE、Nestin mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著高于A組(P<0.01),C組低于B組(P<0.01);B、C組Cx43mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著高于A組(P<0.01),B、C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3、圖4。

    表3 各組S100、NSE、Nestin、Cx43 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較(±s)

    表3 各組S100、NSE、Nestin、Cx43 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較(±s)

    注:與A組比較,①P<0.01;與B組比較,②P<0.01

    組別A組B組C組例數(shù)101010 S1001.00±0.105.86±0.52①2.46±0.31①②NSE 1.00±0.107.02±1.15①2.94±0.46①②組別A組B組C組Nestin 1.00±0.107.53±1.22①3.51±0.37①②Cx431.00±0.108.32±1.87①8.56±1.53①

    圖4 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定各組S100、NSE、Nestin、Cx43mRNA轉(zhuǎn)錄水平

    3 討論

    丙戊酸是一種廣譜抗癲癇藥,具有分子量小、易透過(guò)血腦屏障、人體吸收快、體內(nèi)有效血濃高、毒副作用少、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸可顯著促進(jìn)大鼠有髓神經(jīng)纖維再生[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸具有促雪旺細(xì)胞增殖和髓鞘化的類(lèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)特性[5]。與其他的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子相比較,丙戊酸具有快速通過(guò)血腦屏障、較長(zhǎng)的生物半衰期及較高的臨床安全性等優(yōu)點(diǎn)。此外,本課題組以乳酸-羥基乙酸-L-賴(lài)氨酸多肽接枝聚/聚乳酸/納米羥基磷灰石作為載體復(fù)合丙戊酸,構(gòu)建可緩釋丙戊酸的神經(jīng)導(dǎo)管,成功地促進(jìn)了大鼠的外周神經(jīng)再生[6,7]。然而關(guān)于丙戊酸促進(jìn)神經(jīng)再生的作用機(jī)制目前尚不清楚。

    縫隙連接廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,由細(xì)胞間的兩個(gè)半通道橋接組成,該通道由具有多肽鏈結(jié)構(gòu)的連接蛋白單體構(gòu)成。它傳遞著不同神經(jīng)細(xì)胞間的電化學(xué)信息,允許離子、代謝物、小分子物質(zhì)通過(guò),對(duì)神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)功能維持具有重要的調(diào)控作用[8]??p隙連接細(xì)胞間通訊經(jīng)常受到病理和藥物因素的影響,油酸酰胺作為常用的縫隙連接脫耦聯(lián)劑,能夠有效地抑制縫隙連接[9]。本研究應(yīng)用低濃度(2.5 μmol/L)的油酸酰胺來(lái)抑制縫隙連接通訊,MTT 試驗(yàn)表明該濃度油酸酰胺對(duì)ADSCs 增殖未產(chǎn)生影響,無(wú)明顯細(xì)胞毒作用。

    本實(shí)驗(yàn)采用1.0 mmol/L 丙戊酸在體外誘導(dǎo)ADSCs 分化。免疫細(xì)胞化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)顯示B組細(xì)胞高表達(dá)許旺細(xì)胞特異標(biāo)記物S100、NSE 和神經(jīng)干細(xì)胞特異標(biāo)志物Nestin;經(jīng)油酸酰胺干預(yù)后C組細(xì)胞的S100、NSE、Nestin 表達(dá)水平顯著下調(diào);而B(niǎo)組和C組的Cx43 表達(dá)均顯著增加;這提示丙戊酸可有效地誘導(dǎo)ADSCs分化為類(lèi)許旺細(xì)胞,其作用能夠被油酸酰胺顯著抑制。

    本研究創(chuàng)新性地指出縫隙連接細(xì)胞間通訊在丙戊酸誘導(dǎo)ADSCs神經(jīng)分化中的重要性,從基因和蛋白水平證實(shí)丙戊酸通過(guò)上調(diào)Cx43表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)ADSCs向許旺細(xì)胞分化,該分化可被油酸酰胺干預(yù)顯著抑制,這提示油酸酰胺可能通過(guò)阻斷縫隙連接細(xì)胞間通訊抑制丙戊酸的神經(jīng)誘導(dǎo)分化作用。本研究中,丙戊酸明顯上調(diào)Cx43表達(dá),油酸酰胺在抑制丙戊酸的誘導(dǎo)分化作用的同時(shí)對(duì)Cx43 表達(dá)卻沒(méi)有影響,這可能是通過(guò)影響Cx43的翻譯后修飾來(lái)發(fā)揮效應(yīng),具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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