土壤病毒的研究進展與挑戰(zhàn)*

王光華，劉俊杰，朱 冬，葉 茂，朱永官，4

（1. 中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/中國科學(xué)院黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，哈爾濱 150081；2. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085；3. 中國科學(xué)院南京土壤研究所/中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室，南京 210008；4. 中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所，廈門 361021）

病毒是個體非常微小、結(jié)構(gòu)簡單，由蛋白質(zhì)外殼包被的內(nèi)部含有遺傳物質(zhì)核酸的非細(xì)胞型生物實體。按照核酸的組成，病毒可劃分為雙鏈DNA（dsDNA）、單鏈DNA（ssDNA）、雙鏈RNA（dsRNA）、正單鏈RNA（ssRNA+）和負(fù)單鏈RNA（ssRNA-）。通常病毒被認(rèn)為是不具有酶系統(tǒng)，不能夠獨立繁殖生活，病毒的繁殖必須依賴于寄主系統(tǒng)，所以長期以來病毒是否被視為生物一直存在爭議[1]。但這種現(xiàn)象目前有所改變，科學(xué)家們從多種環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了一些感染原生動物的病毒粒子，其尺寸較大，被稱為巨大病毒，如梅格病毒（Megavirus）和潘多拉病毒（Pandoravirus）粒子直徑分別達(dá)到440 nm和1 000 nm，其基因組大小分別為1.26 Mbp和2.5 Mbp，這些巨大病毒具有獨特的酶系統(tǒng)[2-4]，有的病毒還被其他病毒（噬病毒體Virophage）侵染[2，5]，這些發(fā)現(xiàn)動搖了學(xué)術(shù)界對生命之樹的認(rèn)知，有觀點認(rèn)為病毒可看做為生命的第四個域——病毒域[6]。事實上，病毒可以侵染生命之樹上其他三域的生物，通常學(xué)術(shù)界將侵染細(xì)菌和古菌的病毒，即侵染原核微生物的病毒稱為噬菌體。目前國際上分離獲得的細(xì)菌病毒有6 000多株，而古菌病毒僅100多株[7]。與細(xì)菌病毒遺傳物質(zhì)組成不同，古菌病毒的遺傳物質(zhì)多是dsDNA，少數(shù)是ssDNA，尚未發(fā)現(xiàn)含有RNA的古菌病毒[8]。有觀點認(rèn)為病毒可能較地球上所有生物的共同祖先露卡（LUCA）出現(xiàn)的更早[9]，地球上所有具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物都能夠被一種甚至多種病毒所侵染[10]，病毒在侵染過程中基因不斷地突變，也不斷地與寄主間進行遺傳物質(zhì)的交流，從而確保病毒能夠生存下去，也使寄主生物獲得新的基因，產(chǎn)生新的性狀，促進了地球生物的進化演替。

土壤是各種生物的重要棲息地，土壤中存在著數(shù)量巨大，種類繁多的病毒生命體。雖然學(xué)術(shù)界普遍意識到病毒在土壤各種生態(tài)過程中可能起到重要的作用，但由于受到土壤的異質(zhì)性、多樣性，以及研究手段等方面的限制，目前國際上對土壤病毒研究的重視程度遠(yuǎn)落后于流動的海洋環(huán)境[11-13]。本文從生態(tài)學(xué)角度，基于目前國內(nèi)外病毒研究現(xiàn)狀，尤其是針對土壤病毒的研究給予回顧，期望起到拋磚引玉的作用，引起國內(nèi)同行對土壤病毒研究的關(guān)注和重視。

1 土壤病毒形態(tài)與數(shù)量

1.1 土壤病毒的形態(tài)

病毒大小通常是納米級的，普通光學(xué)顯微鏡無法捕捉到病毒的身影，必須通過透射電子顯微鏡（TEM）才能觀測到。病毒形態(tài)多種多樣，目前發(fā)現(xiàn)古菌病毒形態(tài)有16種，而細(xì)菌病毒形態(tài)有9種，可見雖然目前得到的古菌病毒純分離株遠(yuǎn)少于細(xì)菌病毒，但其形態(tài)多樣性卻高于細(xì)菌病毒[7]。土壤中的古菌病毒和細(xì)菌病毒多以具有頭尾結(jié)構(gòu)的有尾噬菌體為主。有尾噬菌體是dsDNA病毒，按其尾部形態(tài)特征可劃分為短尾（Podophage）、長尾（Siphophage）和肌尾（Myophage）噬菌體[7]。土壤中其他病毒形態(tài)還有絲狀、桿狀、棒狀、瓶狀、水滴狀、球狀和二十面體狀等[8]。真核生物病毒沒有頭尾結(jié)構(gòu)，形態(tài)更加多樣，有的蛋白質(zhì)外殼上還有修飾成分，與原核生物病毒有很大的不同（圖1）。

圖1 侵染細(xì)菌、古菌和真核生物的dsDNA病毒分類及形態(tài)示意圖（改自Prangishvili等[14]）Fig. 1 Classification and morphological diagrams of the dsDNA viruses that infect bacteria，archaea and eukaryotes（Modified from Parangishvili et al. [14]）

1.2 土壤病毒存在形式

病毒在土壤中的存在形式大致可歸為3種：少部分病毒以游離狀態(tài)存在于土壤溶液中；大部分病毒被吸附在土壤顆粒上；還有一部分是溫和性噬菌體（lysogenic or temperate phage），其基因組插入在寄主基因組上，以溶原（prophage）狀態(tài)存在于細(xì)胞內(nèi)[11，15]。溫和性噬菌體在土壤中普遍存在，尤其是在寄主分布不均勻[16]、寄主數(shù)量少[17-18]或寄主細(xì)胞生長狀況不好[17，19]的情況下，噬菌體以溶原狀態(tài)伴隨著寄主細(xì)胞繁殖而繁殖，避免受到外面不利環(huán)境條件的影響，從而確保噬菌體在寄主種群中能夠長期存活繁殖下去的最佳方式。一般而言，在某個環(huán)境中病毒與細(xì)菌比值（VBR）數(shù)值小時，噬菌體主要以溶原狀態(tài)存在，而當(dāng)VBR數(shù)值大時，則以烈性噬菌體（lytic phages）為主[20-22]。相比于營養(yǎng)貧乏的海水環(huán)境，營養(yǎng)豐富的土壤中溶原性噬菌體占比較高[20，23]。溶原性噬菌體也是極端干熱沙漠條件下噬菌體主要存在形式[24]，而在冷沙漠中噬菌體主要以游離的烈性噬菌體為主[21]。溶原狀態(tài)噬菌體在土壤中存在，也可通過土壤細(xì)菌全基因組測序而發(fā)現(xiàn)，有研究表明許多細(xì)菌基因組中含有1個或多個前噬菌體元件（prophage element）[25]，其中默冗子（moron）是前噬菌體元件的一個重要部分[26-27]。默冗子在噬菌體基因組中不具有編碼功能，但當(dāng)它整合在細(xì)菌基因組中則通過基因溶原性轉(zhuǎn)換（lysogenic conversion），使細(xì)菌獲得新的性狀和功能，提高細(xì)菌環(huán)境生存適應(yīng)能力[28-30]。

1.3 土壤病毒數(shù)量

目前地球生物圈上到底有多少病毒還沒有準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，普遍認(rèn)為全球病毒數(shù)量＞1031[31]。有學(xué)者依據(jù)不同生境中病毒與細(xì)菌或與微生物的比值（VBR或VMR），推算出全球病毒粒子的數(shù)量為4.80×1031，其中在沉積物和土壤中數(shù)量分別占到87%和10%，而在海洋水體中只占2.7%，可見土壤環(huán)境中病毒數(shù)量非常巨大[32]。不同環(huán)境中病毒豐度存在較大差異，將病毒顆粒（virus-like particles，VLPs）用熒光核酸染料染色，然后在熒光顯微鏡（EFM）下計數(shù)發(fā)現(xiàn)，每毫升海水中VLPs在105～107個之間[33-34]，河口或湖泊淡水中VLPs可達(dá)到每毫升108個[35]；而在森林土壤和農(nóng)田土壤中，每克土壤VLPs數(shù)量分別在1.31×109～4.17×109個和0.87×109～1.1×109個之間[36]。最近，Williamson等[37]對熱帶沙漠、寒帶沙漠、森林、農(nóng)田和濕地等環(huán)境下的土壤病毒和細(xì)菌數(shù)量進行Meta數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，病毒在沙漠土壤中豐度最低，森林土壤中豐度最高，土壤類型與病毒數(shù)量高度相關(guān)（r=0.803，P＜0.001）；發(fā)現(xiàn)土壤病毒數(shù)量與土壤細(xì)菌數(shù)量呈高度正相關(guān)（r=0.647，P＜0.001）；發(fā)現(xiàn)土壤病毒數(shù)量與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)（r= -0.352，P=0.009）。同時他們也認(rèn)為土壤溫度和濕度也是影響土壤病毒數(shù)量的重要土壤因子，但由于數(shù)據(jù)的缺乏，兩者之間的相關(guān)性尚未建立起來[37]。需要指出的是，目前對土壤病毒數(shù)量的研究工作主要是針對土壤中游離的和被土壤顆粒吸附的病毒，尚無法大規(guī)模地開展針對土壤中溶原性病毒的計數(shù)研究，所以現(xiàn)有觀察到的數(shù)據(jù)可能遠(yuǎn)低于土壤中病毒的真實數(shù)量。

由于大部分病毒被吸附在土壤顆粒上，如何從土壤中將病毒高效率地分離提取出來是準(zhǔn)確測定病毒數(shù)量的前提條件。美國學(xué)者Wommack團隊[38]對比研究了10%的牛肉膏溶液、250 mmol·L-1甘氨酸溶液、10 mmol·L-1焦磷酸鈉溶液和1%檸檬酸鉀溶液從粉砂壤土和砂壤土中提取病毒的效果，發(fā)現(xiàn)1%檸檬酸鉀溶液是最佳的土壤病毒浸提劑。在此基礎(chǔ)上，Trubl等[39]改進了提取劑配方，發(fā)現(xiàn)1%檸檬酸鉀溶液+10%磷酸鹽緩沖液+5 mmol·L-1的EDTA溶液+150 mmol·L-1硫酸鎂溶液對富含有機質(zhì)的泥炭和沼澤土壤中病毒提取效率最高，提取出的病毒數(shù)量是其他提取劑的2倍。而張輝等[40]以MS2和φx174作為指示病毒，研究發(fā)現(xiàn)含有0.04 mol·L-1焦磷酸鈉的3%牛肉膏溶液提取效果最好，用此提取劑指示病毒在紅壤土、紅黏土和潮土上的回收率達(dá)63%～98%，但在黃泥土上的回收率僅30%?？梢娡环N病毒提取劑的提取效率因土壤類型而異。需要注意的是，從土壤中提取病毒溶液的操作過程多伴隨采用超聲波、渦旋、劇烈震蕩，有的甚至采用珠打法（bead-beating）等物理分散技術(shù)，這些劇烈的分散過程可以導(dǎo)致有尾噬菌體尾部結(jié)構(gòu)折斷或丟失，從而降低了觀察到的有尾噬菌體比例[41-42]。

VMR或VBR數(shù)值大小也能間接地反映出環(huán)境病毒數(shù)量的高低。VBR在不同環(huán)境中的變幅很大，如在海洋和湖泊水體中數(shù)值在3～25之間[33-34，43]，而在稻田水中變幅在0.11～72之間[44]。與水體環(huán)境相比，土壤中VBR變幅更大，有研究發(fā)現(xiàn)森林和農(nóng)田土壤中的VBR分別為10和3 000[36]，而在沙漠土壤中其數(shù)值僅0.15～1.66[45]。在根際微域環(huán)境中，有研究發(fā)現(xiàn)每克小麥根際土壤中VLPs是1.18×109個，與非根際土壤病毒數(shù)量沒有顯著差異，從而導(dǎo)致根際VBR為0.27，而非根際土壤是4.68[41]。這一發(fā)現(xiàn)表明盡管根際土壤細(xì)菌數(shù)量非常大（根際效應(yīng)），但根際細(xì)菌病毒并沒有體現(xiàn)出同步的增加規(guī)律，即根際細(xì)菌病毒數(shù)量沒有體現(xiàn)出根際效應(yīng)。這種現(xiàn)象與通常認(rèn)為的細(xì)菌-病毒生長模型“殺死優(yōu)勝者Kill-the-Winner”不符合[34，46]。最近，來自國外科學(xué)家在對珊瑚礁后生動物黏膜表面細(xì)菌和病毒之間相互作用研究中發(fā)現(xiàn)一個新的細(xì)菌-病毒生長模型，即“搭乘優(yōu)勝者Piggyback-the-Winner”[47]。在這個模型中，病毒以溶原狀態(tài)將病毒基因整合到寄主細(xì)胞體內(nèi)，隨著寄主細(xì)胞繁殖而繁殖，避免與其他病毒競爭，也避免觸動宿主自身的免疫系統(tǒng)。這種“搭乘優(yōu)勝者”模型是否是植物根際細(xì)菌病毒的生存策略還未見直接證據(jù)支持。此外，也有學(xué)者認(rèn)為根際細(xì)菌病毒數(shù)量與非根際土壤無差異的原因也可能與根際細(xì)菌受到根系分泌物選擇的作用而不易于被病毒侵染有關(guān)[13]。

1.4 土壤病毒生物量

全球病毒數(shù)量保守估計在1031以上，那么這些病毒生物量是多少呢？Cobián Güemes等[32]根據(jù)一個典型噬菌體含有50 kbp的DNA質(zhì)量為0.054 fg（飛克），而殼蛋白質(zhì)質(zhì)量為0.028 3 fg，推算出全球4.80×1031VLPs的質(zhì)量是3.95×1015g（3.95 Pg或3.95 Gt）。按照典型病毒化學(xué)計量學(xué)C︰N︰P =20︰6︰1計算[48]，全球病毒生物量估算有2.92 Pg C、0.88 Pg N和0.15 Pg P。如果全球原核生物含有350～500 Pg C[49]，那么病毒生物量碳約占原核生物量碳的0.58%～0.83%。而另一篇文獻認(rèn)為全球所有生物只有大約550 Gt C，其中細(xì)菌為70 Gt C，古菌大約為7 Gt C，病毒含有大約0.2 Gt C[50]，這一估算數(shù)值較Cobián Güemes等[32]報道數(shù)據(jù)縮小了10倍，但兩篇文獻均表明病毒生物量相對于原核生物生物量而言非常小。與細(xì)菌細(xì)胞C︰N︰P的化學(xué)計量為60︰16︰1相比[51]，細(xì)菌病毒顆粒富含N和P，尤其是P元素。雖然病毒生物量相比原核生物和真核生物而言非常小，但其數(shù)量巨大，周轉(zhuǎn)快，在全球生物地球化學(xué)循環(huán)中起到非常重要的作用[52]。以海洋環(huán)境為例，有研究估測每天有1028個細(xì)菌被病毒感染而裂解，其中大約30%是具有光合作用的藍(lán)細(xì)菌，60%是異養(yǎng)細(xì)菌[52-53]。海洋中某些區(qū)域有超過5%的可溶性有機磷和氮來源于病毒顆粒[48]。有報道指出海洋環(huán)境中大約6%～25%的碳循環(huán)量是由病毒驅(qū)動的[33]，但在土壤環(huán)境中，病毒是如何及在多大程度上驅(qū)動碳循環(huán)過程還鮮見報道。

2 土壤病毒多樣性

由于病毒不能獨立繁殖，而大量環(huán)境微生物的不可培養(yǎng)性，無疑限制了對病毒多樣性的認(rèn)知。全球到底有多少種病毒尚無確切的答案。現(xiàn)有的報道均為基于推測的結(jié)果，例如有文獻報道[54-55]，全球有1 000萬種微生物（主要是細(xì)菌和古菌），而每種微生物可被10種不同的病毒侵染，則全球會有超過1億種的病毒[56-57]。筆者認(rèn)為這種推測有可能高估了病毒的多樣性，因為隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)病毒與被侵染寄主之間具有很強專一性的觀點被不斷修正[58]，如有些細(xì)菌病毒在細(xì)菌分類屬、目，甚至在門水平上能夠跨物種感染不同寄主[59-60]。最近，Williamson 等[37]基于病毒宏基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)土壤中病毒基因型（genotype）在1 000～1 000 000之間；與土壤相對應(yīng)，海洋中病毒基因型在532～129 000之間，在淡水環(huán)境為400～40 000之間[61]?？梢娡寥啦《径鄻有缘纳舷藓拖孪蘧哂谒w環(huán)境中的病毒，充分說明土壤病毒是一個巨大的未知基因資源庫。

2.1 分子標(biāo)記基因解析病毒多樣性

采用保守性的引物，利用PCR技術(shù)對原核微生物的16S或真核生物18S rRNA基因片段進行擴增，然后對PCR產(chǎn)物進行基因信息解析，是目前研究環(huán)境微生物基因多樣性和群落組成的主流技術(shù)。然而對于病毒而言，由于其基因組的高度變異性和雜合性，在病毒基因組中尚未發(fā)現(xiàn)保守序列設(shè)計出通用引物，用于環(huán)境病毒基因多樣性解析[62]。但有研究發(fā)現(xiàn)，針對一些特定病毒家族，其基因組中編碼某些結(jié)構(gòu)或功能蛋白的氨基酸片段序列高度保守，可基于此序列設(shè)計出簡并性引物，然后從環(huán)境中提取eDNA，直接進行PCR擴增目標(biāo)基因，測序分析特定病毒家族遺傳基因多樣性及分布格局[63]。2014年Adriaenssens和Cowan[64]在一篇綜述文章中歸納出多個病毒標(biāo)記基因可用于解析環(huán)境特定病毒多樣性及其生態(tài)學(xué)研究。需要說明的是這些標(biāo)記基因多是針對海洋、湖泊等水體環(huán)境中細(xì)菌病毒基因多樣性研究的，適用于土壤細(xì)菌病毒研究最常用的標(biāo)記基因是g23，該基因是編碼T4型噬菌體主要殼蛋白的結(jié)構(gòu)基因。該基因最先是由Filée等[65]發(fā)現(xiàn)可用于研究海洋中T4型噬菌體多樣性，隨后Jia等[66]證明g23基因也可適用于研究稻田土壤中T4型噬菌體基因多樣性，從而開啟了g23基因在土壤病毒研究中應(yīng)用的序幕[67-68]。針對該基因，中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)田分子生態(tài)學(xué)科組從我國東北稻田、濕地和黑土農(nóng)田中捕捉到數(shù)百條不同的T4型噬菌體g23基因，發(fā)現(xiàn)旱地黑土農(nóng)田T4型噬菌體分布與其在海洋和湖泊水體環(huán)境中明顯不同，而與稻田環(huán)境相近，從黑土農(nóng)田獲得的基因序列中建立了多個新的T4型噬菌體g23基因群[69-70]。發(fā)現(xiàn)即使在相同稻田環(huán)境，中國東北稻田T4型g23基因群集（Assemblage）與日本稻田不同，由此得出T4型噬菌體分布受到地理分隔和生態(tài)過程的雙重調(diào)控的觀點[70-71]。此外，我們還對g20基因（編碼藍(lán)藻肌尾噬菌體殼組裝蛋白）[72-73]、DNApol基因（編碼藍(lán)藻短尾噬菌體DNA聚合酶基因）[74-75]、輔助代謝基因psbA（編碼藍(lán)藻噬菌體光合蛋白基因）[76]和phoH（編碼噬菌體磷酸鹽調(diào)節(jié)基因）[77-78]在東北稻田和濕地中基因組成及多樣性進行了研究。揭示出這些標(biāo)記基因表征的噬菌體群落結(jié)構(gòu)組成在稻田和濕地環(huán)境中與海洋環(huán)境完全不同，并且在濕地與稻田間也存在差異，建立了多個獨特的稻田和濕地噬菌體類群。由此可見，一些用于研究海洋環(huán)境噬菌體多樣性的標(biāo)記基因也適合用于陸地生態(tài)環(huán)境，說明細(xì)菌病毒有著共同的起源祖先；而基于分子標(biāo)記基因群集表征的特定噬菌體群落結(jié)構(gòu)在海洋、濕地、稻田，乃至旱地土壤中的不同，也從一個側(cè)面顯示出細(xì)菌病毒從海洋到陸地生態(tài)系統(tǒng)的演替過程。

2.2 RAPD-PCR解析病毒多樣性

由于尚未發(fā)現(xiàn)通用引物適應(yīng)于病毒多樣性研究，如何解析環(huán)境特別是土壤中病毒多樣性是一個挑戰(zhàn)性課題。隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random Amplified Polymorphic DNA ，RAPD）是采用隨機的10個堿基核苷酸序列同時作為正向和反向引物進行PCR擴增，是對未知序列基因組進行多態(tài)性分析的技術(shù)[79]。Winget和Wommack[80]首次將該技術(shù)運用到美國切薩皮克灣水體病毒群落研究，他們根據(jù)擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜中條帶的位置（長度）、亮度（豐度）分布情況，分析出不同樣本間病毒群落結(jié)構(gòu)及其相似度，然后對條帶進行切膠測序，分析病毒組成。這種分析方法與DGGE-PCR技術(shù)解析環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)流程基本類似。利用該技術(shù)，Helton和Wommack[81]進一步分析了切薩皮克灣沉積物中病毒基因多樣性，發(fā)現(xiàn)沉積物病毒結(jié)果存在明顯的時空分變化；Srinivasiah等[82]揭示出南極不同地點土壤病毒群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所徐慧團隊[83]采用該技術(shù)并結(jié)合高通量測序技術(shù)，對長期灌溉和施用尿素的稻田土壤中病毒和細(xì)菌群落豐度及多樣性進行動態(tài)解析，發(fā)現(xiàn)添加尿素延遲了病毒豐度峰值的出現(xiàn)，說明病毒對氮肥添加非常敏感。需要注意的是，運用該技術(shù)的前提條件是要確保提取到的DNA沒有寄主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的干擾，然后才可進行PCR擴增。此外，也要考慮到單個隨機引物擴增的偏好性，會導(dǎo)致在對病毒群落結(jié)構(gòu)解析時存在偏差。故此，應(yīng)用該技術(shù)時，建議采用多個隨機引物進行擴增，然后將不同引物擴增得到的凝膠電泳條帶圖譜整合為一個數(shù)據(jù)集，再進行病毒群落結(jié)構(gòu)解析。

2.3 宏基因組學(xué)解析病毒多樣性

雖然RAPD-PCR技術(shù)在一定程度上能夠?qū)Σ煌瑯颖静《救郝浣Y(jié)構(gòu)進行解析，但該技術(shù)尚不能對病毒成員進行定性描述，還需后期大量的條帶切膠測序工作。隨著基因測序技術(shù)的飛速發(fā)展，高通量測序技術(shù)已成為研究環(huán)境微生物組的主流技術(shù)。其中宏基因解析技術(shù)目前成為不依賴于特定引物擴增的環(huán)境病毒組研究的熱點領(lǐng)域[84-87]。與RAPD-PCR研究相同，環(huán)境病毒宏基因組學(xué)解析的前提條件是去除細(xì)胞生物遺傳基因在病毒遺傳物質(zhì)中的污染。為此，研究者們在病毒基因提取、純化等方法學(xué)研究上開展了許多工作，包括利用不同孔徑微孔濾膜的切向過濾法（TFF）、核酸酶消化處理去除病毒濃縮液中細(xì)胞生物遺傳物質(zhì)、10%聚乙二醇（PEG）溶液沉淀濃縮病毒顆粒、濃度為2.9 mg·L-1的FeCl3溶液作為病毒絮凝劑的絮凝-過濾-再懸浮方法（FFR）、20%蔗糖墊超離心純化法或不同密度CsCl溶液超離心純化法等[85，88-90]。需要指出的是，這些方法對環(huán)境病毒的分離過程的第一步均是采用將提取到的病毒溶液通過0.2 μm的微孔濾膜而富集，這一步驟無疑會將一些尺寸較大的病毒，如巨大病毒等排出在外[91]。2009年Nature Protocols上發(fā)表一篇文章，詳細(xì)介紹了針對水體樣品宏病毒基因組學(xué)研究的方法[90]，該文研究策略可推廣應(yīng)用到土壤病毒宏基因組解析，不同之處在于土壤有前處理，也就是從土壤中高效地分離提取出病毒溶液的過程。在開展環(huán)境宏病毒基因組學(xué)研究另一個需要注意的事項是提取到的病毒遺傳物質(zhì)量的多少。雖然環(huán)境病毒數(shù)量明顯高于寄主生物，但由于提取效率低和病毒基因組小的原因，從常規(guī)的樣本用量（如水樣20 L，土樣10～50 g）中提取到的病毒遺傳物質(zhì)量很少，不能滿足后續(xù)宏基因組研究的需要，需要經(jīng)過體外擴增技術(shù)以增加病毒遺傳物質(zhì)的濃度，達(dá)到測序的要求。目前常用的方法有兩種：一是多重置換擴增（MDA）技術(shù)，即采用φ 29 DNA聚合酶進行擴增技術(shù)[87，90]；二是連接擴增（LASL）技術(shù)[92]。需要引起注意的是兩種擴增技術(shù)在擴增產(chǎn)物上存在偏好性，采用MDA傾向于擴增出ssDNA病毒，而采用LASL得到的病毒數(shù)據(jù)全部來自于dsDNA病毒[93]。其他研究土壤病毒宏基因組結(jié)果也證實MDA法傾向于獲得大量的ssDNA病毒[94-95]。這樣的結(jié)果與土壤中實際情況不符合，因為土壤病毒主要以噬菌體為主，且以dsDNA的有尾噬菌體占有較高的比例。為了避免體外擴增產(chǎn)生的偏好性，有研究者采用加大土壤樣品用量，甚至到幾千克，然后從土壤中大量富集病毒顆粒，提取病毒遺傳物質(zhì)，直接進行宏基因組測序的方法[96-97]。需要指出的是，上述研究方法主要是針對DNA病毒，對于環(huán)境RNA病毒宏基因組研究則需要采取其他的技術(shù)，通常采用的是RP-SISPA（Random Priming-mediated Sequence-Independent Single Primer Amplification）基因擴增，然后再進行高通量測序[98-99]。圖2匯總了基于DNA水平對土壤病毒研究的主要方法及流程圖。

圖2 土壤病毒研究的主要方法及流程圖Fig. 2 Main methods used in researches on soil viruses and their flowcharts

制約環(huán)境病毒宏基因組研究的另一個瓶頸問題是對基因數(shù)據(jù)解析的困惑。與細(xì)菌等微生物數(shù)據(jù)庫相比，病毒基因數(shù)據(jù)庫非常匱乏，從而導(dǎo)致絕大多數(shù)環(huán)境病毒宏基因組序列缺少參比對象，基因來源不清，被劃分為未知基因，即使在剩下已比對上的基因中，也僅有非常小的一部分被確定為病毒，大部分基因與來源于細(xì)胞生物基因，尤其是細(xì)菌具有較高的同源性[84，87，100]。例如中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心賀紀(jì)正團隊對海灘和稻田土壤的病毒宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，僅9.4%～40.5%的序列可以被注釋為已知的微生物信息，而在這些已知信息中被注釋為病毒的占到82%～97%[101]。Trubl等[86]對瑞典一個凍融地帶泥炭和沼澤土壤病毒宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，盡管采用了嚴(yán)格的去除寄主遺傳物質(zhì)的步驟，但僅19%的序列被鑒定為病毒。Williamson等[37]總結(jié)國際上8個土壤病毒宏基因組數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，有54.5%～97.3%的序列為未知來源和功能的序列。同樣，最近中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心韓麗麗團隊[102]對玉米根際與非根際土壤病毒宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，僅0.26%～1.54%的序列被確認(rèn)為病毒。大量源自病毒宏基因中的序列為未知基因，所以病毒也被喻為生物“暗物質(zhì)”[57]。由此可見，高比例的環(huán)境病毒宏基因序列與已知的病毒數(shù)據(jù)不匹配，一定程度上妨礙了對病毒群落結(jié)構(gòu)及生態(tài)功能的深入解析，這也反映出對環(huán)境病毒分離、純化和測序的重要性。只有基于病毒基因數(shù)據(jù)庫不斷擴大、完善基礎(chǔ)上，對環(huán)境病毒宏基因組解析才能夠更全面、更深入。目前國外學(xué)者相繼開發(fā)出多款數(shù)據(jù)分析軟件，如VIROME、VirSorter、Metavir和VirusSeeker等，用于環(huán)境病毒宏基因組數(shù)據(jù)解析[103-106]。

3 土壤病毒的生態(tài)功能

雖然土壤病毒數(shù)量巨大且廣泛存在，但我們對土壤病毒生態(tài)功能的認(rèn)知尚處于初級階段，主要的功能理解多源自病毒基礎(chǔ)知識和海洋生態(tài)系統(tǒng)的相關(guān)研究結(jié)果，尚缺乏直接源自土壤中的實驗佐證。2018年德國哥廷根大學(xué)的Kuzyakov和Mason-Jones[15]撰文從5個角度對土壤病毒的生態(tài)功能給予概念性的描述：1）病毒路徑（Viral shunt）：即土壤微生物被病毒感染裂解死亡，導(dǎo)致微生物中的碳氮磷硫等營養(yǎng)元素釋放出來被其他微生物和植物利用的過程。在海洋中由病毒驅(qū)動的碳循環(huán)量占海洋生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)總量的6%～26%[33]，在土壤環(huán)境中，營養(yǎng)元素循環(huán)在多大強度上受到病毒驅(qū)動還鮮見報道；2）促進土壤微生物快速周轉(zhuǎn)，保持活力狀態(tài)（Forever young）：即由于土壤病毒的感染，導(dǎo)致土壤細(xì)菌快速更替，從而使存活的細(xì)菌始終處于年輕狀態(tài)，具有旺盛的代謝活力；3）病毒調(diào)節(jié)“胞外酶代謝”（Viral regulatory gate of EXOMET）。胞外酶代謝是指微生物細(xì)胞體內(nèi)酶釋放到環(huán)境中，起到分解有機物質(zhì)的作用。這個概念是2013年Maire等[107]首次提出的，他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過γ-射線處理幾周的土壤已經(jīng)沒有微生物存活，但這些土壤培養(yǎng)后還釋放出相當(dāng)于未照射土壤處理的20%～60% CO2排放量。從這個現(xiàn)象中，我們不難理解土壤病毒感染微生物后，導(dǎo)致微生物裂解、胞內(nèi)酶釋放到土壤中，間接地促進了土壤有機物分解轉(zhuǎn)化；4）通過微生物死體穩(wěn)定性轉(zhuǎn)化，促進土壤固碳作用（C sequestration by microbial necromass stabilization）。土壤有機質(zhì)是土壤碳庫穩(wěn)定存在形式，Liang等[108]分析發(fā)現(xiàn)50%以上的土壤有機質(zhì)來源于微生物死亡細(xì)胞，即通過微生物碳泵的續(xù)埋作用（Entombing effect）促進土壤固碳[109]。病毒導(dǎo)致微生物死亡，形成了大量的殘體碎片，可能促進了土壤有機質(zhì)形成，起到固碳作用。需要說明的是，微生物細(xì)胞被病毒裂解后形成的死亡殘體與細(xì)胞受到非生物因素致死形成的殘體，哪種途徑更有利于促進土壤有機質(zhì)形成尚無答案；5）引起土壤微域尺度C、N和P化學(xué)計量學(xué)分異（Microscale divergence of C/N/P stoichiometry）。這種作用主要是基于寄主細(xì)胞和病毒之間C、N和P化學(xué)計量學(xué)比值的差異，細(xì)菌病毒較細(xì)菌富含N和P，尤其是P元素。病毒感染細(xì)菌細(xì)胞裂解后，細(xì)菌細(xì)胞中有大約10%的碳、15%的氮和33%的磷營養(yǎng)轉(zhuǎn)變成病毒顆粒成分，不能被植物和其他生物利用，從而影響生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)。這種由于微生物和病毒之間元素化學(xué)計量差異而引起的磷營養(yǎng)限制僅在海洋環(huán)境中有報道[48]，在土壤環(huán)境中，由于病毒生物量很小，以及土壤中養(yǎng)分含量相對較高的緣故，筆者推測病毒通過這種方式影響土壤養(yǎng)分循環(huán)的作用可能微乎其微。

上述土壤病毒功能主要是基于病毒基礎(chǔ)知識認(rèn)知推測得來的。從病毒生態(tài)學(xué)角度來分析，土壤病毒還有以下幾方面功能：1）土壤病毒起到由上而下（Top-down）調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)的作用，從而間接地影響到土壤生態(tài)功能[110-111]。如向土壤中接種烈性根瘤菌噬菌體能夠降低根瘤菌數(shù)量，從而降低根瘤量[112]；向土壤中接種青枯病菌噬菌體，通過噬菌體療法能夠降低作物青枯病的危害[113]等；2）土壤病毒還是基因水平移動的載體，病毒與寄主之間不斷地進行基因交流或突變，使得病毒和微生物獲得新的性狀和功能，共進化推動了地球生物群落不斷演替[46]；3）土壤病毒基因組攜帶輔助代謝基因（Auxiliary metabolic genes，AMGs），協(xié)助寄主微生物驅(qū)動生物地球化學(xué)循環(huán)。如最近對紅樹林土壤和農(nóng)田土壤研究均發(fā)現(xiàn)病毒宏基因組中含有多種水解多糖類物質(zhì)的CAZymes基因，推測這些基因在促進土壤碳循環(huán)中起到重要作用[102，114]；4）土壤病毒可通過介導(dǎo)抗性基因的水平轉(zhuǎn)移及調(diào)節(jié)宿主菌代謝通路來協(xié)助宿主抵抗低營養(yǎng)、輻射和污染等多種生態(tài)脅迫，對維持受脅迫生態(tài)環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)及功能穩(wěn)定具有重要意義[115-116]。但目前關(guān)于低營養(yǎng)脅迫下的這一功能進行了較多研究，而針對污染環(huán)境（如農(nóng)藥污染、石油污染和重金屬污染等）中，噬菌體協(xié)助宿主適應(yīng)環(huán)境的相關(guān)研究還很少。圖3概況了以土壤病毒為中心，病毒起到的直接或間接生態(tài)功能。

圖3 土壤病毒主要生態(tài)功能示意圖Fig. 3 Diagram of the main ecological functions of the viruses in soil

4 展 望

土壤中蘊藏著巨大的生物多樣性，僅以原核生物為例，其在土壤中的多樣性較其他生態(tài)系統(tǒng)的總和高出3個數(shù)量級[117-118]，鑒于土壤微生物多樣性高和巨大的生態(tài)功能，世界許多國家相繼實施了一系列重要的土壤微生物組研究計劃，中國科學(xué)院也于2014年啟動了“土壤-微生物系統(tǒng)功能及其調(diào)控”戰(zhàn)略先導(dǎo)專項，取得了一系列重要發(fā)現(xiàn)和成果[119]。這些研究主要涉及到具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的微生物，很少涉及土壤病毒。進入21世紀(jì)，海洋領(lǐng)域病毒生態(tài)學(xué)研究發(fā)展迅速，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)病毒尤其是噬菌體在海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)、能量流動，以及維持海洋生物多樣性和生物進化等方面起到重要的作用[31，52，120-121]。與海洋研究相比，針對土壤病毒研究卻進展緩慢[11，37]。鑒于土壤病毒存在狀態(tài)，以及土壤種類多樣性和土壤環(huán)境的高度異質(zhì)性，土壤中病毒組成較海洋等水體環(huán)境更復(fù)雜、多樣性更高，研究的挑戰(zhàn)性也會更大[12]。目前世界各國科學(xué)家已意識到了土壤病毒的重要作用和研究的緊迫性，相繼發(fā)表了一些綜述性文章報道土壤病毒研究進展，呼吁學(xué)術(shù)界對土壤病毒研究的重視[11-13，15，37，122]。本文梳理了一些土壤病毒研究的最新進展，從這些研究結(jié)果看，我們對土壤病毒的認(rèn)知還很有限，尤其是對土壤病毒生態(tài)功能展示方面還缺乏直接的證據(jù)，缺乏將土壤病毒群落與寄主群落演替耦合起來的研究策略?；诖耍J(rèn)為未來對土壤病毒研究應(yīng)在以下方面給予加強。

4.1 重視對土壤RNA病毒的研究

目前多數(shù)研究結(jié)果是針對土壤DNA病毒，較少涉及到土壤RNA病毒，而許多侵染真核生物的病毒是RNA病毒，尤其是導(dǎo)致人、畜和家禽流行性疾病的病毒，以及絕大多數(shù)的引起植物病害的病毒都是RNA病毒，如引起新冠肺炎病毒、各種禽流感病毒、煙草花葉病毒和馬鈴薯Y病毒等。有關(guān)這些病原性的RNA病毒在土壤中生存狀態(tài)、遷移，以及活性受那些土壤因素影響，是否具有感染能力等問題還缺少系統(tǒng)性的研究。

4.2 關(guān)注對土壤溶原性噬菌體的研究

現(xiàn)階段對土壤病毒研究多采用基于微孔膜過濾富集病毒顆粒的方法，這種方式無疑將大部分溶原性噬菌體屏蔽在外，而土壤中溶原性噬菌體是土壤病毒主要存在形式，缺乏對溶原性噬菌體的研究，也限制了對土壤整體病毒多樣性及生態(tài)功能的認(rèn)知。

4.3 關(guān)注土壤病毒資源的開發(fā)，提高土壤病毒研究的市場經(jīng)濟價值

土壤病毒不僅是最大的基因?qū)殠?，許多病毒資源也具有非常大的應(yīng)用價值，如從土壤環(huán)境中篩選出能夠高效裂解動植物致病細(xì)菌的噬菌體資源，應(yīng)用噬菌體療法防控動植物病害是一個非常有前景的研究領(lǐng)域[123-124]。此外，病毒還是天然的生物納米材料，其不但擁有納米材料的優(yōu)越性能，還具備可快速復(fù)制的優(yōu)勢，同時其遺傳物質(zhì)較小，易于被基因工程技術(shù)改造，因此被越來越廣泛地應(yīng)用到納米材料生成技術(shù)的各個方向，包括顯示屏和電池等[125-126]。

4.4 注重對微生物病毒純培養(yǎng)株的分離及基因組解析研究

目前針對病毒純分離株全基因組的解析量遠(yuǎn)小于具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的微生物，導(dǎo)致病毒全基因組數(shù)據(jù)庫量小，大量土壤病毒宏基因組數(shù)據(jù)無法判斷來源，妨礙了后續(xù)解析工作。因此在今后研究過程中，在采用分子生物學(xué)技術(shù)研究土壤病毒生態(tài)學(xué)問題的同時，也要關(guān)注微生物病毒純培養(yǎng)株全基因組分析工作，尤其是對古菌病毒和真菌病毒株的研究。這些基礎(chǔ)性的工作是擴大環(huán)境病毒數(shù)據(jù)庫的前提，是開發(fā)新分析軟件和建立新分析平臺的保障，也是開啟土壤病毒基因?qū)殠斓蔫€匙。

4.5 加強土壤病毒與土壤微生物的耦合研究

除部分土壤病毒能夠直接引起動植物病害和人類疾病外，土壤病毒主要是通過調(diào)控寄主微生物群落結(jié)構(gòu)組成、影響群落演替而間接地體現(xiàn)出病毒的生態(tài)功能。目前國際上對土壤病毒的研究還局限于盤點其多樣性和數(shù)量豐度等層面，對病毒生態(tài)功能的研究還很少。多數(shù)對土壤病毒的研究未能與土壤微生物群落變化聯(lián)系起來，這無疑會妨礙我們對病毒生態(tài)功能的認(rèn)知。故此，在今后的研究中，應(yīng)加強對土壤病毒與土壤微生物的耦合研究，通過精巧的控制實驗設(shè)計，研究揭示出病毒在構(gòu)建健康土壤環(huán)境、調(diào)控根際微生態(tài)、促進植物生長，乃至影響全球氣候變化等方面的重要作用。