微生物強(qiáng)化對(duì)石油污染土壤的修復(fù)特性研究

王娣，馬闖，高歡，劉恒，徐會(huì)寧，吳蔓莉

（西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，陜西省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710055）

生物強(qiáng)化（Bioaugmentation）是指向污染環(huán)境中接種外源微生物以對(duì)污染物進(jìn)行去除的方法[1-2]。由于接種的降解菌可對(duì)目標(biāo)污染物進(jìn)行直接降解，因此具有針對(duì)性強(qiáng)、對(duì)污染物去除速度快等優(yōu)點(diǎn)，已成為廣為采用的石油污染土壤修復(fù)技術(shù)[3-6]。已有大量文獻(xiàn)研究對(duì)石油烴降解菌的篩選和鑒定進(jìn)行了詳細(xì)報(bào)道。篩選出的可降解石油烴的菌屬包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、紅球菌屬（Rhodococcus）和黃桿菌屬（Flavobacterium）等多種菌屬[7-12]。此外，對(duì)降解菌群的構(gòu)建和外源菌群接種對(duì)石油烴去除效果的影響也有較為詳細(xì)的研究報(bào)道[13-15]。

生物強(qiáng)化中接種的降解菌生長(zhǎng)和代謝活性受土壤濕度、土壤養(yǎng)分和pH等土壤環(huán)境條件的影響較大[16-17]。Pacwa-P?ociniczak等[18]向初始含油量為11 980 mg·kg-1的土壤中接種紅球菌屬進(jìn)行生物強(qiáng)化修復(fù)，接種量為108cfu·g-1、保持土壤濕度為50%的田間持水量修復(fù)182 d時(shí)，石油烴去除率達(dá)到38.4%。Wu等[19]向黃土壤中接種由Pseudomonas stutzeri GQ-4 strain KF453954、Pseudomonas SZ-2 strain KF453956和Bacillus SQ-2 strain KF453961構(gòu)成的降解菌群，接種量為108cfu·g-1、土壤濕度為20%修復(fù)8周，石油烴去除率達(dá)到58%。目前的研究工作多是對(duì)最佳濕度和接種量條件下的石油烴去除效果進(jìn)行研究，但對(duì)于不同接種量的降解菌群在土壤自然濕度條件下的生長(zhǎng)存活狀況研究相對(duì)較少。

本文利用富集培養(yǎng)法從石油污染土壤中篩選出石油烴降解菌群，在兩種不同土壤濕度條件下（5.4%和15.0%）向污染土壤中接種降解菌群進(jìn)行生物強(qiáng)化修復(fù)處理，研究接種量和濕度對(duì)降解菌群生長(zhǎng)和存活的影響以及對(duì)石油烴的去除效果，研究可為深入理解降解菌群接種生物強(qiáng)化修復(fù)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 降解菌群的篩選

以采自陜北延長(zhǎng)某油井周圍的石油污染土壤為石油烴降解菌菌源。土壤的基本理化性質(zhì)為：pH 7.68、總氮1 170 mg·kg-1、有效磷15.92 mg·kg-1、銨態(tài)氮14.70 mg·kg-1、硝態(tài)氮0.38 mg·kg-1，土壤含油量為15 233 mg·kg-1。

富集篩選培養(yǎng)基——L9培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 17.689 g·L-1，KH2PO43.0 g·L-1，NH4Cl 1.0 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，1 mL·L-11 mol·L-1MgSO4，2.5 mL·L-1微量元素。微量元素組成：MnCl2·2H2O 23 mg·L-1，MnCl4·H2O 30 mg·L-1，H3BO331 mg·L-1，CoCl2·6H2O 36 mg·L-1，CuCl2·2H2O 10 mg·L-1，NiCl2·6H2O 20 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 30 mg·L-1，ZnCl250 mg·L-1。

富集篩選方法：稱取5.0 g石油污染土壤，無(wú)菌條件下加入50.0 mL滅菌的L9培養(yǎng)基，30℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)2 h以提取土壤中的總微生物。將提取物靜置30 min后，移取5 mL提取液轉(zhuǎn)接至含1%原油（取自長(zhǎng)慶油田采油六廠）的100.0 mL L9培養(yǎng)基中，相同條件下連續(xù)培養(yǎng)7 d，如此轉(zhuǎn)接5次后，將最后一次獲得的培養(yǎng)液在10 000 r·min-1條件下離心分離獲得混合菌，利用PBS無(wú)機(jī)鹽緩沖液洗滌混合菌5次。將混菌懸液OD值調(diào)節(jié)為1.0，600 nm處測(cè)定，相當(dāng)于1×108cfu·mL-1的菌量。獲得的混菌懸液用MC表示。利用高通量測(cè)序分析降解菌群MC的組成，并將獲得的菌群用于后續(xù)生物強(qiáng)化修復(fù)方案中。

1.2 生物強(qiáng)化修復(fù)方案

將石油污染土壤經(jīng)碎散、除雜、過(guò)0.85 mm篩后混勻。稱取36份100.0 g的石油污染土壤分裝于36個(gè)燒杯中，具體修復(fù)方案見(jiàn)表1。表1中，CK、A、B、C、D、E為土壤自然濕度（5.4%）實(shí)驗(yàn)組；CK’、A’、B’、C’、D’、E’為15.0%濕度實(shí)驗(yàn)組（修復(fù)過(guò)程中定期向土壤中加滅菌純水，使土壤濕度為15%）。將1.1中獲得的降解菌懸液MC按表1設(shè)定的接種量分別接種于石油污染土壤中，CK和CK’為不進(jìn)行接種處理的控制組。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。

表1 石油污染土壤的修復(fù)方案設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design for bioremediation of petroleum-polluted soil

所有樣品均放置在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每隔3～4 d用滅菌玻棒翻動(dòng)土壤以保證充氧量，在修復(fù)的第7、15、30、45、60 d時(shí)取樣測(cè)定土壤中總石油烴含量。

1.3 石油烴測(cè)定方法

采用超聲波萃取法提取土壤中的總石油烴并利用質(zhì)量法進(jìn)行測(cè)定[20]。詳細(xì)步驟為：準(zhǔn)確稱取風(fēng)干土樣3.000 g置于離心管中，加入正己烷和二氯甲烷1∶1混合萃取劑15.0 mL，利用超聲細(xì)胞破碎儀（SONICS，JY92-Ⅱ，美國(guó)）超聲萃取10 min（萃取功率為170 W），4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心15 min，利用定量濾紙過(guò)濾提取液于已稱質(zhì)量的稱量瓶中，重復(fù)萃取3次。將稱量瓶放于通風(fēng)櫥，使其中的提取劑揮發(fā)，待完全揮發(fā)至恒質(zhì)量后稱取質(zhì)量。

1.4 高通量測(cè)序分析

在修復(fù)第7 d和第60 d時(shí)，從接種量為108cfu·g-1、自然濕度的土壤（標(biāo)號(hào)為E7、E60）和接種量為107cfu·g-1、濕度為15.0%的土壤（編號(hào)為D’7、D’60），以及修復(fù)60 d時(shí)的控制組土壤（編號(hào)為CK60、CK’60）的各3個(gè)重復(fù)樣品中，選擇石油烴測(cè)定結(jié)果最接近的2個(gè)平行樣品，送上海生工（https：∕∕www.sangon.com∕）進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

使用Prinseq軟件對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，將所測(cè)序列與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，使用Usearch軟件去嵌合后歸類為同種可操作分類單元（OTU），利用Mothur公式計(jì)算多樣性指數(shù)，利用RDP classifier對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行物種分類[21]。細(xì)菌門水平和屬水平的相對(duì)豐度計(jì)算方法見(jiàn)公式（1）：

式中：λ為第i種細(xì)菌門水平（屬水平）的相對(duì)豐度；Si為第i種細(xì)菌門水平（屬水平）的有效序列數(shù)；S為該土樣中微生物的總有效序列數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0軟件對(duì)總石油烴去除率進(jìn)行One-way-ANOVA方差分析，顯著性水平取0.05。采用Origin 9.0軟件作圖。

高通量測(cè)序結(jié)果顯示，每個(gè)處理的2個(gè)平行樣品測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性較好，從中隨機(jī)選取1個(gè)樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行后續(xù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 石油烴降解菌群組成

利用富集培養(yǎng)方法從陜北地區(qū)石油污染土壤中篩選出以石油烴為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的菌群MC。經(jīng)高通量測(cè)序從MC中獲得的有效序列數(shù)為94 919，OTUs數(shù)目為278個(gè)，歸屬于19個(gè)門。降解菌群主要由變形菌門（Proteobacteria，99.75%）組成，其余的幾種菌門包括放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的總豐度不高，為0.25%。降解菌群的優(yōu)勢(shì)菌屬為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，87.32%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，12.00%）（圖1）。

不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬是文獻(xiàn)報(bào)道的常見(jiàn)石油烴降解菌[22-27]。本課題組在前期的研究中，利用Bush-hass培養(yǎng)基從陜北石油污染土壤中篩選出的降解菌組成均為假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬[28]。說(shuō)明這兩種菌屬是陜北地區(qū)石油污染土壤中普遍存在的可降解石油烴的菌屬。

2.2 接種降解菌對(duì)土壤中石油烴去除效果的影響

圖1 石油烴降解菌群MC組成Figure 1 The compositions of petroleum-degrading flora MC

自然濕度（5.4%，圖2）條件下修復(fù)60 d，A、B、C、D、E土壤樣品中總石油烴含量分別從15 233 mg·kg-1降低至14 767、15 167、14 867、14 683 mg·kg-1及13 617 mg·kg-1，石油烴去除率分別為3.06%、0.44%、2.41%、3.61%、10.61%。不接菌的CK土壤中含油量降至14 422 mg·kg-1，總石油烴去除率為5.32%。自然濕度條件下，當(dāng)降解菌群接種量為108cfu·g-1時(shí)，接入的降解菌群對(duì)土壤中石油烴起到一定的去除作用。接種量低于108cfu·g-1時(shí)的石油烴去除率低于CK組，可能是由于接種菌群數(shù)量少，沒(méi)有生長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)菌，接種后反而抑制了原有降解菌的生長(zhǎng)和活性。

圖2 自然濕度（5.4%）條件下接種量對(duì)石油烴去除的影響Figure 2 The effects of MC inoculation amount on petroleum hydrocarbon removal under 5.4%natural moisture

15.0 %濕度條件下，A′、B′、C′、D′、E′處理中，總石油烴含量由15 233 mg·kg-1分別降低至12 867、13 400、14 200、12 389、12 511 mg·kg-1，石油烴去除率分別為15.54%、12.04%、6.78%、18.67%、17.87%。未接菌的CK’土壤中總石油烴含量降低至13 833 mg·kg-1，石油烴去除率為9.19%（圖3）。因此，當(dāng)保持土壤濕度為15%時(shí)，除接種量為105cfu·g-1的土樣外，經(jīng)過(guò)60 d的生物強(qiáng)化，土壤中總石油烴殘留量均低于CK’。接種量為105cfu·g-1時(shí)的石油烴去除率最低，可能是由于此時(shí)降解菌在土壤中雖然有一定的生長(zhǎng)，但是沒(méi)有生長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)菌，而且此時(shí)的生長(zhǎng)量抑制了土著降解菌的活性，因此使得石油烴去除率最低。

對(duì)不同濕度土壤中石油烴的去除效果進(jìn)行比較分析，見(jiàn)圖4。土壤濕度為15.0%時(shí)對(duì)石油烴的去除效果總體上好于自然濕度下的修復(fù)處理。

濕度是影響微生物生長(zhǎng)和活性的重要條件。水分過(guò)高或過(guò)低均可使土壤微生物活性降低[29]。一些研究結(jié)果表明，土壤濕度為12%～20%時(shí)，微生物活性最強(qiáng)，有利于對(duì)石油烴的降解。濕度過(guò)高會(huì)使土壤透氣性變差，影響降解菌對(duì)石油烴的代謝功能[30]。本文的研究結(jié)果表明，與自然濕度下接種相比，在保持土壤濕度15%條件下進(jìn)行接種修復(fù)，對(duì)土壤微生物多樣性的影響較小，石油烴的去除率相對(duì)較高。因此，在對(duì)石油污染土壤進(jìn)行生物強(qiáng)化修復(fù)時(shí)，適當(dāng)?shù)耐寥篮视欣谑蜔N的降解。

圖3 15.0%濕度條件下接種量對(duì)石油烴去除的影響Figure 3 The effects of MC inoculation amount on petroleum hydrocarbon removal under 15.0%moisture

圖4 不同濕度條件土壤修復(fù)60 d的總石油烴去除率Figure 4 TPH degradation efficiency under different humidity conditions at 60 d of bioremediation

本研究篩選出MC降解菌群在水相中對(duì)原油具有很好的降解性能，搖瓶實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)30 d的生物降解，MC菌群對(duì)水相中石油烴去除率達(dá)到89.28%，該結(jié)果未在本文中顯示。當(dāng)向石油污染土壤中接種MC菌群進(jìn)行強(qiáng)化修復(fù)處理時(shí)，土壤石油烴最高去除率僅為18.67%。

在以前的研究中，向黃土壤中接種其他降解菌群修復(fù)8周，石油烴去除率達(dá)到58%[19]；接種單一石油烴降解菌AcinetobacterSZ-1 strain KF453955修復(fù)10周，對(duì)土壤中石油烴的去除率為34%[20]。這些結(jié)果說(shuō)明生物強(qiáng)化修復(fù)的石油烴去除效果可能受到多種因素的影響，外源菌與土著功能降解菌之間可能存在某種特殊的平衡交互作用。

2.3 降解菌群在不同接種條件下的生長(zhǎng)及對(duì)土著菌群的影響作用

在修復(fù)的第7 d和第60 d，采集兩種濕度條件下對(duì)石油烴去除效果較好的土壤樣品（E和D’）和對(duì)照組（CK和CK’組）土壤樣品，進(jìn)行高通量測(cè)序分析，研究降解菌群在不同濕度條件下的生長(zhǎng)存活情況及其對(duì)土壤土著菌群的影響作用。

2.3.1 菌群的alpha多樣性

Ace和Chao1指數(shù)表征土壤微生物的豐富度，其值越大，土壤微生物的豐富度越大。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表征土壤菌群的均勻度，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)越小，土壤微生物的均勻度越高[31-32]。

表2為不同處理土壤的微生物多樣性測(cè)定結(jié)果。從土壤樣品E7、E60、D′7、D′60、CK60及CK′60中測(cè)得的有效序列數(shù)分別為76 434、67 486、68 120、72 392、64 923、73 632。自然濕度條件下向土壤中接種降解菌群進(jìn)行修復(fù)7 d（E7）和60 d（E60）時(shí)，土壤的Shannon指數(shù)為3.66和3.09，Simpson指數(shù)為0.13和0.19，ACE指數(shù)為9 653.19和7 842.22，Chao1指數(shù)為7 187.33和5 597.03。Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在所測(cè)土壤樣品中均最小，Simpson指數(shù)最大，說(shuō)明在自然濕度條件下對(duì)污染土壤進(jìn)行接種強(qiáng)化修復(fù)處理，可使土壤微生物群落多樣性明顯降低。

與CK′60相比，D′7和D′60土壤樣品的Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)有所降低，但降低程度小于自然濕度條件下的接種處理。

本研究中，接種降解菌群進(jìn)行生物強(qiáng)化修復(fù)使土壤微生物的均勻度和豐富度降低，與我們前期研究所得結(jié)果基本一致[21，33]。本研究結(jié)果表明，在提高土壤濕度的條件下進(jìn)行接種修復(fù)，可以使土壤微生物多樣性保持較為穩(wěn)定的狀態(tài)。

2.3.2 土壤微生物群落組成變化

2.3.2.1 降解菌在土壤中的生長(zhǎng)情況和土壤中門水平微生物群落組成

圖5為MC菌群和土壤中12種主要菌門的相對(duì)豐度，其余菌門相對(duì)豐度合并為Others。土樣CK60、E7、E60、CK’60、D’7、D’60中的細(xì)菌門數(shù)量分別為28、28、23、28、26、26。CK60土壤中主要優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（Proteobacteria，28.22%）、放線菌門（Actinobacteria，21.97%）、酸桿菌門（Acidobacteria，14.88%）、浮霉菌門（Planctomycetes，10.09%）。E7和E60土壤中，變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度增加至66.35%和70.24%。放線菌門（Actinobacteria）相對(duì)豐度基本不變，酸桿菌門相對(duì)豐度降低為2.85%和2.94%。D’7和D’60土壤中變形菌門相對(duì)豐度增加為57.98%和50.22%，放線菌門相對(duì)豐度降低至17.96%和24.08%。

表2 石油烴降解菌群MC和不同修復(fù)處理的土壤微生物多樣性指數(shù)Table 2 Biodiversity index of petroleum-degrading microbial flora（MC）and soils with different treatments

圖5 MC菌群和不同處理土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門水平的相對(duì)豐度Figure 5 Relative abundance of the dominant phyla in the MC flora and different treated soils

降解菌群MC中變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度為99.75%。在兩種濕度條件下向土壤中接種MC 7 d時(shí)，土壤中變形菌門相對(duì)豐度明顯增加（圖5），說(shuō)明在不同濕度下接種的降解菌群可在土壤中快速生長(zhǎng)，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)（60 d）仍然保持存活狀態(tài)。

2.3.2.2 屬水平微生物群落組成結(jié)構(gòu)分析

圖6為MC菌群和土壤中前20種優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度，其余菌屬相對(duì)豐度合并為Others。降解菌群MC主要由不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，87.32%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，12.00%）組成。CK60土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬包括Gp6（5.49%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，4.18%）、Gaiella（3.44%）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas，2.32%）。

圖6 MC菌群和不同處理土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬水平的相對(duì)豐度Figure 6 Relative abundance of the most abundant genera in the MC flora and soils with different treatments

在自然濕度（5.4%）條件下接種MC菌群修復(fù)7 d時(shí)，假單胞菌屬（Pseudomonas，30.87%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，25.86%）和諾卡氏菌屬（Nocardia，13.27%）成為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬。修復(fù)60 d后，這3種菌屬仍為優(yōu)勢(shì)菌。其中，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）相對(duì)豐度增加至35.74%，假單胞菌屬（Pseudomonas）和諾卡氏菌屬（Nocardia）相對(duì)豐度基本保持不變。

在土壤濕度為15.0%條件下接種MC菌群修復(fù)7 d時(shí)，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，30.25%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，5.03%）成為優(yōu)勢(shì)菌屬。修復(fù)60 d時(shí)，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）仍為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬，但與修復(fù)7 d時(shí)相比，相對(duì)豐度降低。

降解菌群MC主要由不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，87.32%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，12.00%）組成。在自然濕度和15.0%濕度條件下接種石油烴降解菌群修復(fù)7 d，不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬成為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬。說(shuō)明接種的降解菌可在土壤中迅速生長(zhǎng)，且其生長(zhǎng)不受土壤濕度的影響。假單胞菌屬在自然濕度土壤中的相對(duì)豐度較大，說(shuō)明假單胞菌屬適宜在濕度較低的土壤中生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

（1）從陜北延長(zhǎng)某地區(qū)石油污染黃土壤中篩選出的石油烴降解菌門主要為變形菌門（Proteobacteria，99.75%），主要菌屬為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，87.32%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，12.00%）。

（2）自然濕度條件下（土壤濕度為5.4%）降解菌群接種量為108cfu·g-1，15.0%濕度條件下降解菌接種量為107cfu·g-1時(shí)，修復(fù)60 d的土壤中石油烴去除率分別為10.61%和18.67%，對(duì)總石油烴的去除率高于未接種降解菌的控制組（石油烴去除率為5.32%和9.19%），15.0%濕度條件下對(duì)石油烴的去除效果好于自然濕度條件下的生物強(qiáng)化修復(fù)處理。

（3）不同濕度條件下接種7 d時(shí)，降解菌在土壤中生長(zhǎng)并成為優(yōu)勢(shì)菌。自然濕度條件有利于假單胞菌屬（Pseudomonas）的生長(zhǎng)。接種60 d時(shí)，降解菌在土壤中仍然大量存活。接種降解菌群使土壤微生物多樣性降低，在15.0%濕度條件下接種有利于維持土壤微生物多樣性不發(fā)生明顯變化。