土壤外源鈷對(duì)大麥根伸長(zhǎng)的毒害及其預(yù)測(cè)模型

李金瓶，王學(xué)東*，馬虹，馬義兵

（1.首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院，北京 100048；2.澳門(mén)科技大學(xué)澳門(mén)環(huán)境研究院，澳門(mén) 999078）

鈷（Co）是自然存在的元素，廣泛存在于巖石、土壤、水和植被中。Co的用途廣泛，被譽(yù)為戰(zhàn)略金屬，是生產(chǎn)高強(qiáng)度、耐高溫、耐腐蝕合金的重要原料，也是石油工業(yè)催化劑的重要來(lái)源[1-4]。Co能夠參與維生素B12的合成，對(duì)人體、動(dòng)物、植物都有積極作用[5]。我國(guó)土壤背景值全Co含量為0.01～93.9 mg·kg-1，算術(shù)平均值和幾何平均值分別為 12.7 mg·kg-1和 11.7 mg·kg-1，約95%的土壤全Co含量范圍為4～31.2 mg·kg-1，北方土壤較南方高，且變化范圍小，大部分地區(qū)為12～35 mg·kg-1[6-7]。隨著社會(huì)發(fā)展，我國(guó)Co用量逐漸增加，從2004年的8 050～9 050 t上升為2016年的46 000 t[8]，Co的大量使用為環(huán)境帶來(lái)了潛在風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。Co通過(guò)采礦冶煉、污水污泥以及肥料的使用等途徑進(jìn)入土壤[11]，土壤中過(guò)量的Co能夠經(jīng)遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)入植物和人體，抑制植物生長(zhǎng)，并對(duì)人的健康造成極大的損害[12-13]。因此，土壤中Co風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及相關(guān)的基準(zhǔn)閾值研究對(duì)Co污染防控至關(guān)重要。國(guó)外對(duì)Co生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)研究起步較早，例如美國(guó)生態(tài)土壤篩選值（Eco-SSLs）中涵蓋了Co對(duì)植物、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物的篩選值，分別為13、120、230 mg·kg-1，荷蘭土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中Co離子干預(yù)值為240 mg·kg-1（土壤干質(zhì)量）。但我國(guó)最新發(fā)布的《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（GB 15618—2018）尚未涵蓋Co元素。

土壤性質(zhì)是影響重金屬毒性和風(fēng)險(xiǎn)的重要因素，不同性質(zhì)土壤通過(guò)吸附、沉淀、表面絡(luò)合等作用會(huì)對(duì)重金屬的生物有效性產(chǎn)生不同影響。據(jù)報(bào)道，Cu、Ni在我國(guó)不同性質(zhì)土壤上對(duì)大麥的毒性閾值EC10分別相差了14.3、89.6倍，EC50相差16.9、52.5倍[14-15]。Micó等[16]針對(duì)歐洲北美土壤中Co的研究發(fā)現(xiàn)，10種不同性質(zhì)土壤上（歐洲7種，北美3種）Co的大麥毒性閾值EC10相差了19.62倍，EC50相差了19.17倍。盡管我國(guó)在土壤Co的毒性評(píng)價(jià)方面也做了一些研究，但涉及的土壤類(lèi)型較少[17-19]，尚不能建立有效的模型來(lái)評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)我國(guó)土壤中的Co風(fēng)險(xiǎn)。由于土壤性質(zhì)的差異，歐盟建立的土壤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)模型并不適用于我國(guó)土壤[14-15]，因此，基于我國(guó)多種土壤類(lèi)型開(kāi)展土壤中Co毒性和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)工作，對(duì)制定我國(guó)土壤中Co的環(huán)境質(zhì)量基準(zhǔn)具有重要意義。

基于此，本研究選取全國(guó)范圍內(nèi)具有一定代表性的11種不同性質(zhì)的土壤，通過(guò)外源添加重金屬Co的毒性試驗(yàn)，探究不同性質(zhì)土壤中Co對(duì)大麥的毒性閾值，并量化土壤性質(zhì)對(duì)Co毒性的影響，以期建立不同性質(zhì)土壤中Co毒性的評(píng)價(jià)模型，從而為土壤中Co的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及土壤基準(zhǔn)制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集和制備

采集我國(guó)吉林公主嶺、河北廊坊、海南海口等地區(qū)的11種理化性質(zhì)不同的農(nóng)田土壤，土壤pH值范圍為4.93～8.86，有機(jī)碳（OC）為0.6%～4.28%，土壤黏粒（Clay）為 10%～66%，有效陽(yáng)離子交換量（eCEC）為6.36～28.7 cmol·kg-1。采集的土壤樣品風(fēng)干后過(guò)2 mm篩備用。

在正式試驗(yàn)前，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定8個(gè)Co濃度梯度，Co濃度設(shè)置因pH不同而有一定的差別。當(dāng)土壤pH＜7時(shí)，添加的外源Co濃度為0、50、100、200、400、800、1 600、3 200 mg·kg-1土；pH＞7時(shí)，添加的Co濃度為 0、100、200、400、800、1 600、3 200、6 400 mg·kg-1土。外源Co通過(guò)噴灑CoSO4·7H2O溶液的形式加入土壤中，保持100%持水量培養(yǎng)2 d[20]，風(fēng)干后過(guò)2 mm篩備用。

1.2 土壤性質(zhì)的測(cè)定

主要測(cè)定的土壤性質(zhì)包括土壤pH、電導(dǎo)率、土壤總碳、無(wú)機(jī)碳、有機(jī)碳、土壤黏粒及其組成、鐵鋁錳氧化物、有效陽(yáng)離子交換量等。參照Li等[14]的測(cè)試方法，在水土比為5∶1的條件下測(cè)量土壤pH和電導(dǎo)率[21]，有效陽(yáng)離子交換量（eCEC）采用非緩沖的硫脲銀方法測(cè)定[22]，總碳使用高溫燃燒法測(cè)定，無(wú)機(jī)碳的含量使用Pressure-Calcimeter法測(cè)定[23-24]，有機(jī)碳含量為總碳與無(wú)機(jī)碳含量之差，通過(guò)沉降法測(cè)量土壤質(zhì)地[25]，土壤中有效態(tài)鐵、鋁和錳的測(cè)定使用醋酸鹽溶液浸提。11種土壤的基本理化性質(zhì)如表1所示。

1.3 毒性測(cè)試

植物根伸長(zhǎng)抑制試驗(yàn)參照ISO 11269-1-1993的標(biāo)準(zhǔn)方法。供試植物采用大麥（Hordeum vulgare L.），種子選取河南省農(nóng)科院培育的駐大麥6號(hào)。取土樣120 g裝入高120 mm、直徑42 mm的圓柱形聚乙烯培養(yǎng)杯中。預(yù)先采用從杯底向上入水法測(cè)得每個(gè)土壤的田間持水量，試驗(yàn)過(guò)程中用蒸餾水將土壤濕度調(diào)至測(cè)試土壤60%的田間持水量并培養(yǎng)7 d，每日稱(chēng)量培養(yǎng)杯質(zhì)量，保持整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中土壤含水量恒定。將大麥種子用H2O2消毒，放置于帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，用蒸餾水沒(méi)過(guò)種子靜置36 h，待胚根2 mm長(zhǎng)，將大麥種子胚根向下種植在培養(yǎng)杯中，大麥種子離土表1 cm以下。每個(gè)培養(yǎng)杯種植6粒種子，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為白天 12～16 h（18～22 ℃），夜間 8～12 h（14～18℃），土壤濕度為65%～75%的田間持水量。為防止植物營(yíng)養(yǎng)匱乏，加入濃度為0.429 g CO（NH2）2·kg-1土、0.263 g KH2PO4·kg-1土、0.420 g KCl·kg-1土的營(yíng)養(yǎng)液，大麥生長(zhǎng)4 d后取出，將大麥根系清洗干凈后置于坐標(biāo)紙上讀取并記錄大麥根長(zhǎng)，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

表1 我國(guó)供試土壤的基本理化性質(zhì)（n=11）Table 1 Basic physical and chemical properties of test soils in China（n=11）

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理

外源Co對(duì)大麥根伸長(zhǎng)的毒害效應(yīng)采用邏輯斯蒂克分布模型（Log-logistic distribution）進(jìn)行擬合[26]，方程如下：

式中：Y表示以未進(jìn)行外源添加為對(duì)照組的大麥相對(duì)根伸長(zhǎng)，%；X為lg（外源添加Co含量）。Y0、b、M為曲線擬合參數(shù)，M 為 lg EC10、lg EC50，EC10和 EC50分別為抑制大麥根伸長(zhǎng)10%、50%時(shí)Co的濃度。通過(guò)這個(gè)方程可以獲得EC10、EC50以及95%的置信區(qū)間。

相關(guān)分析和回歸分析采用SPSS 21.0軟件，繪圖采用OriginPro 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Co對(duì)大麥根伸長(zhǎng)的劑量-效應(yīng)曲線和毒性閾值

在11種供試土壤中，大麥相對(duì)根伸長(zhǎng)和外源添加Co之間的關(guān)系用劑量-效應(yīng)曲線（Log-logistic）擬合，擬合的曲線和毒性閾值EC10和EC50見(jiàn)圖1和表2。其中，湖南祁陽(yáng)土壤中Co毒性閾值最小，EC10為37.1 mg·kg-1土，EC50為166.1 mg·kg-1土，陜西楊凌土壤中毒性閾值最大，EC10為 3 914 mg·kg-1土，EC50為 6 030 mg·kg-1土。EC10和 EC50極值分別變化了 105.5 倍和36.3倍，EC50受土壤性質(zhì)的影響較EC10小。當(dāng)在土壤中添加低劑量Co時(shí)，部分土壤中出現(xiàn)一定的刺激效應(yīng)，略微增加了大麥根伸長(zhǎng)，如重慶和張掖，其中最大增加量為對(duì)照組的113.84%，但影響不顯著，因此未使用低劑量毒物刺激效應(yīng)（Hormesis）曲線進(jìn)行擬合。

2.2 土壤性質(zhì)與毒性閾值的Pearson相關(guān)性及其回歸模型

對(duì)土壤基本理化性質(zhì)與大麥根伸長(zhǎng)毒性閾值進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果如表3所示。土壤pH值與毒性閾值（EC10、EC50）具有顯著的相關(guān)性，達(dá)到了0.01的顯著水平，EC10與土壤黏粒（Clay）在0.1水平（雙側(cè)）上負(fù)相關(guān)，EC50與總碳（TC）在0.1水平（雙側(cè)）上正相關(guān)。

表2 土壤外源Co對(duì)大麥根伸長(zhǎng)的毒性閾值（n=11）Table 2 Toxicity thresholds measured by barley roots elongation for added Co（n=11）

圖1 添加Co對(duì)大麥根伸長(zhǎng)的劑量-效應(yīng)曲線Figure 1 Dose-response curves of added Co concentrations for barley root elongation

表3 土壤性質(zhì)與毒性閾值之間的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 3 Pearson correlation coefficient between soil properties and toxicity thresholds

為進(jìn)一步量化分析土壤性質(zhì)對(duì)Co毒性閾值的影響，建立了土壤性質(zhì)與Co毒性閾值之間的一元和多元回歸方程（表4）。從方程1和方程4可以看出，土壤pH是影響Co毒性閾值的關(guān)鍵因子，其單因子回歸方程分別解釋77.6%、72.0%的EC10和EC50的變異，土壤黏粒（Clay）可以解釋29.5%的EC10的變異（方程2），總碳（TC）可以解釋27.7%的EC50的變異（方程5）。如方程3和方程6所示，當(dāng)引入雙因子時(shí)，回歸方程對(duì)毒性閾值的預(yù)測(cè)能力顯著提高。

表4 Co的毒性閾值和土壤性質(zhì)之間的簡(jiǎn)單和多元回歸方程Table 4 Simple and multiple linear regressions for Co toxicity thresholds and soil properties

2.3 模型驗(yàn)證

將我國(guó)11種土壤性質(zhì)代入擬合回歸方程進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證（圖2），大麥根伸長(zhǎng)Co毒性閾值的測(cè)量值和預(yù)測(cè)值的誤差小于0.5個(gè)數(shù)量級(jí)。近年來(lái)，歐盟在建立重金屬的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)基準(zhǔn)方面做了大量的研究工作，在10種（歐洲7種、北美3種）不同性質(zhì)的土壤中添加7個(gè)Co濃度范圍（對(duì)照加6個(gè)Co劑量），以研究土壤性質(zhì)與大麥根伸長(zhǎng)毒性閾值的關(guān)系，研究土壤的pH 范圍為 4.30～7.53，有機(jī)碳含量（OC）為 0.8%～5.3%，土壤黏粒（Clay）為1.0%～47.9%，有效陽(yáng)離子交換量（eCEC）為1.7～28.89 cmol·kg-1[16]。將基于我國(guó)土壤得到的預(yù)測(cè)模型和歐盟研究的土壤預(yù)測(cè)模型進(jìn)行相互比較驗(yàn)證。首先將歐洲、北美的土壤性質(zhì)代入本研究得到的土壤預(yù)測(cè)模型（lg EC10=-0.302+0.4 pH；lg EC50=0.674+0.323 pH），得到對(duì)歐洲、北美土壤Co毒性閾值的預(yù)測(cè)值（圖3A），然后將本研究中我國(guó)11種土壤性質(zhì)代入Micó等[16]研究中的回歸方程（lg EC10=0.95+0.94 lg eCEC；lg EC50=1.34+1.02 lg eCEC），得到歐洲、北美土壤預(yù)測(cè)模型對(duì)我國(guó)土壤Co毒性閾值的預(yù)測(cè)值（圖3B），結(jié)果表明，基于我國(guó)土壤得到的大麥毒性閾值預(yù)測(cè)模型可以較好地預(yù)測(cè)歐洲、北美土壤中Co的毒性閾值，如圖3A所示，EC50測(cè)量值和預(yù)測(cè)值的誤差均小于0.5個(gè)數(shù)量級(jí)，EC10測(cè)量值和預(yù)測(cè)值的誤差有50%小于0.5個(gè)數(shù)量級(jí)，50%位于0.5和1個(gè)數(shù)量級(jí)之間，但基于歐洲、北美土壤建立的預(yù)測(cè)模型不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)我國(guó)土壤中Co的毒性閾值（圖3B）。這表明，基于我國(guó)土壤建立的Co預(yù)測(cè)模型具有更廣泛的適用性。

3 討論

圖2 大麥根長(zhǎng)的ECx（x=10，50）測(cè)量值與預(yù)測(cè)值的關(guān)系Figure 2 The relationships between ECx（x=10，50）measured and predicted values for barley root elongation

圖3 大麥根長(zhǎng)的ECx（x=10，50）測(cè)量值與預(yù)測(cè)值的關(guān)系Figure 3 The relationships between ECx（x=10，50）measured and predicted values for barley root elongation

不同性質(zhì)土壤毒性測(cè)試中，Co對(duì)大麥根伸長(zhǎng)的毒性閾值EC10的最大值是最小值的105.5倍，EC50的最大值是最小值的36.3倍，Micó等[16]在歐洲、北美土壤中對(duì)Co的研究結(jié)果表明，EC10、EC50最大值分別是最小值的19.62倍和19.18倍，揭示我國(guó)土壤中Co對(duì)大麥的毒性閾值變化范圍遠(yuǎn)大于歐洲、北美。與利用我國(guó)土壤對(duì)Cu、Ni大麥毒性的研究[14-15]相比，Co的EC10變化范圍更大，EC50的變化介于Cu、Ni之間。這表明土壤性質(zhì)對(duì)Co的大麥毒性閾值有很大的影響，建立基于我國(guó)土壤性質(zhì)與Co毒性閾值之間的預(yù)測(cè)模型至關(guān)重要。本研究參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行毒性測(cè)試，得到我國(guó)不同土壤中Co的大麥毒性數(shù)據(jù)，同時(shí)，基于土壤性質(zhì)建立毒性閾值預(yù)測(cè)模型，在一定程度上可以減少大量試驗(yàn)所耗費(fèi)的人力、物力和財(cái)力，也為Co相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定和土壤中重金屬的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供一定的參考依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)土壤pH是不同性質(zhì)的土壤中Co大麥毒性閾值的關(guān)鍵影響因子，隨著土壤pH值的增大，毒性閾值增大。蔡祖聰?shù)萚27]對(duì)57個(gè)不同性質(zhì)的土壤樣品進(jìn)行大樣本統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示隨著土壤pH的增大，土壤中活性Co下降，這與本研究結(jié)果相似。據(jù)報(bào)道，土壤pH也是影響我國(guó)不同性質(zhì)的土壤中Cu、Zn、Ni毒性閾值最為重要的因子[28-30]。這可能是因?yàn)楫?dāng)pH較低時(shí)，一些固相鹽類(lèi)溶解度增加，從而導(dǎo)致對(duì)重金屬的吸附減少，同時(shí)隨著H+增多，H+競(jìng)爭(zhēng)土壤吸附位點(diǎn)的能力增強(qiáng)，重金屬?gòu)耐寥拦滔嘀薪馕聛?lái)的量增加。另一方面，土壤pH對(duì)礦物和有機(jī)質(zhì)表面的活性有一定的影響，隨著pH值下降，吸附界面的負(fù)電荷減少，降低了對(duì)重金屬的吸附能力[31-33]，從而影響了重金屬的毒性。

土壤pH值是本研究中大麥毒性閾值的主要影響因子，而歐洲、北美土壤中Co的大麥毒性閾值主要受有效陽(yáng)離子交換量（eCEC）影響[16]，這和本研究不同。對(duì)比本試驗(yàn)和歐洲、北美土壤的理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，歐洲、北美土壤的有效陽(yáng)離子交換量（eCEC）變化范圍為1.7～28.9 cmol·kg-1（17倍），遠(yuǎn)大于本試驗(yàn)11種土壤的eCEC變化范圍（6.36～28.7 cmol·kg-1，4.51倍）。因?yàn)槎鄠€(gè)土壤性質(zhì)具有自相關(guān)性，因此和閾值最相關(guān)的影響因素可能取決于性質(zhì)變化較大的土壤性質(zhì)。歐洲、北美10種土壤的理化性質(zhì)[16]相關(guān)性分析結(jié)果表明，土壤有效陽(yáng)離子交換量（eCEC）與pH、可交換鈣（Exch-Ca）、黏粒含量（Clay%）、砂粒含量（Sand%）和粉粒含量（Silt%）均有顯著的相關(guān)性（P＜0.05），這可能也是有效陽(yáng)離子交換量eCEC能夠預(yù)測(cè)歐洲、北美不同性質(zhì)土壤的毒性閾值的原因，同樣，我國(guó)11種土壤pH與黏粒含量（Clay%）、沙粒含量（Sand%）和鋁氧化物（Alox）也具有顯著的相關(guān)性（P＜0.05）。

為進(jìn)一步建立適用范圍更廣的Co毒性預(yù)測(cè)模型，將基于我國(guó)11種土壤和歐洲、北美10種土壤[16]的所有毒性閾值和土壤性質(zhì)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明，毒性閾值與土壤pH和有效陽(yáng)離子交換量（eCEC）均有顯著的相關(guān)性（P＜0.05），在此基礎(chǔ)上建立了普遍適用的回歸方程（lg EC10=0.057+0.326 pH+0.263 lg CEC，r2=0.863，P＜0.001；lg EC50=0.414+0.3 pH+0.344 lg CEC，r2=0.811，P＜0.001），基于此方程，我國(guó)11種土壤和歐洲、北美10種土壤的毒性閾值測(cè)量值和預(yù)測(cè)值如圖4所示，分別可以解釋本試驗(yàn)土壤和歐洲、北美土壤82.4%和58.7%的EC10的變異，79.0%和74.7%的EC50的變異。較分別基于我國(guó)和歐洲、北美土壤得到的預(yù)測(cè)模型相比，該方程覆蓋的土壤性質(zhì)范圍更廣，可為建立世界土壤范圍內(nèi)的土壤Co風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)模型提供參考。

4 結(jié)論與展望

（1）土壤性質(zhì)對(duì)Co的大麥毒性閾值影響顯著，在選取的我國(guó)11種不同性質(zhì)的農(nóng)田土壤中，EC10、EC50最大值分別為最小值的105.5倍和36.3倍。

（2）土壤pH是影響不同性質(zhì)土壤中Co毒性閾值的關(guān)鍵因子，基于土壤性質(zhì)與大麥根伸長(zhǎng)毒性閾值的回歸方程可較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)不同性質(zhì)的土壤中Co對(duì)大麥的毒性，這為土壤中Co的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了一定的參考依據(jù)。

（3）利用歐洲、北美土壤進(jìn)行模型驗(yàn)證，基于我國(guó)11種土壤建立的Co大麥毒性閾值預(yù)測(cè)模型可以較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)歐洲、北美土壤的毒性閾值。

本研究以外源添加重金屬試驗(yàn)研究了Co對(duì)大麥的毒性，但在田間實(shí)際操作中，重金屬污染是一個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程，會(huì)發(fā)生老化作用，因此后續(xù)試驗(yàn)還需進(jìn)一步通過(guò)老化、淋洗等試驗(yàn)矯正實(shí)驗(yàn)室添加Co的毒性數(shù)據(jù)。另外，重金屬生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)保護(hù)基準(zhǔn)閾值還需要多個(gè)物種毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，然后利用物種敏感性分布等方法進(jìn)行確定，因此接下來(lái)還需進(jìn)一步試驗(yàn)，取得Co對(duì)多個(gè)物種的毒性數(shù)據(jù)。

圖4 大麥根長(zhǎng)的ECx（x=10，50）測(cè)量值與預(yù)測(cè)值的關(guān)系Figure 4 The relationships between ECx（x=10，50）measured and predicted values for barley root elongation