二氧化鈦納米顆粒對大豆根部吸收芘的影響

馬曉玥，袁彬彬，方國東，高娟，周東美*

（1.中國科學院南京土壤研究所，南京 210008；2.中國科學院大學，北京 100864）

多環(huán)芳烴（PAHs）由于其致癌、致畸、致突變、生物蓄積和遠距離運輸等特性，在1977年被美國環(huán)境保護署列為優(yōu)先控制污染物[1]。自然過程和人為活動產生的PAHs會通過大氣沉降（濕法或干法）、污水灌溉和污泥施肥等多種途徑進入土壤[2]。PAHs作為一大類持久性有機污染物，具有的脂溶性、疏水性和抗降解性，導致其在土壤環(huán)境中大量殘留[3]。2014年調查顯示，我國土壤中PAHs的點位超標率高達1.4%[4]。有文獻報道，南京、上海、臺州、珠江三角洲、北京、長春和西安等地的土壤中PAHs含量超過1 000 μg·kg-1，呈超重度污染狀況[5]。植物會通過根部吸收土壤中的PAHs，并將其轉移到其他組織部位[6]，因此土壤生態(tài)系統(tǒng)的狀況直接關系到全球的糧食安全。經調查，我國南部地區(qū)廢水灌溉的土壤上種植的可食蔬菜含有的PAHs濃度范圍在158～995 μg·kg-1（16種PAHs的總濃度）[7]。含有PAHs的植物可能會被人類直接攝食[8]，或被昆蟲、家禽等動物食用進入到下一營養(yǎng)級，進而在食物網中累積，隨后逐漸進入到肉制品或乳制品中，最終間接地通過攝食途徑進入人體，從而對人體健康造成巨大的潛在威脅[9]。

截至2011年3月，銷售市場上已有1 300多種含納米技術的產品，如醫(yī)療設備、化妝品、食品包裝、環(huán)境修復劑等[10-12]。從原材料的生產到產品的制造，再到產品的使用和廢棄，工程納米材料在其整個生命周期中都不可避免地被大量釋放到土壤環(huán)境中[13-15]。同時由于納米材料（NMs）具有尺寸依賴性、比表面積大和光學性能獨特的性質，而在植物保護和營養(yǎng)方面具有廣闊的應用前景，從而吸引了大量研究人員的關注[16]。例如，有研究顯示，植物根部吸收培養(yǎng)介質中的納米顆粒（NPs）后表現出對自身生長有益的作用（就改善根部生長而言）[17]。在土培實驗中，納米二氧化鈦（TiO2NPs）的施用促進了花生（Arachis hypogaea L.）根部的伸長，增加了植株根部生物量[18]。但有研究人員給小麥（Triticum aestivum L.）植株施加500 mg·kg-1的TiO2NPs發(fā)現，TiO2NPs對其生長狀況沒有影響，卻增加了其可食用部分的氨基酸含量[19]。Zhang等[20]使用不同濃度的納米銅（Cu NPs）處理小麥植株，發(fā)現Cu NPs顯著誘導了體內抗氧化劑（如脯氨酸）的合成。然而多數研究都集中在NMs單獨的利與弊或有機污染物單獨的毒理方面，關于它們聯合的生物學效應研究仍然十分有限[21-22]。有研究表明，添加100 mg·L-1TiO2NPs顯著提高了被1 mg·L-1四環(huán)素（TC）污染的擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）的鮮質量[23]。也有學者研究了鎳∕鐵雙金屬納米顆粒（Ni∕Fe NPs）對多溴聯苯醚（PBDEs）在大白菜（Brassica pekinensis L.）體內毒性的影響，發(fā)現Ni∕Fe NPs的施用顯著降低了PBDEs對植物的毒性[24]。但De La Torre-Roche等[25]探究富勒烯納米材料對1，1-雙（對氯苯基）-2，2-二氯乙烯（DDE）在西葫蘆（Cucurbita pepo L.）、大豆（Glycine max L.）和番茄（Solanum lycopersicum L.）體內累積的影響時，卻發(fā)現富勒烯納米材料的存在顯著增加了植物對DDE的吸收與累積（30%～65%）。

雖然目前有關于納米材料對作物吸收有機污染物（如DDE）影響的研究，但涉及PAHs的研究仍然有限?；谝陨涎芯楷F狀，本研究選用TiO2NPs（＜100 nm）作為納米材料的代表，因為TiO2NPs是目前使用最廣泛的納米材料之一，特別是在農業(yè)、美容、醫(yī)學和抗菌劑方面，全球每年產量高達1×107kg[26-27]；選擇芘作為代表性PAHs；選取大豆（Glycine max L.）作為糧食作物的代表，從農產品的安全生產和保障人類健康的角度出發(fā)，探究排放到土壤中或人為施用的NMs是否可以抑制植物對PAHs的吸收與累積。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

納米二氧化鈦（TiO2NPs，純度為99.0%，尺寸在15～25 nm）購自南京先豐納米材料科技有限公司；芘（標準物質，難溶于水，易溶于有機試劑）購自上海阿拉丁試劑有限公司；大豆種子購自南京明達種子有限公司。

1.2 幼苗培養(yǎng)

選取一定量大小一致、外觀無破損的大豆種子，用去離子水浮選篩除癟粒。使用0.2%次氯酸鈉溶液消毒30 min，然后浸泡在去離子水中。24 h后，將大豆種子均勻地置于底部鋪有濕潤濾紙的托盤中，放入人工氣候箱，在黑暗、25℃的條件下進行催芽。種子發(fā)芽至2 cm左右，轉移到去離子水中培養(yǎng)4 d。人工氣候箱的條件設置為：白天（光強為 375 μmol·s-1·m-2）25℃、16 h；夜晚（黑暗）20℃、8 h；相對空氣濕度為75%。

1.3 水培試驗

選取生長狀況較一致的大豆幼苗，先后轉移到1∕2濃度及全濃度Hoagland營養(yǎng)液（H）中分別培養(yǎng)4 d。接著用去離子水“饑餓處理”1 d，選取長勢一致的大豆植株，在莖基處剪去地上部，對完整的離體根進行4 h如下處理：（1）空白對照（HR），培養(yǎng)液中只有大豆根部；（2）1 mg·L-1芘溶液（HRP）；（3）100 mg·L-1TiO2NPs溶液（HRT）；（4）1 mg·L-1芘溶液+100 mg·L-1TiO2NPs溶液（HRPT）。所有處理各3個平行，均在包裹有鋁箔紙的玻璃燒杯中進行。處理所用的芘溶液均用甲醇助溶（為避免甲醇對植物生長產生影響，培養(yǎng)液中甲醇總濃度需低于0.1%），所有處理均含有等量的甲醇溶液。暴露結束后，所有大豆根部用去離子水沖洗干凈，并在甲醇中浸泡30 s，再用去離子水洗凈，擦干水分，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 根部芘含量測定

取部分大豆根冷凍干燥，研磨至粉末，稱取0.150 0 g樣品到40 mL棕色玻璃瓶中，加10 mL二氯甲烷與正己烷的混合溶液（V∶V=1∶1），超聲1 h，收集萃取液，共重復3次。準確量取20 mL萃取液旋蒸濃縮至少于1 mL，用混合溶液定容至2 mL。取0.5 mL濃縮液至已活化的SPE小柱進行純化（SPE小柱從下向上分別填充有：墊片、0.5 g無水硫酸鈉、1.0 g硅膠、1.0 g無水硫酸鈉、墊片。SPE小柱活化流程為：向柱中依次加入10 mL二氯甲烷、5 mL正己烷），用10 mL混合溶液進行洗脫。將收集到的洗脫液再次進行旋蒸濃縮，用二氯甲烷定容至2 mL，再過0.22 μm有機濾頭，采用氣相質譜（GC-MS，GC-MS 2020，日本島津）進行測定。

GC-MS測樣條件：氣相色譜儀使用Rt-max5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）氣相毛細管柱。進樣口溫度為250℃，進樣體積為1 μL，采用不分流進樣方式。載氣為高純氦氣（99.999%）。程序升溫：初始溫度60℃，保持1 min，再以10℃·min-1升溫至280℃，保持2 min。溶劑延遲5 min，離子化方式為電子轟擊（EI），離子化能量為70 eV，掃描模式選擇SIM模式。

1.5 根部鈦元素含量測定

取部分大豆根在70℃下烘干至恒質量，在常溫下加入6 mL 65%HNO3和2 mL H2O2混合溶液消解24 h，再在280℃電熱板上消解約6 h至1 mL左右，且控制溶液澄清。用2%HNO3將消解液轉移并定容至10 mL，過0.45 μm水系濾頭，采用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS，Agilent 8800x，美國）測定溶液中鈦離子的濃度。使用植物標準樣品（紫菜，GBW10020，中國地質科學院地球物理化學勘查研究所，中國）作為質控樣同時進行消解測定。

ICP-MS測樣條件：儀器功率為1 550 W，設置霧化氣流量為1.0 L·min-1，冷卻氣流量為14.0 L·min-1，輔助氣流量為0.8 L·min-1，樣品提升量為4.0 L·min-1，每次采樣深度為7.8 mm，重復采樣3次。

1.6 根部生理指標測定

收集處理后的大豆根部，用去離子水沖洗干凈，擦干水分后，按照質量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入勻漿介質，在冰水浴條件下制備組織勻漿液。采用黃嘌呤氧化酶法（NBT法）測定超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活力（U·g-1），以每克組織在1 mL反應液中將NBT還原50%為一個活力單位；采用硫代巴比妥酸比色法（TBA法）測定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量（nmol·g-1）；采用二硫代二硝基苯甲酸顯色法（DTAB法）測定還原型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）含量（μmol·g-1prot）[20]。

1.7 統(tǒng)計分析

使用Excel 2016、SPSS 17.0和Origin 8.0軟件對試驗數據進行處理、繪圖；使用單因素方差分析（Oneway ANOVA）確定各處理之間的差異顯著性，然后用Duncan法進行多重比較檢驗（α=0.05）。

2 結果與討論

2.1 大豆根部對鈦的吸收

在沒有添加TiO2NPs的處理中，大豆根部的鈦含量都非常低，說明測試儀器運行穩(wěn)定。單獨添加TiO2NPs時，大豆根部鈦含量為320 mg·kg-1。由于培養(yǎng)液中鈦離子含量很低，在μg·kg-1數量級，并且在處理過程中濃度穩(wěn)定（圖1），可見植物中的鈦元素主要來源于根部對TiO2NPs的直接吸收。有文獻利用雙穩(wěn)定同位素示蹤法研究水稻對Ag NPs的吸收與轉化時，在植物體內檢測到了Ag NPs，暗示了水稻根部直接攝取Ag NPs的可能性[28]。也有利用同步輻射顯微X射線熒光技術來研究小麥植物組織中NPs的分布，并通過透射電鏡對其進行觀察，發(fā)現TiO2NPs在根中積累并通過整個植物組織分布，沒有溶解或晶體相修飾[29]。通過電子顯微鏡、單粒子電感耦合等離子體質譜儀（sp-ICP-MS）來研究水稻對TiO2NPs的吸收時發(fā)現，5 mg·L-1和50 mg·L-1濃度下TiO2NPs的總元素分析結果與電鏡結果一致，表明TiO2NPs會被吸收到植物根中[30]。相比于TiO2NPs處理，芘+TiO2NPs處理下大豆根部的鈦含量增加了82.3%（圖2），說明PAHs會影響植物對TiO2NPs的吸收與累積。這有可能是因為芘的加入改變了TiO2NPs的表面電荷，使其更易被細胞表面固定，從而更多地進入到植物體內[31]。但尚未有明確的手段驗證該現象，其產生的具體原因有待進一步探究。

2.2 大豆根部芘的含量

圖3為不同處理大豆根部的芘含量。沒有添加芘的處理在大豆根部檢測到了芘的存在，有可能是因為植物本身會生成一些內源性PAHs[32]，也有可能是儀器自帶的系統(tǒng)誤差，沒有辦法做到絕對零含量檢測。但是相比其他處理而言，其含量非常低，可以忽略不計。與空白對照相比，單獨芘處理的大豆根部含有27.8 mg·kg-1的芘，可見大豆植株的根部確實會吸收PAHs，并將其累積在根部組織中。Dupuy等[33]對玉米根部進行菲暴露，利用熒光顯微鏡觀察玉米根部的微觀結構，發(fā)現了菲的存在。本實驗結果驗證了PAHs確實會進入植物體內，進而累積在食物網中，對人體健康造成潛在的風險[34]。有文獻報道PAHs通過植株的蒸騰拉力經由木質部向地上部遷移[35]。但結合該試驗中去除了大豆植株的地上部分，一定程度上說明蒸騰拉力并不是植物根部吸收PAHs的唯一動力。Zhan等[36]也研究發(fā)現，植物可以通過形成PAHs∕氫質子同向轉運體的形式實現對PAHs的主動吸收。

圖1 培養(yǎng)液中鈦離子濃度隨時間的變化Figure 1 The change of titanium ion concentration in culture medium with time

圖2 不同處理大豆根部鈦含量Figure 2 Titanium content in soybean root under different treatments

在芘和TiO2NPs共存的處理下，大豆根部芘含量為0.8 mg·kg-1。可見當大豆根部受芘污染時，TiO2NPs的添加使得芘含量降低了97.1%，并且與只有芘的處理相比呈現出顯著差異。說明TiO2NPs的存在可以減少大豆根部對PAHs的吸收與累積。有文獻報道，TiO2NPs會吸附固定環(huán)境中的PAHs，比如菲[37]。也有文獻報道，AgNPs（檸檬酸鹽包覆）會吸附重金屬污染物形成大的配合物，從而降低污染物的生物利用度，并抑制其在水蚤中的生物蓄積性。本研究結果的原因可能是出現了“特洛伊木馬效應”，即培養(yǎng)液中的部分芘會被TiO2NPs所吸附，而吸附過程通過形成NPs-污染物復合物在短時間內（4 h）緩解了污染物在生物體內的進入和運輸[38]；也有可能是TiO2NPs的存在破壞了芘進入植物體內的通道，從而抑制了植物根部對芘的吸收。

圖3 不同處理大豆根部芘含量Figure 3 Pyrene content in soybean root under different treatments

2.3 大豆根部的脂質過氧化

生物體暴露于外部刺激（如污染脅迫）時，會產生過量的活性氧物質（ROS），這可能會擾亂生物體的內在平衡并引起氧化應激反應，導致毒性效應[39-40]。MDA作為脂質過氧化的細胞毒性產物通常被看作是ROS產生與細胞損傷嚴重程度的衡量指標[41]。暴露于芘、TiO2NPs、芘+TiO2NPs的大豆，其根部MDA含量分別高出空白對照317.6%、64.7%、288.2%（圖4）。TiO2NPs處理與空白對照之間沒有顯著差異，可以認為TiO2NPs在該試驗條件下對大豆根部沒有毒性。但是有芘存在的處理與其他處理之間呈現顯著差異，可見芘的存在促進了ROS的產生，說明芘對大豆根部細胞的脂質化破壞程度顯著。芘+TiO2NPs處理增加的MDA含量少于兩個單獨處理下的增加量之和，可見芘和TiO2NPs對大豆根部細胞的脂質過氧化有拮抗作用。與芘處理相比，芘+TiO2NPs處理MDA含量降低，說明TiO2NPs的存在可能會緩解芘對大豆根部的損傷。試驗結果沒有顯著性差異，可能是試驗濃度限制了TiO2NPs的能力。De La Torre-Roche等[42]發(fā)現，大豆根部受DDE暴露時，Ag NPs的添加沒有引起MDA含量的增加。而且Ma等[31]通過研究發(fā)現TiO2NPs可以顯著減緩水稻根部的氧化應激反應。

2.4 大豆根部的抗氧化系統(tǒng)

圖4 不同處理大豆根部的MDA含量Figure 4 MDA content in soybean root under different treatments

植物體內的ROS可以被SOD通過歧化作用轉化為過氧化氫（H2O2）和分子氧（O2），這是對過量ROS的第一道防御，也是最重要的抗氧化途徑[43]。如圖5，與空白對照（HR）相比，HRP、HRT、HRPT處理大豆根部的SOD酶活性分別降低了87.2、223.7、64.4 U·g-1，可見無論是單獨的芘、TiO2NPs還是芘和TiO2NPs共存都抑制了SOD的活性。其中TiO2NPs處理與其他處理間呈現出顯著差異，但TiO2NPs處理的MDA含量與空白對照相比沒有顯著差異，說明TiO2NPs有可能是通過提高抗氧化酶活性來保護植物根部的。有研究表明，TiO2NPs可以增加黃瓜植株內的過氧化氫酶活性[27]。當大豆根部受芘污染時，TiO2NPs的添加對SOD活力的提高沒有顯著作用，可能是TiO2NPs的試驗濃度不夠高，效果不明顯。TiO2NPs是否可以用來保護植物免受芘的脅迫需要進一步設置系列濃度來探究。

圖5 不同處理大豆根部SOD的酶活Figure 5 SOD activity in soybean root under different treatments

當植物受到外界脅迫時，體內產生的ROS除了被酶促反應清除以外，也有以GSH為代表的非酶促反應起作用[44]。當ROS誘導產生氧化損傷時，為了保持細胞的正常狀態(tài)，GSH充當質子供體，清除ROS并被氧化成二硫化物形式[45]。與空白對照相比，TiO2NPs處理對大豆根部GSH含量沒有顯著影響，但單獨芘處理顯著增加了GSH含量（圖6），說明刺激大豆根部產生GSH的程度為芘＞TiO2NPs。有文獻報道，煙草受Cd脅迫時，GSH的含量呈增加趨勢[44]。Ma等[46]發(fā)現Ag NPs會通過增加海甘藍中GSH的含量來降低植物毒性。雖然芘刺激了大豆根部中GSH的生成，但是單獨芘處理下，大豆根部的MDA含量顯著增加，說明該試驗條件在清除ROS的過程中其他抗氧化物質的能力十分有限。芘+TiO2NPs同時處理下，其GSH含量與芘處理相比顯著降低，可見TiO2NPs的存在可以明顯抑制芘引發(fā)大豆根部的非酶促反應，說明對于GSH的生成，兩者之間存在拮抗作用。

圖6 不同處理大豆根部的GSH含量Figure 6 GSH content in soybean root under different treatments

3 結論

大豆根部的鈦主要來源于對TiO2NPs的直接吸收，蒸騰作用并不是大豆吸收PAHs的唯一動力。PAHs會促進植物根部對TiO2NPs的吸收與累積。但TiO2NPs的添加使大豆根部芘含量降低了97.1%，說明TiO2NPs的存在可以顯著減少大豆根部對PAHs的吸收與累積。TiO2NPs在本試驗條件下對大豆根部沒有毒性，但芘的存在促使了ROS的產生，對大豆根部細胞的脂質化破壞程度顯著。TiO2NPs的存在會緩解芘對大豆根部損傷，抑制大豆根部的SOD活性。芘處理顯著刺激了大豆根部GSH的生成，而MDA含量顯著增加，可見本試驗條件下其他抗氧化物質的能力十分有限。TiO2NPs的存在可以明顯抑制芘引發(fā)大豆根部的非酶促反應，兩者對GSH的生成存在拮抗作用。