選擇性COX-2抑制劑尼美舒利聯(lián)合順鉑抑制肺癌細胞LRP及MDR1表達

吳 潔, 張 卿

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,內(nèi)蒙古呼和浩特010050)

在歐美國家,肺癌占常見腫瘤的首位并且仍以每年0.5%的速率增長。研究表明[1]約60%～80%的肺癌病人初次確診時已到中晚期,已無手術機會,放化療成為中晚期肺癌的主要治療手段[2]。

大部分病人在發(fā)現(xiàn)肺癌時已失去手術治療的最佳時機,因此放化療在NSCLC中占有重要地位。但化療的毒副作用導致病人生活質(zhì)量差,耐受性差,化療后期出現(xiàn)耐藥等,是NSCLC化療效果不理想的重要因素。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),選擇性COX-2抑制劑NIM可誘導肺癌A549細胞凋亡、改變細胞周期分布、抑制細胞增殖;由此可能使肺癌綜合治療的療效提高[3]。本實驗探討選擇性COX-2抑制劑NIM與DDP聯(lián)合應用對肺癌耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)作用,并初步探究其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株:人肺癌耐順鉑細胞(A 549 DDP)株購自南京博爾迪生物科技有限公司。動物:BALB-C裸鼠:雄性,4～6wk,體重18～20g,購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所

1.2 方法

培養(yǎng)A 549 DDP細胞株：RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清及100U/mL青霉素及鏈霉素雙抗。PH調(diào)至7.2～7.4。在37℃,5%CO2孵育箱內(nèi)培育。

A 549 DDP細胞裸鼠移植瘤模型的建立:將A 549 DDP細胞消化后,用不含血清的1640培養(yǎng)基洗滌2次,最后用PBS液制成細胞數(shù)為5.0×106/0.2mL的細胞懸液,于裸鼠左前肢背側(cè)皮下注射0.2mL。成功構(gòu)建A 549 DDP細胞荷瘤鼠模型:接種A 549 DDP細胞3d左右開始成瘤,成瘤率達100%。移植瘤形態(tài)有圓形、卵圓形及結(jié)節(jié)型,瘤體早期平滑,體積逐漸增大后,后期部分瘤體出現(xiàn)破潰及結(jié)痂。成瘤期間裸鼠無其它明顯不良反應,飲食及活動正常,活力尚可,生長狀態(tài)良好。

實驗分組及藥物干預治療:將裸鼠完全隨機分為對照組、DDP組、NIM組、NIM聯(lián)合DDP組,每組8只。稱量裸鼠體重,按裸鼠公斤體重計算各組各藥使用劑量,自細胞接種后第3d開始,對照組每只每天以0.5%CMC0.2mL灌胃21d,0.9%生理鹽水0.2mL/4d腹腔注射;NIM組給予NIM 6 mg/mL連續(xù)灌胃21d;DDP組給予DDP(0.5g/mL)0.2mL/4d腹腔注射;聯(lián)合組給予NIM 6 mg/mL連續(xù)灌胃21d,順鉑(0.5g/mL)0.2mL/4d腹腔注射;飼養(yǎng)期間觀察裸鼠精神、活力、飲食及排便等一般情況。

繪制腫瘤生長曲線及計算腫瘤抑制率:連續(xù)21d藥物干預,每3d使用電子稱稱量荷瘤裸鼠體重1次、使用游標卡尺量各組腫瘤長短徑1次,繪制移植瘤生長曲線,移植瘤近似體積按公式:V=ab2/2估算[4](a,b分別為移植瘤的最長徑、最短徑)。藥物干預21d后再次稱裸鼠體重并斷頸處死動物,剝離皮下A 549 DDP細胞移植瘤,稱瘤重,計算移植瘤體積抑制率及移植瘤重量抑制率:移植瘤體積抑制率=(對照組移植瘤體積-實驗組移植瘤體積)/對照組移植瘤體積×100%;移植瘤重量抑制率=(對照組移植瘤重-實驗組移植瘤重)/對照組移植瘤重×100%

由北京d根生物技術研究提供的總RNA提取試劑盒(離心柱型)RNA simple Total RNA Kit 提取移植瘤組織總RNA。采用Thermo Fermenta K1622反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。選取GAPDH為內(nèi)參基因,GAPHD和目標基因引物的設計和合成均委托invitrogen生物技術公司設計并合成。設計引物:MDR1、LRP、 GAPDH進行實時熒光定量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS18.0軟件系統(tǒng)分析所得數(shù)據(jù),結(jié)果分析根據(jù)是否符合正態(tài)分布;具有方差齊性采用單因素方差分析比較多組間均數(shù)的差異,方差不齊時采用秩和檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 尼美舒利對裸鼠移植瘤生長的影響

腫瘤生長曲線及腫瘤抑制率:繪制腫瘤生長曲線(見圖1)。除第3d外,聯(lián)合組、NIM組、DDP組裸鼠移植瘤體積均顯著低于對照組,生長速度明顯緩慢于對照組(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。SNK-q檢驗兩兩比較后聯(lián)合組、NIM組、DDP組的體積抑瘤抑制率分別為:72.93%、56.84%、31.35%。重量抑瘤率分別為53.41%、41.86%、21.89%;聯(lián)合組移植瘤體積顯著低于對照組及NIM組(P<0.05);對照組瘤體積顯著高于聯(lián)合組、NIM組、DDP組(P<0.05)(見表1)。

表1 對照組、NIM組、DDP組、聯(lián)合組瘤質(zhì)量及體積

2.2 熒光定量RT-PCR結(jié)果統(tǒng)計分析

對照組、NIM組、順鉑組、聯(lián)合組LRP mRNA、MDR 1 mRNA在各組移植瘤的表達;經(jīng)單因素方差分析后對照組、NIM組、DDP組、聯(lián)合組的LRP及MDR1基因表達量得出的F值分別為:25.377(P<0.01)、17.309(P<0.01)證明四組之間表達量有顯著差異。經(jīng)過SNK-q檢驗后進行兩兩比較,顯示DDP組中LRP mRNA、MDR 1 mRNA表達量均高于對照組、NIM組、聯(lián)合組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);聯(lián)合組(NIM+DDP)LRP mRNA、MDR 1 mRNA表達量明顯低于其他各組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);NIM組LRP mRNA、MDR 1 mRNA表達均低于對照組及DDP組。差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

近年來,腫瘤的發(fā)生率逐步上升,尤其肺癌在全世界的總發(fā)病率呈現(xiàn)急劇上升的趨勢,高居惡性腫瘤榜首[5]。目前肺癌的治療方法主要為手術及放化療聯(lián)合,導致化療失敗的主要原因是腫瘤細胞對化療藥物表現(xiàn)出來的耐藥性,這已成為治療腫瘤的一大障礙。

肺癌化療的多藥耐藥是一個多基因、多因素的過程,主要有MDR1、LRP、P-gP、ToPo-II、GST-π等參與耐藥機制的形成[6]。這些因子通過不同的機制介導肺癌細胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗。李寧等[7]研究顯示,MDR 1 mRNA的蛋白產(chǎn)物P-gP能通過將藥物泵出胞外使得腫瘤細胞內(nèi)的藥物濃度降低而提高細胞的耐藥性。另有研究顯示[8]LRP mRNA表達的增加可導致化療藥物的耐藥,其中對順鉑耐藥的影響尤為明顯。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn),選擇性COX-2抑制劑NIM可誘導肺癌A549細胞凋亡、改變細胞周期分布、抑制細胞增殖的作用,本研究將A 549 DDP細胞培養(yǎng)、傳代后配制細胞懸液,接種于裸鼠皮下,并成功構(gòu)建A 549 DDP細胞裸鼠皮下移植瘤模型。體內(nèi)試驗表明: NIM組、DDP組、聯(lián)合組移植瘤生長遲緩,體積顯著小于對照組(P<0.05)。抑瘤率聯(lián)合組72.93%與其他組相比顯著增高(P<0.05)。提示聯(lián)合組對移植瘤生長有明顯抑制作用,聯(lián)合組較其他組別LRP、MDR1表達量明顯下調(diào)。順鉑組作用移植瘤后,其表達量更強。由此推斷應用NIM后耐藥細胞對DDP敏感性提高,尼美舒利可能對DDP化療耐藥起到了逆轉(zhuǎn)作用。

我們的研究結(jié)果顯示,選擇性COX-2抑制劑NIM聯(lián)合DDP可抑制A 549 DDP移植瘤生長的作用以及逆轉(zhuǎn)A 549 DDP對順鉑耐藥的作用。其機制可能與下調(diào)LRP、MDR1的表達有關。為肺癌的綜合治療提供了新的治療策略。