Notch1、Akt、PTEN及ABCG2在直腸癌干細(xì)胞中的表達(dá)研究 *

曲 澤, 姜 東, 侯明星

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)中心Ⅱ區(qū),內(nèi)蒙古呼和浩特010059; 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

本文從結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中分離得到CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞,通過(guò)體外無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)及CD133抗體標(biāo)記后的流式細(xì)胞篩選,從人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中分離得到CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞,采用qRT-PCR檢測(cè)手段NOTCH1、AKT、PTEN及ABCG2在結(jié)腸癌干細(xì)胞及普通結(jié)腸癌細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 流式細(xì)胞儀分選結(jié)腸癌干細(xì)胞

細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)后,配制FACS分選緩沖液,取成球生長(zhǎng)的干細(xì)胞,清洗消化制成1mL單細(xì)胞懸液如上,細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù),密度為107/mL。棄上清液,加入1mLLFACS分選緩沖液上機(jī)分選。對(duì)照組加入PBS。

1.3 RNA 的提取和qRT-PCR

取分選后培養(yǎng)成球的結(jié)腸癌干細(xì)胞。用胰酶-PBS混合液消化細(xì)胞球,加入5%FBS的1640培養(yǎng)液中制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞傳代培養(yǎng),將6孔板倒置并肉眼直接計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù),數(shù)三次,計(jì)算每組平均數(shù),計(jì)算。細(xì)胞裂解后測(cè)定各細(xì)胞因子RNA的濃度及進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀分選的CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞

分別將人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞及HCT16干細(xì)胞球制成單細(xì)胞懸液,上機(jī)分析并進(jìn)行流式細(xì)胞分選。經(jīng)CD133抗體標(biāo)記后,HCT116細(xì)胞球中CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞數(shù)為4.28%±1.21%。

2.2 結(jié)腸癌干細(xì)胞的體外克隆增殖情況

通過(guò)觀察其集落形成能力,判斷其增殖能力。結(jié)果表明分選出的CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞相比較普通結(jié)腸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖分化能力(見(jiàn)圖1)。

2.3 qRT-PCR各反應(yīng)物表達(dá)情況

分別以結(jié)腸癌干細(xì)胞及普通結(jié)腸癌細(xì)胞為研究對(duì)象,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各基因在細(xì)胞周期內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt,內(nèi)參為管家基因β-actin,結(jié)果(見(jiàn)表1)。在結(jié)腸癌干細(xì)胞中,NOTCH1、AKT及ABCG2的mRNA表達(dá)高于普通結(jié)腸癌細(xì)胞,而抑癌基因PTEN mRNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照組。

3 討論

Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞正常增殖和分化、參與T細(xì)胞發(fā)育、調(diào)節(jié)血管生成、參與器官和組織的更新。在結(jié)直腸癌領(lǐng)域內(nèi),Notch1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路同樣起著極為重要的作用。我們的實(shí)驗(yàn),通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè),證實(shí)Notch1的mRNA在CD133+的結(jié)腸癌干細(xì)胞中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)普通腫瘤細(xì)胞。CD133+的結(jié)直腸癌干細(xì)胞比未分型的干細(xì)胞,具有更強(qiáng)的致瘤性及無(wú)限增殖能力[1],這也從側(cè)面論證了我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。

表1 結(jié)腸癌干細(xì)胞(CSCs)及HCT116細(xì)胞中各因子mRNA表達(dá)相對(duì)水平

AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)控細(xì)胞周期、啟動(dòng)凋亡系統(tǒng)、參與血管淋巴管生成及細(xì)胞遷移等過(guò)程?；罨腁KT能夠通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,抑制腫瘤凋亡,并且可以通過(guò)調(diào)控其下游靶基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲。研究已證實(shí),ATK信號(hào)通路的紊亂與腫瘤細(xì)胞的異常分裂和增殖有關(guān),而且該信號(hào)通路能增加腫瘤組織的血管密度及提高腫瘤細(xì)胞的侵襲力。在結(jié)腸癌領(lǐng)域中,AKT信號(hào)通路也是研究熱點(diǎn)。抑制ATK分子磷酸化可以有效防止結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,可作為結(jié)直腸癌的新型治療手段[2]。我們的試驗(yàn)也表明,結(jié)腸癌干細(xì)胞組中AKT mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。

PTEN作為抑癌基因,其異常表達(dá)可存在于多種腫瘤細(xì)胞中。Rujuan SU等在收集了118個(gè)腫瘤病人的組織后,通過(guò)病理對(duì)照研究證實(shí)沉默PTEN基因會(huì)促使CD133陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞中ATK信號(hào)通路表達(dá)異?；钴S[3]。有研究顯示,PTEN基因在結(jié)腸腺瘤形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞蛋白異質(zhì)性中起重要作用,與減少的大小,管狀結(jié)構(gòu)和高CD133陽(yáng)性組件相關(guān)[4]。Eric C.Hales學(xué)者研究證實(shí),過(guò)表達(dá)Notch1基因會(huì)使PTEN的表達(dá)受到抑制,抑制其表達(dá)會(huì)使PTEN的表達(dá)活躍[5]。這與我們的結(jié)果相吻合。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展依賴多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同作用。多位學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),Notch1信號(hào)通路能影響如Wnt、PDGF及AKT等信號(hào)通路的活性,過(guò)表達(dá)Notch1會(huì)引起ATK含量的升高,沉默Notch1會(huì)引起ATK含量的降低[6]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同樣證實(shí)了上述結(jié)論,CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞組內(nèi)Notch1表達(dá)增高,而同時(shí)ATK表達(dá)也同樣增高。通過(guò)查找相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及初步試驗(yàn),我們首先提出一種假設(shè),PTEN基因可作為影響NOTCH-AKT通路中雙向調(diào)控因子。

研究發(fā)現(xiàn)CD133+結(jié)直腸癌干細(xì)胞與ABCG2基因的表達(dá)密切相關(guān),該基因是結(jié)直腸癌可能的治療靶點(diǎn)。Andersen等學(xué)者在研究結(jié)直腸癌時(shí)發(fā)現(xiàn)病人癌組織中ABCG2的表達(dá)率是癌旁組織表達(dá)率的10倍,并表明 ABCG2基因的表達(dá)與結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。沉默PTEN分子會(huì)使ATK信號(hào)通路活躍,同時(shí)活躍的ATK信號(hào)又會(huì)激發(fā)ABCG2分子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)在分選出CD133+的結(jié)腸癌干細(xì)胞后,用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)出ABCG2的mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。

綜上所述,我們進(jìn)一步提出假設(shè):CD133+結(jié)腸癌干細(xì)胞中Notch1分子較對(duì)照組高表達(dá),因此在干細(xì)胞中PTEN的表達(dá)會(huì)受到明顯抑制,負(fù)向調(diào)節(jié)導(dǎo)致干細(xì)胞組的ATK分子的表達(dá)明顯增高,進(jìn)而

增加干細(xì)胞組ABCG2的表達(dá)量。即在結(jié)腸癌干細(xì)胞中可能存在Notch1-(PTEN)-ATK-ABCG2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,干擾此信號(hào)通路中的每一個(gè)基因都有巨大的意義。我們也將對(duì)該信號(hào)通路進(jìn)行更深入的研究。