膠原誘導(dǎo)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型制備及早期表現(xiàn)評(píng)價(jià) *

蘇云龍, 王雪梅

(1.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市中心醫(yī)院CT-MRI室,內(nèi)蒙古 鄂爾多斯市 017000, 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種免疫炎癥性疾病,常常導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛和僵硬,關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)性損傷及功能性殘疾[1,2]。如果不在早期進(jìn)行及時(shí)有效的治療,病情一般發(fā)展迅速,大約有90%的病人在2a后可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形或殘疾,從而使生活質(zhì)量和工作能力嚴(yán)重下降[3，4]。

動(dòng)物模型在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療藥物篩選和發(fā)病機(jī)理研究等方面有非常重要的作用。目前,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的制備方法有很多種,但是大多數(shù)模型建立的周期都比較長、成功率也比較低,嚴(yán)重影響RA的進(jìn)一步深入研究。Ⅱ型膠原免疫誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的臨床表現(xiàn)、病理改變與人類RA比較相似,是被公認(rèn)的最佳類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型[5]。本文通過Ⅱ型膠原乳劑免疫誘導(dǎo)的方法制備大鼠 CIA 模型,并對(duì)其進(jìn)行病理學(xué)及影像學(xué)方法進(jìn)一步評(píng)價(jià),試圖找出類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型早期研究的最佳時(shí)期。

1 材料及方法

1.1 材料

健康雌性Wistar 大鼠(清潔級(jí)),60只,體重185～205g,周齡8～9wk。飼養(yǎng)1wk后分成2組,CIA組50只;空白對(duì)照組10只。牛Ⅱ型膠原(產(chǎn)地美國Sigma公司),足爪體積測量儀(自制,專利號(hào):ZL201420335087.3),X線機(jī)(GE公司)。

1.2 方法

1.2.1模型建立 CIA組大鼠用型膠原乳劑分別行初次免疫與加強(qiáng)免疫兩次給藥的方法建立模型。將大鼠用水合氯醛麻醉后,分別在尾根部和背部脊柱兩側(cè)多點(diǎn)皮內(nèi)注射乳劑。初次免疫分別在CIA組大鼠的尾根部和背部(0.2～0.4mL/只)皮內(nèi)注射型膠原乳劑,初次免疫2wk后,同樣將型膠原乳劑分別在尾根部和背部皮內(nèi)注射(劑量為0.3mL/只)進(jìn)行加強(qiáng)免疫?？瞻讓?duì)照組大鼠將同等劑量的生理鹽水分別在尾根部及背部皮內(nèi)注射做為陰性對(duì)照。

1.2.2觀察測量內(nèi)容及評(píng)分

1.2.2.1觀察大鼠的臨床表現(xiàn)

造模前及造模后每5d測一次實(shí)驗(yàn)大鼠體重,并記錄臨床特點(diǎn)變化情況,其中包括大鼠的飲食量、體毛的顏色改變、關(guān)節(jié)腫脹程度及活動(dòng)度。

1.2.2.2計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度

采用排水法用自制的足爪體積測量儀測量大鼠足爪體積,并分別計(jì)算出各足爪的腫脹度。從造模后(注射藥物開始免疫后)0～45d每隔5d用足爪體積測量儀檢測一次足爪的體積,每個(gè)足爪每次要測定三次,最后算出平均值。關(guān)節(jié)腫脹度計(jì)算公式為:關(guān)節(jié)腫脹度=(測量值-造模前所測值)/造模前所測值×100%。

1.2.2.3評(píng)分

造模后每5d觀察并記錄一次實(shí)驗(yàn)大鼠四肢關(guān)節(jié)部位的病變情況,然后行大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分,根據(jù)每個(gè)關(guān)節(jié)的病變情況累計(jì)積分,即為每只大鼠的AI值(Arthritic Index,關(guān)節(jié)炎指數(shù))。評(píng)分3分以上的大鼠為肉眼觀察造模成功的模型。

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分:無任何異常;1分:個(gè)別足趾關(guān)節(jié)有輕微腫脹;2分:大部分踝關(guān)節(jié)及足趾關(guān)節(jié)輕度腫脹,并有紅斑;3分:踝關(guān)節(jié)及以下關(guān)節(jié)中度腫脹(腫脹度在40%～50%);4分:踝關(guān)節(jié)及以下關(guān)節(jié)重度腫脹(腫脹度在51%～75%);5分:踝關(guān)節(jié)及以下關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹(腫脹度大于75%)。

1.3 χ線顯像

造模前及造模后15d、25d、45d對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行踝關(guān)節(jié)放射X光檢查,χ線機(jī)攝片設(shè)置參數(shù)條件為40KV。閱片由2位高級(jí)職稱放射科醫(yī)師分別進(jìn)行,重點(diǎn)觀察實(shí)驗(yàn)大鼠關(guān)節(jié)部位軟組織腫脹情況,關(guān)節(jié)面是否有破壞,關(guān)節(jié)間隙有無狹窄等。

1.4 病理檢測

實(shí)驗(yàn)大鼠造模后45d斷頸處死,切取包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的整個(gè)足爪進(jìn)行病理檢測。最后由兩位有高級(jí)職稱的病理醫(yī)師分別進(jìn)行病理閱片,重點(diǎn)觀察大鼠關(guān)節(jié)部位的病理變化,關(guān)節(jié)滑膜是否有炎細(xì)胞浸潤,以及關(guān)節(jié)滑膜增厚情況,特別是血管翳形成及關(guān)節(jié)面下的骨、軟骨破壞情況等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠的一般狀態(tài)

空白對(duì)照組大鼠隨著飼養(yǎng)時(shí)間的增加,飲食良好,活動(dòng)自如,毛發(fā)光澤,足爪未見明顯腫脹。CIA組大鼠在造模后3～5d頭部毛發(fā)開始發(fā)紅,體溫明顯升高。造模后4～7d注射部位出現(xiàn)紅腫和炎性小潰瘍或結(jié)節(jié),并逐漸加重,部分出現(xiàn)破潰。造模后8～12d毛發(fā)發(fā)紅現(xiàn)象開始改善,破潰處逐漸有硬痂形成,而后結(jié)痂逐漸脫落。在造模5d后CIA組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡,飲食量明顯減少,活動(dòng)度減少,體毛無光澤干枯發(fā)黃,并有脫毛情況。

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠體重變化情況

空白對(duì)照組大鼠在飼養(yǎng)過程中體重是逐漸增加的。CIA組大鼠在造模后體重增長較正常大鼠明顯緩慢,有部分大鼠體重有所下降。在造模25d后與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在造模40d后與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表1)。

表1 造模后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠體重(g)

2.3 實(shí)驗(yàn)大鼠踝關(guān)節(jié)局部的觀察情況

空白對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)無腫脹,足爪局部是正常的粉紅色,足爪體積也沒有明顯變化。CIA組大鼠在造模后第10d足爪局部可見有紅斑,隨后足爪紅斑及腫脹程度逐漸加重,活動(dòng)不便。到造模后第25d,CIA組大鼠共有78個(gè)足爪關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度紅腫及軟組織腫脹,且大部分為后足,病變關(guān)節(jié)屈曲及活動(dòng)受限,30d后紅腫程度有所緩解,但持續(xù)輕-中度腫脹。

2.4 CIA組及空白對(duì)照組大鼠足爪體積的變化情況

空白對(duì)照組大鼠足爪體積在整個(gè)測量過程中增加穩(wěn)定,各時(shí)間點(diǎn)前后差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CIA組大鼠在造模后15d足爪體積開始明顯增加,與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組大鼠足爪體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),CIA組大鼠在造模30d后足爪體積雖然稍有下降,但與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組大鼠足爪體積差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表2)。

表2 空白對(duì)照組與CIA組大鼠造模后的足爪體積表(ml)

2.5 CIA組及空白對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分結(jié)果

CIA組大鼠在造模后每5d進(jìn)行一次四肢關(guān)節(jié)部位的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分,四肢評(píng)分值相加得總評(píng)分(0分～20分),評(píng)分在8～10分是比較嚴(yán)重的。在造模10d后隨著免疫反應(yīng)的發(fā)展,AI 值逐漸增加,并且各時(shí)間點(diǎn) AI值均與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其中30d時(shí)達(dá)峰值,之后稍有下降,在造模后25～45d中,評(píng)分3分以上的大鼠共有36只,其中,共有53個(gè)關(guān)節(jié)評(píng)分大于3分,而且大部分為后足關(guān)節(jié),前足較少,成模率為72%(見表3)。

表3 空白對(duì)照組與CIA組大鼠造模后的評(píng)分表

2.6 關(guān)節(jié)的病理結(jié)果

空白對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)部位滑膜層未見炎細(xì)胞浸潤,關(guān)節(jié)內(nèi)無纖維增生,滑膜層未見增厚。CIA組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜層有炎細(xì)胞浸潤,滑膜細(xì)胞數(shù)量可見明顯增多,肥大的細(xì)胞排列不規(guī)則,滑膜細(xì)胞層數(shù)明顯增厚,而且增生的滑膜可見有血管翳形成,并爬行到軟骨面,開始侵蝕軟骨及骨,部分有軟骨及骨的侵蝕破壞。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種發(fā)病機(jī)制不明的自身免疫疾病[6],有研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素及生活環(huán)境與RA的患病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。有效的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究RA疾病早期發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ),建立合適的動(dòng)物模型也為RA的診斷及治療方法的研究提供了有力的保障,本文運(yùn)用Ⅱ型膠原免疫誘導(dǎo)的方法成功建立了CIA模型,模型成功率是72%。

本文研究發(fā)現(xiàn),CIA組大鼠在造模3d后陸續(xù)出現(xiàn)頭部毛發(fā)發(fā)紅、體溫明顯升高,進(jìn)食量減少,活動(dòng)減少,體重增長緩慢或下降等臨床表現(xiàn),這可能是體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)導(dǎo)致的。CIA組大鼠在造模后15d足爪體積開始明顯增加,在造模后25d體重及足爪體積與空白對(duì)照組差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在造模后25dCIA組大鼠踝關(guān)節(jié)軟組織腫脹及紅腫程度達(dá)到高峰,且大部分為后足。而且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,CIA組大鼠足爪在造模25d時(shí)是腫漲高峰期,這與相關(guān)文獻(xiàn)一致[7,8]。在造模后30d時(shí)CIA組大鼠AI值達(dá)峰值,之后稍有下降,但在造模后25～45d中評(píng)分均值都在5分以上,這可能是由于急性水腫期導(dǎo)致的。在造模后25d,CIA組大鼠X線片顯示關(guān)節(jié)面光滑,關(guān)節(jié)間隙未見狹窄,而在45d后部分關(guān)節(jié)邊緣可見有骨質(zhì)破壞,說明在造模后45d時(shí)部分模型動(dòng)物已經(jīng)有關(guān)節(jié)功能的永久性損傷。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí),在造模后25d左右可能是膠原誘導(dǎo)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型的發(fā)病早期,而在造模后45d部分動(dòng)物模型已接近大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的中晚期,所以在造模45d后已經(jīng)不適合對(duì)Ⅱ型膠原免疫誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期表現(xiàn)的研究。因此,本研究提示對(duì)早期膠原誘導(dǎo)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型的研究應(yīng)該在造模后25d左右進(jìn)行,尤其是對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期發(fā)病機(jī)制及治療的實(shí)驗(yàn)研究。