男性不育病人620例的遺傳學(xué)因素調(diào)查 *

武艾寧, 戴曉怡, 于榮鑫

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,內(nèi)蒙古呼和浩特010050)

不孕不育是世界范圍關(guān)注的生命健康問(wèn)題,有統(tǒng)計(jì)資料顯示[1,2],不孕不育的發(fā)生率高達(dá)10%～15%,其中因男性問(wèn)題導(dǎo)致的不育癥接近50%,以嚴(yán)重少精、弱精、畸精和無(wú)精子癥等為主要表現(xiàn)形式。造成生精功能障礙的原因有多種,其中遺傳缺陷(如染色體異常和基因突變)導(dǎo)致的不育病因占有重要地位。為了進(jìn)一步明確男性不育癥的遺傳病因,本研究對(duì)近年來(lái)收集到的部分原發(fā)無(wú)精子與少精子癥病人進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析和AZF基因缺失篩查,旨在為不孕不育的病因?qū)W研究及指導(dǎo)再次生育提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集2012-03～2018-05期間內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院遺傳咨詢(xún)門(mén)診、生殖中心就診的男性不育病例620例,年齡21～47歲,平均29.3±4.2歲,均無(wú)生育史。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)排除女方不育因素;(2)排除精索靜脈曲張,隱睪,梗阻性無(wú)精,逆行性射精,泌尿生殖道感染等引起的不育;(3)對(duì)病史資料、遺傳學(xué)檢測(cè)信息可能被用于流行病學(xué)研究表示知情同意。另選取230例健康男性組成對(duì)照組,全部精液參數(shù)正常并已生育且年齡與病例組匹配。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1精液分析 按照WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液常規(guī)分析,連續(xù)三次進(jìn)行精液分析,3次精液離心后,沉淀涂片均未見(jiàn)精子者為無(wú)精子癥;平均精子密度<20×106/L者為精液質(zhì)量異常[3]。

1.2.2外周血染色體檢查 抽取外周血0.5mL行淋巴細(xì)胞培養(yǎng),常規(guī)制備G顯帶,GSL120染色體自動(dòng)分析系統(tǒng)自動(dòng)采集分裂相圖像,每例計(jì)數(shù)20個(gè)核型,分析5個(gè)染色體核型,對(duì)異常核型加倍分析及計(jì)數(shù),保存全部圖像,必要時(shí)做C顯帶或N顯帶。核型標(biāo)準(zhǔn)參照人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體系(ISCN2009)[4]。

1.2.3Y染色體微缺失(AZF)及AZFc區(qū)部分缺失的分析 不育病例根據(jù)精液分析參數(shù)進(jìn)行分組,即無(wú)精子癥組和精液質(zhì)量異常組,同時(shí)增加健康對(duì)照組。采用亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供的AZF試劑盒進(jìn)行多重PCR實(shí)驗(yàn),設(shè)定AZF區(qū)域15個(gè)STS位點(diǎn),分別為:AZFa(sY82、sY84、sY86)、AZFb(sY124、sY127、sY128、sY133、sY134、sY143)、AZFc(sY239、sY242、sY254、sY255)、AZFd(sY145、sY152)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。對(duì)未檢測(cè)出AZF基因微缺失的受檢者并對(duì)照組,行AZFc區(qū)及其附近STS位點(diǎn)的部分缺失分析;共8個(gè)位點(diǎn)分別為:sY1201(677bp)、sY1206(394bp)、sY142(196bp)、sY1258(968bp)、sY1197(453bp)、sY1291(527bp)、sY1191(385bp)、sY1161(330bp)。以上實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作,對(duì)結(jié)果異常者重復(fù)擴(kuò)增3次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析用2%瓊脂糖電泳,經(jīng)Dolphin-Doc凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行DNA電泳條帶觀察。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

AZF基因檢測(cè),PCR擴(kuò)增后在2%瓊脂糖凝膠電泳,對(duì)應(yīng)位置上未見(jiàn)擴(kuò)增帶的,判定為相應(yīng)位點(diǎn)的缺失。AZF區(qū)域15個(gè)STS位點(diǎn)見(jiàn)一個(gè)或多個(gè)缺失的,判定為Y染色體AZF微缺失。待測(cè)標(biāo)本僅缺失sY1291,而其余七個(gè)位點(diǎn)存在,疑似gr/gr缺失;待測(cè)標(biāo)本僅缺失sY1191,而其余七個(gè)位點(diǎn)存在,疑似b2/b3缺失;待測(cè)標(biāo)本同時(shí)缺失sY1291、sY1191和sY1161,其余五個(gè)位點(diǎn)存在,疑似b1/b3缺失。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有采集數(shù)據(jù)信息經(jīng)編碼整理錄入數(shù)據(jù)庫(kù),采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,分類(lèi)變量用頻數(shù)、百分比表示,組間比較采用采用卡方檢驗(yàn)和Fisher確切概率法進(jìn)行,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α值取雙側(cè)0.05。

2 結(jié)果

2.1 不育病人的細(xì)胞遺傳學(xué)分析結(jié)果

620例不育病人按精液常規(guī)結(jié)果分組為無(wú)精子癥組(n=276)和精液質(zhì)量異常組(n=344);620例不育病人中,核型異常發(fā)生率為15.65%(97/620),染色體多態(tài)性發(fā)生率為5.16%(32/620)。97例核型異常檢出者中包括性染色體異常85例,占87.63%;常染色體異常12例,占12.37%(見(jiàn)表1)。

2.2 Y染色體AZF基因微缺失結(jié)果

AZF檢測(cè)顯示對(duì)照組無(wú)AZF微缺失,620例不育病人中AZF缺失率為10.81%(67/620),其中無(wú)精子癥組缺失率為12.68%(35/276),精液質(zhì)量異常組缺失率為9.30%(32/344),相比于精液質(zhì)量異常組,無(wú)精子癥組Y染色體AZF微缺失率明顯升高(P<0.05)。本組不育病人缺失最易發(fā)生的區(qū)域?yàn)锳ZFc區(qū),占68.7%(46/67),最易缺失的位點(diǎn)為SY152、SY255和SY254(見(jiàn)表2)。

2.3 AZFc區(qū)部分缺失在病例和對(duì)照中的分布情況

經(jīng)AZFc區(qū)及其附近的8個(gè)STS位點(diǎn)的部分缺失分析,發(fā)現(xiàn)存在gr/gr型及b2/b3型AZFc區(qū)部分缺失類(lèi)型,對(duì)照組、精液質(zhì)量異常組和無(wú)精子癥組3組間在b2/b3缺失率的比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);無(wú)精子癥病人b2/b3缺失率最高,精液質(zhì)量差病人次之,對(duì)照組缺失率最低;此外,gr/gr缺失率的三組間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見(jiàn)表3)。

表1 男性不育病人中異常染色體及多態(tài)性核型分析結(jié)果

表3 各組AZFc區(qū)部分缺失率的比較

3 討論

男性不育最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)為無(wú)精子和少弱精子等精液異常,一般認(rèn)為,影響精液質(zhì)量的主要問(wèn)題為:染色體核型異常、Y染色體微缺失、精索靜脈曲張、輸精管梗阻、隱睪、附睪損傷以及生殖泌尿道感染等,其中染色體異常和分子遺傳學(xué)水平的基因突變所引起的生精障礙估計(jì)占到男性不育的30%[5]。維持精子的發(fā)生是多基因調(diào)控的過(guò)程,染色體是基因遺傳物質(zhì)的載體,當(dāng)染色體結(jié)構(gòu)、數(shù)目出現(xiàn)異常或者基因缺失均對(duì)精子生成造成影響,導(dǎo)致不同程度的精液質(zhì)量異常。

既往研究表明[6,7],在導(dǎo)致原發(fā)無(wú)精子和少精子的遺傳因素中染色體核型異常是最常見(jiàn)的,本組研究中不育癥病例中共檢出異常核型病人97例,核型異常發(fā)生率為15.65%,與部分研究結(jié)果近似。本研究結(jié)果顯示,97例核型異常者共檢出性染色體異常85例,常染色體異常12例,分別占到核型異常人群的87.63%、12.37%,由此表明在染色體核型異常的男性不育病人中,性染色體異常是導(dǎo)致不育的最主要原因。其結(jié)果在于當(dāng)性染色體的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生畸變時(shí),將會(huì)導(dǎo)致某些基因功能的喪失,而性染色體數(shù)目的改變,可使多余的染色體產(chǎn)生劑量效應(yīng)影響正常生精功能。

國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究表明,Y染色體微缺失是導(dǎo)致男性不育的第二大遺傳學(xué)因素,Y染色體長(zhǎng)臂1區(qū)1帶存在有與精子生成有關(guān)的遺傳因子,稱(chēng)為無(wú)精子因子(azoospermiafactor,AZF)。AZF區(qū)域的缺失是生精障礙的重要原因。Mohseni等[8]的一項(xiàng)大樣本研究及整合分析提示,在無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥的病人中AZF微缺失率可能占到15%。國(guó)內(nèi)學(xué)者等報(bào)道原發(fā)無(wú)精癥Y染色體AZF微缺失率達(dá)8.9%,嚴(yán)重少精癥病人AZF缺失率約5%～7%,且缺失率的種族與地域差異不顯著。多項(xiàng)研究證實(shí)[9～11]AZF缺失病人少精子的癥狀有進(jìn)行性加重及遺傳放大的可能。一般情況下,常規(guī)染色體核型分析不能評(píng)估Y染色體微缺失情況,只有通過(guò)分子檢測(cè)才能明確。最新研究證實(shí),AZF家族共有AZFa、AZFb、AZFd、AZFc四個(gè)區(qū)域,本研究根據(jù)此劃分選擇15個(gè)STS位點(diǎn)進(jìn)行PCR,共檢出AZF缺失67例,AZF缺失率為10.81%,相比于精液質(zhì)量異常組,無(wú)精子癥組Y染色體AZF微缺失率明顯升高(P<0.05)。既往研究顯示[12],在不育病人中AZFc區(qū)缺失率最高,且存在眾多缺失類(lèi)型。推斷與AZFc區(qū)接近高度重復(fù)異染色質(zhì)區(qū),遺傳物質(zhì)比較容易缺失有關(guān),Y染色體AZFc區(qū)分布著Y染色體上數(shù)量最多的睪丸組織特異性表達(dá)基因,由多種獨(dú)特的擴(kuò)增子家族構(gòu)成,眾多的Amplicons可發(fā)生同源重組,同源重組常造成部分基因拷貝的缺失[12],反向的相同Amplicons可在發(fā)生染色體內(nèi)倒位后形成新的Amplicons排列[11],在其后的某一代中發(fā)生同源重組,故AZFc區(qū)同源重組導(dǎo)致的缺失類(lèi)型種類(lèi)眾多,臨床表現(xiàn)多樣,可以從正常到無(wú)精癥。本研究不育病人缺失最易發(fā)生的區(qū)域?yàn)锳ZFc區(qū),占68.7%(46/67),本研究與部分文獻(xiàn)報(bào)道相符。在AZFc中存在著各種類(lèi)型的部分缺失,本研究對(duì)部分缺失類(lèi)型進(jìn)行了分析,其中g(shù)r/gr缺失在AZFc區(qū)部分缺失中發(fā)生率較高,b2/b3缺失也較為常見(jiàn),本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)b2/b3缺失率在對(duì)照組、精液質(zhì)量異常組和無(wú)精子癥組3組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而gr/gr缺失率在上述三組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),提示b2/b3型缺失可能是男性不育的一個(gè)遺傳因素。目前多數(shù)研究認(rèn)為,b2/b3型缺失導(dǎo)致男性不育的機(jī)制可能與DAZ3/DAZ4型缺失有關(guān),而gr/gr缺失影響男性生育力的證據(jù)缺乏,但也有研究表明gr/gr缺失為生精異常的高風(fēng)險(xiǎn)因子[12]。有關(guān)AZFc區(qū)缺失類(lèi)型及不同類(lèi)型的缺失機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,男性不育的病因復(fù)雜,遺傳學(xué)致病因素與男性不育關(guān)系密切,其中染色體核型異常和AZF基因微缺失是主要影響因素,Y染色體AZFc區(qū)b2/b3缺失可能是男性不育的高風(fēng)險(xiǎn)因子。對(duì)男性不育癥人群進(jìn)行細(xì)胞與分子遺傳學(xué)技術(shù)聯(lián)合診斷有助于指導(dǎo)臨床優(yōu)生并避免輔助生殖技術(shù)引起遺傳效應(yīng)。