孟根烏蘇-18味丸對銀屑病樣小鼠模型治療的機制研究 *

白 爽, 圖門烏力吉, 楊東生, 衛(wèi) 瑋, 呂新翔

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科,內(nèi)蒙古呼和浩特010050; 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院蒙醫(yī)科)

1 材料與方法

1.1實驗動物

選取6～8wk雌性balb/c小鼠(購買于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物中心)。飼養(yǎng)于恒溫恒濕的SPF級別動物實驗室,自由給水、取食。

1.2主要試驗材料與儀器

孟根烏蘇-18味丸購買于內(nèi)蒙古呼和浩特市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院(生產(chǎn)批號:20160003),咪喹莫特乳膏(四川明欣利迪藥業(yè)),HE染色液(上海碧云d生物技術(shù)有限公司)。切片機(上海徠卡儀器有限公司)、包埋機(湖北泰維科技實業(yè)有限公司)。酶標儀(BioTek,ELx800)、Mouse IL-17Precoated ELISA kit(DAKEWE Cat3∶1211702),生物顯微鏡(OLYMPUS CX41),組織勻漿機(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司,MY-20)。

1.3實驗方案及分組

實驗分為2組,分別為對照組及治療組,每組15只小鼠。所有小鼠均于實驗前1d麻醉后背部剃毛。將咪喹莫特乳膏外涂所有小鼠的背部(62.5mg/鼠),藥時間為持續(xù)21d。第8～21d治療組小鼠給予孟根烏蘇-18味丸灌胃(0.66g/kg),實驗組小鼠給以等量生理鹽水灌胃。每d觀察各組小鼠的背部皮損狀況(包括紅斑、鱗屑、皮膚厚度)。

1.4實驗方法

1.4.1組織學(xué)檢查 常規(guī)固定、脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色。

11月6日，證監(jiān)會正式發(fā)布《關(guān)于完善上市公司股票停復(fù)牌制度的指導(dǎo)意見》（下稱《指導(dǎo)意見》）?！吨笇?dǎo)意見》首次明確了上市公司股票停復(fù)牌的基本原則，最大限度保障交易機會。明確以不停牌為原則、停牌為例外，短期停牌為原則、長期停牌為例外，間斷性停牌為原則、連續(xù)性停牌為例外。上市公司發(fā)生重大事項，應(yīng)當按照及時披露的原則，分階段披露有關(guān)事項的具體情況，不得以相關(guān)事項不確定為由隨意申請股票停牌，不得以申請股票停牌代替相關(guān)各方的保密義務(wù)。

1.4.2表皮厚度及真皮內(nèi)炎細胞浸潤數(shù)的測量 采用PhotoshopCS4軟件自帶的套索工具進行表皮厚度的測量及真皮內(nèi)炎細胞浸潤數(shù)的測量

1.4.3小鼠脾指數(shù)及淋巴結(jié)橫截面積計算 小鼠脾指數(shù)為小鼠脾臟重量與小鼠全身體重的比值。每只小鼠取4枚淋巴結(jié),近似認為小鼠淋巴結(jié)為橢圓形,按照橢圓形面積公式計算小鼠淋巴結(jié)橫截面積。

1.4.4皮膚組織勻漿的制備 將分裝的皮膚組織置于d平上稱重并記錄。1×PBS快速漂洗后將皮膚組織置于1.5mL的EP管中,加入預(yù)冷的1×PBS。統(tǒng)一制成5%的組織勻漿。使用組織勻漿機在冰上研磨小鼠皮膚,離心(12000g,10min,4℃),吸取上清置于新的EP管中,并置于冰上用于ELISA檢測。

1.4.5小鼠麻醉后采血,室溫靜置20min。采用離心法獲取血清,(5000rcf,15min,24℃)分裝血清并及時儲存于-80℃冰箱。

1.4.6酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 按試劑盒操作說明進行加樣,加檢測抗體,洗板,加酶,洗板,顯色,終止反應(yīng),讀板。用檢測波長450nm讀值。

2 結(jié)果

2.1組織學(xué)改變

兩組小鼠組織學(xué)均表現(xiàn)為角化過度、角化不全,表皮增厚,表皮突延長,真皮內(nèi)炎細胞的浸潤。與對照組相比,治療組小鼠表皮厚度明顯降低(*P<0.05),炎細胞浸潤數(shù)明顯減少(**P<0.01)(如圖1、2)。

2.2與對照組相比,治療組小鼠脾臟明顯縮小,脾指數(shù)及淋巴結(jié)橫截面積明顯下降(*P<0.05)(如圖3、4)。

2.3皮損中IL-17的含量

與對照組相比,治療組小鼠皮損中IL-17含量明顯降低(*P<0.05)(如圖5)。

2.4血清中IL-17的含量

我們沒有檢測到兩組小鼠血清中IL-17的含量。

3 討論

銀屑病屬于蒙醫(yī)皮膚黃水(協(xié)日烏素)病,蒙醫(yī)對于銀屑病的治療主要以調(diào)理三根,改善氣血運行,燥協(xié)日烏素(黃水)為主要原則[2]。孟根烏蘇-18味丸是經(jīng)典的蒙藥學(xué)方劑,由孟根烏蘇(制)八錢、硫磺(制)四錢、文冠木膏劑等十八味藥配制而成,該藥載入1984年版《內(nèi)蒙古蒙成藥標準》[3]。孟根烏蘇-18味丸主要具有燥黃水,消炎止痛,促進創(chuàng)口愈合,修復(fù)組織等功效。在皮膚病的治療占到其臨床應(yīng)用的76.23%,主要包括:銀屑病、痤瘡等炎癥性皮膚病[3,4]。本研究將蒙醫(yī)藥學(xué)與免疫學(xué)、皮膚病學(xué)相結(jié)合,探索性研究蒙藥孟根烏蘇-18味丸對銀屑病的治療效果及機制。

小鼠背部外涂咪喹莫特可以成功的誘導(dǎo)出與人類銀屑病模型,這種模型在病理學(xué)、發(fā)病機制中均表現(xiàn)出與人類銀屑病相一致的特點[5]。我們利用此模型為實驗對象,結(jié)果顯示,與對照組相比,治療組小鼠表皮厚度及真皮內(nèi)炎細胞浸潤數(shù)均減少,這從組織病理學(xué)角度表明孟根烏蘇-18味丸能夠減輕銀屑病樣小鼠模型的癥狀,干預(yù)銀屑病發(fā)病。

脾臟是免疫細胞定居的主要場所之一,同時也是機體進行免疫應(yīng)答的重要部位[6],脾指數(shù)可以衡量藥物對免疫器官的抑制作用[7]。我們的研究中,治療組的脾指數(shù)、淋巴結(jié)大小與對照組相比明顯下降,可見孟根烏蘇-18味丸能夠干預(yù)銀屑病樣小鼠模型的免疫應(yīng)答,降低脾臟及淋巴結(jié)內(nèi)異常增殖的免疫細胞的數(shù)量,進而抑制銀屑病樣小鼠模型的炎癥通路及免疫反應(yīng)。

Th17是一類新型的Th細胞群,分泌白細胞介素17(interleukin6,IL-17)等多種細胞因子。新近理論認為,Th17在銀屑病發(fā)病過程中起著主導(dǎo)作用[9]。Th17相關(guān)炎癥信號通路在銀屑病的發(fā)病過程中起著重要的致病作用。在我們的實驗中,治療組小鼠皮損中IL-17的含量明顯低于對照組,這表明孟根烏蘇-18味丸通過下調(diào)皮損中IL-17的表達而起到對銀屑病的治療,進而我們認為孟根烏蘇-18味丸通過干預(yù)Th17信號通路達到對銀屑病的治療作用。我們沒有檢測到兩組小鼠血清中IL-17的含量,這可能是由于小鼠血清中IL-17含量少,低于檢測下限而造成的。

綜上,蒙藥孟根烏蘇-18味丸通過降低銀屑病樣小鼠模型表皮厚度、真皮內(nèi)炎細胞浸潤數(shù)及降低脾指數(shù)、淋巴結(jié)橫截面面積及干預(yù)Th17相關(guān)炎癥因子的表達對銀屑病發(fā)揮治療作用。