半乳糖凝集素-3表達對心力衰竭大鼠的影響

石 賀，夏 雪，信業(yè)久，顧 明

(北華大學附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

我國冠心病的發(fā)病率逐年增加，已成為患者死亡的主要原因.隨著PCI技術日益成熟，急性心肌梗死(AMI)的死亡率顯著下降，由于AMI后導致缺血性心肌病發(fā)病率增高，因此，缺血性心肌病已成為人們關注的焦點.有研究[1]發(fā)現：半乳糖凝集素-3(Gal-3)參與了冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展，是冠心病發(fā)生與進展的特異性標志物；異丙基腎上腺素能夠迅速提升大鼠體內兒茶酚胺水平，引發(fā)心肌缺血、缺氧.本實驗首先建立了異丙基腎上腺素致大鼠心肌組織損傷模型，通過光學顯微鏡觀察損傷心肌組織的形態(tài)學變化，測定大鼠血清腦尿鈉肽(Brain natriuretic peptide，BNP)表達水平以及Gal-3蛋白表達水平，以探討Gal-3蛋白表達在心力衰竭發(fā)生和發(fā)展中的作用.

1 材料和方法

1.1 研究對象

20只雄性Wistar大鼠(北華大學生命科學研究中心)，體質量180～200 g，室溫18～20 ℃，食水任意攝取.

1.2 研究方法

將20只雄性Wistar大鼠隨機分為異丙基腎上腺素組和對照組，每組10只.異丙基腎上腺素組：腹腔注射異丙基腎上腺素 5.0 mg/kg，1次/d，連續(xù)2 d；對照組：腹腔注射等劑量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)2 d.第14天處死大鼠，取材.

光學顯微鏡視野下(×400)隨機選取5個區(qū)域，計數各區(qū)域的心肌細胞總數、纖維化的心肌細胞數，計算心肌纖維化面積.使用乙醚將大鼠麻醉，抽取腹主動脈血液，4 000 r/min離心，制備血清.使用Elisa試劑盒測定BNP；應用Western blot檢測Gal-3蛋白表達，提取心肌組織總蛋白，測定蛋白濃度.取75 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將目標蛋白濕法轉至PVDF膜，滴加一抗，兔抗人Gal-3單克隆抗體(1∶500稀釋)，4 ℃過夜；次日滴加山羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)，室溫震蕩1 h.DAB顯色后用去離子水清洗，在干燥環(huán)境下保存，并在數字成像儀上顯示各條帶灰度值.

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 大鼠心肌組織病理變化情況分析

異丙基腎上腺素處理組大鼠心肌成纖維細胞明顯增生，膠原蛋白聚集率增加，蛋白沉積增多，Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白比例明顯提高，且排列紊亂，而對照組無明顯改變.異丙基腎上腺素處理組心肌纖維化面積明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05).見表1、圖1.

2.2 兩組大鼠血清BNP的測定

與對照組比較，異丙基腎上腺素組血清中BNP升高(P<0.05)，表明經異丙基腎上腺素處理后，大鼠的心力衰竭程度嚴重.見表2.

表1 兩組大鼠心肌纖維化面積比例Tab.1 Myocardial fibrosis area proportion of two groups

表2 大鼠血清BNP的測定結果Tab.2 BNP test results of rat serum

2.3 兩組大鼠心肌組織Gal-3蛋白表達水平

與對照組比較，異丙基腎上腺素組Gal-3蛋白表達水平明顯提高，差異具有統計學意義(P<0.05)，表明異丙基腎上腺素致大鼠心肌損傷后，Gal-3蛋白表達水平明顯提高.見圖2、表3.

表3 兩組心肌組織Gal-3蛋白表達水平Tab.3 Gal-3 protein expression level between two groups

3 討 論

血清腦尿鈉肽(BNP)是由心肌細胞合成的具有生物學活性的天然激素，主要在心室中表達，同時也存在于腦組織中，其合成和釋放后心室容量負荷或者壓力負荷影響異丙基腎上腺素與心肌細胞的β受體結合，促使心率加快，心肌收縮力增強.當心率過快時心室舒張期明顯縮短，心室血液充盈量和搏出量明顯減少，心血液輸出量下降，最終導致心力衰竭.在臨床實驗[1]中也發(fā)現：心力衰竭患者血清中Gal-3蛋白的表達上升，并且Gal-3蛋白的表達水平還與反應心力衰竭嚴重程度的指標相關，包括紐約心功能分級(心力衰竭的一種分級方法)、BNP等[2]，高水平的Gal-3可能提示心力衰竭患者的預后不良[3].此外，CALVIER等[4]研究顯示Gal-3可引起心肌纖維化和心力衰竭.還有研究[5-6]顯示高濃度的Gal-3與患者的心力衰竭程度及心肌纖維化有關.張躍華等[7]研究發(fā)現：如果血清Gal-3濃度開始升高，預示心功能也在逐漸惡化.也有研究[8]發(fā)現：Gal-3水平是心力衰竭預后的獨立預測指標，尤其是左心室射血分數正常的心力衰竭患者.LOK等[9]發(fā)現：Gal-3 是預測中、重度充血性心衰患者死亡率的獨立因素.

本實驗結果顯示：通過異丙基腎上腺素誘導心肌損傷后大鼠的Gal-3蛋白表達升高，血清中的BNP水平也隨之升高，說明當心肌損傷時，引起心肌組織中的半乳糖凝集素-3(Gal-3)蛋白高水平表達，高水平表達的Gal-3蛋白啟動并誘導心功能不全，在心力衰竭中發(fā)揮著重要作用.由此推測，Gal-3蛋白參與心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，并在一定程度上能夠反映心力衰竭的進展程度.

有研究[10]發(fā)現：Gal-3蛋白能夠通過激活細胞中的細胞周期蛋白D1，活化對應蛋白激酶的抑制狀態(tài)，激活成纖維細胞.胞外基質是由膠原蛋白、纖維連接蛋白等多種活性蛋白共同構成的空間結構，其中以Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白為主，在維持心肌信號傳導狀態(tài)中發(fā)揮關鍵作用.Ⅰ型膠原蛋白為彈性蛋白纖維，Ⅲ型膠原蛋白不穩(wěn)定，彈性張力較低.有研究[11]顯示：在健康小鼠心包中注入Gal-3蛋白后，能夠有效促進Ⅰ型膠原蛋白產生，其作用強度是Ⅲ型膠原蛋白的3倍，可引發(fā)心肌組織和細胞的增生與僵化，導致心力衰竭.進一步使用基因修飾技術將Gal-3基因敲除后，可抑制心力衰竭小鼠的病情發(fā)展，且作用效果與Gal-3蛋白特異性阻斷劑N-乙?；樘且恢?同時Gal-3蛋白可抑制細胞外基質蛋白降解，促進心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展.

本研究結果顯示：在某種程度上，Gal-3蛋白及BNP表達水平可作為判斷心肌損傷預后的指標，對臨床判斷心肌損傷患者預后有很大幫助.