利用小RNA深度測序技術鑒定上海地區(qū)‘紅美人’柑橘病毒種類

張麗勍 管麗琴 蔣飛 方獻平 李水根 張學英

摘要 ：為明確上海地區(qū)‘紅美人’柑橘的病毒種類，2020年4月在崇明、金山、奉賢、嘉定、閔行和浦東采集疑似病毒感染的葉片樣品11份，采用小RNA深度測序技術結合RT-PCR對不同來源的混合樣品進行病毒種類鑒定。結果表明，樣品中含有柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus（CTV）、柑橘黃化脈明病毒Citrus yellow vein clearing virus（CYVCV）、柑橘樹皮裂紋類病毒Citrus bark cracking viroid（CBCVd）和柑橘類病毒Ⅴ Citrus viroid V（CVd-Ⅴ）。同時發(fā)現(xiàn)，上海地區(qū)‘紅美人’柑橘病毒復合侵染現(xiàn)象普遍。基于CTV和CYVCV的CP全長基因及CBCVd和CVd-Ⅴ全基因組序列系統(tǒng)進化分析結果表明：除了CYVCV的分離物與地理來源具有明顯的相關性外，其余病毒及類病毒均沒有嚴格的地域相關性。研究結果為開展‘紅美人’柑橘種苗病毒檢測及病毒病的防治奠定基礎。

關鍵詞 ：柑橘; 小RNA深度測序; 病毒鑒定

中圖分類號：

S 436.66

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020448

Identification of the viruses from Hongmeiren citrus in Shanghai by small RNA sequencing

ZHANG Liqing1，2#， GUAN Liqin3#， JIANG Fei4， FANG Xianping1，2， LI Shuigen1，2， ZHANG Xueying1，2*

（1.Forest & Fruit Research Institute， Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 201403， China;

2.Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology， Shanghai 201403， China;

3.Shanghai Jiading District Agricultural Technology Extension Service Center， Shanghai 201800， China;

4. Shanghai Citrus Research Institute， Shanghai 201913， China）

Abstract

To identify the viruses and viroids from ‘Hongmeiren’ citrus in Shanghai， 11 citrus leaf samples with the virus-like symptoms were collected from the districts of Chongming， Jinshan， Fengxian， Jiading， Minhang and Pudong in April， 2020.The samples were analyzed by small RNA deep sequencing.The results showed that Citrus tristeza virus （CTV）， Citrus yellow vein clearing virus （CYVCV）， Citrus bark cracking viroid （CBCVd） and Citrus viroid V （CVd-Ⅴ） were detected in the samples by small RNA sequencing， which were confirmed by RT-PCR.The mixed infection of viruses/viroids was common in ‘Hongmeiren’ citrus.Phylogenetic analysis was conducted based on the full-length CP gene sequences of CTV and CYVCV， and the full-length genome sequences of CBCVd and CVd-Ⅴ， respectively.The results revealed that only CYVCV showed an obvious correlation with geographical origin.The study laid a foundation for the development of viral diagnosis and prevention in ‘Hongmeiren’ citrus seedlings.

Key words

citrus; small RNA sequencing; virus identification

柑橘是我國的重要經濟作物，栽培主要采用無性繁殖的方法，在田間極易感染病毒類病害[1]。柑橘病毒類病害是柑橘病毒病和類似病毒病害（類病毒等）的統(tǒng)稱[2]。目前，我國從柑橘上鑒定出的病毒主要有：柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus（CTV）、柑橘黃化脈明病毒Citrus yellow vein clearing virus （CYVCV）、柑橘碎葉病毒Citrus tatter leaf virus （CTLV）等[3];類病毒有8種：柑橘裂皮類病毒Citrus exocortis viroid （CEVd）、柑橘曲葉類病毒Citrus bent leaf viroid （CBLVd）、啤酒花矮化類病毒Hop stunt viroid （HSVd）、柑橘矮化類病毒Citrus dwarfing viroid （CDVd）、柑橘樹皮裂紋類病毒Citrus bark cracking viroid （CBCVd）（曾用名Citrus viroid Ⅳ，CVd-Ⅳ）、柑橘類病毒Ⅴ Citrus viroid Ⅴ （CVd-Ⅴ）、柑橘類病毒Ⅵ Citrus viroid Ⅵ （CVd-Ⅵ）和柑橘類病毒Ⅶ Citrus viroid Ⅶ，（CVd-Ⅶ）[47]。

‘紅美人’（又名‘愛媛28’），是從日本引進的橘橙類雜交品種，由‘南香’（母本）和‘天草’（父本）雜交而成。該品種有甜橙香氣，果面橙紅色，果肉柔軟多汁，深受消費者喜愛[8]。近兩年因其品質優(yōu)良，在上海柑橘產區(qū)發(fā)展較快。但是在生產上也出現(xiàn)了一些問題，調查發(fā)現(xiàn)，目前‘紅美人’柑橘種苗市場魚龍混雜，種苗疏于管理，極易導致病毒類病害的發(fā)生。小RNA測序技術（small RNA sequencing， sRNA-seq）于2009年開始出現(xiàn)，該技術可獲得病毒的大量 sRNA序列，經生物信息學分析能高效鑒定病毒種類，易于發(fā)現(xiàn)新病毒或新分離物，且可同時鑒定多種RNA或DNA病毒，已被廣泛應用于植物病毒檢測[9]。本研究采用小RNA測序技術結合RT-PCR方法對樣品進行檢測，初步明確了侵染上海地區(qū)‘紅美人’柑橘的主要病毒種類及其復合侵染的情況，研究結果可為后續(xù)開展‘紅美人’柑橘種苗病毒檢測及病毒病的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

‘紅美人’柑橘病葉于2020年采自上海‘紅美人’柑橘主栽區(qū)崇明、金山、奉賢、嘉定、閔行和浦東6區(qū)共11份樣品，采集信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 小RNA深度測序與生物信息學分析

將表1中疑似病毒病癥狀葉片混樣，分為CT1樣品（編號C1～C4）、CT2樣品（編號C5～C7）和CT3樣品（編號C8～C11）（表 1）。利用TRIzol Reagent（Invitrogen）提取葉片總RNA，采用TruseqTM Small RNA Sample Prep Kit（Illumina）構建3個cDNA文庫。Hiseq2000測序平臺進行深度測序。建庫和測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行。

生物信息學分析：采用Fastx-Toolkit軟件對原始數(shù)據進行質量控制，獲得clean reads用于序列拼接組裝，通過從頭組裝生成重疊群（contig）和單一序列（singleton），將拼接結果與病毒數(shù)據庫（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/）進行BLASTn比對，將得到的病毒序列進行統(tǒng)計并注釋。

1.2.2 柑橘病毒的RT-PCR檢測

根據小RNA測序分析得到的結果，選取豐度較高的10種病毒及類病毒（表2），采用One Step RT-PCR Kit（TaKaRa）進行RT-PCR擴增，引物序列及反應條件見表2。RT-PCR擴增產物回收并克隆至pMD19-T載體上，選取陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 CTV和CYVCV病毒CP基因克隆及系統(tǒng)發(fā)育分析

設計并合成引物CTV-CP-F/CTV-CP-R和CYVCV-CP-F/CYVCV-CP-R，分別擴增CTV和CYVCV的CP基因開放閱讀框（open reading frame，ORF），引物序列及反應條件見表2。RT-PCR擴增、產物克隆測序參照1.2.2。利用MEGA 7.0.26軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）分別對CTV和CYVCV的分離物（表3）進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，bootstrap值設置為1 000。

1.2.4 CBCVd和CVd-Ⅴ系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 7.0.26軟件中的鄰接法對1.2.2中RT-PCR得到的CBCVd和CVd-Ⅴ全長序列分別進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，方法參照1.2.3。

2 結果與分析

2.1 小RNA測序結果

3個混合樣本CT1（編號C1～C4）、CT2（編號C5～C7）和CT3（編號C8～C11）分別獲得22 727 867、25 438 222個和22 963 772個原始序列（raw reads），對raw reads進行質控，包括去除reads中的接頭序列及由于接頭自連等原因導致沒有插入片段的reads等，3個混合樣本分別獲得clean reads 19 260 326、22 346 222個和20 566 427個，其長度分布見圖1。其中，3個混合樣本中長度為21 nt小RNA的clean reads所占比例最高，分別為26.00%、32.07%和31.20%。

提取長度為18～32 nt的序列進行拼接組裝，拼接結果分別與植物病毒數(shù)據庫進行比對，將得到的病毒序列進行統(tǒng)計并注釋，結果如下：混合樣本CT1得到5 642個contigs，包含349 885 bp，平均每個contig長62 bp，最長的contig為1 234 bp，GC含量為51.66%。其中165個contigs可以比對到8種病毒及類病毒（表3）;CT2得到5 691個contigs，包含360 490 bp，平均每個contig長63 bp，最長的contig為1 207 bp，GC含量為49.03%。其中166個contigs可以比對到8種病毒及類病毒（表3）;CT3得到6 726個contigs，包含441 185 bp，平均每個contig長66 bp，最長的contig為1 249 bp，GC含量為50.92%。219個contigs 可以比對到10種病毒及類病毒（表3）。

2.2 RT-PCR驗證

為了驗證小RNA深度測序結果的可靠性，對C1～C11號樣品中的10種豐度較高的病毒及類病毒進行RT-PCR檢測，對擴增到的特異性條帶進行測序及進一步分析。結果表明：C1～C11號樣品中共可檢測出兩種病毒及兩種類病毒：CTV、CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ（圖2）。其中樣品C1僅檢測出CTV;樣品C5同時檢測出CTV、CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;樣品C8同時檢測出CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;樣品C9同時檢測出CTV和CBCVd;樣品C10同時檢測出CYVCV和CBCVd（圖2）。病毒及類病毒的檢出率分別為27.3%（CTV）、18.2%（CYVCV）、36.4%（CBCVd）、27.3%（CVd-Ⅴ）。

RT-PCR產物測序發(fā)現(xiàn)：各樣品中同種病毒或類病毒的擴增產物序列完全一致，樣品中CTV序列與CTV-BaraoB-6（EU579362）外殼蛋白（coat protein，CP）基因序列一致性為99.4%，將侵染上?！t美人’柑橘的CTV命名為CTV-SH01;樣品中CYVCV序列與CYVCV-YN-EL（KX156751）CP基因序列一致性為99.5%，將侵染上?！t美人’柑橘的CYVCV命名為CYVCV-SH01;樣品中CBCVd序列與CBCVd-C7-2（MG457786）基因組序列一致性為98.6%，將侵染上?！t美人’柑橘的CBCVd命名為CBCVd-SH01;樣品中CVd-Ⅴ序列與CVd-FE（JQ348927）基因組序列一致性為99.6%，將侵染上海‘紅美人’柑橘的CVd-Ⅴ命名為CVd-Ⅴ-SH01。其中CBCVd和CVd-Ⅴ均為環(huán)狀類病毒，通過背靠背引物擴增獲得基因組全長序列，長度分別為284 bp和293 bp，測序驗證后提交至NCBI，GenBank登錄號分別MT780548和MT780547。以上結果與小RNA測序結果中高豐度contig序列一致。混合感染結果也說明：同一份柑橘樣品能夠同時被多種病毒及類病毒感染。

2.3 CTV和CYVCV CP基因的全長擴增和系統(tǒng)進化分析

分別擴增獲得CTV-SH01和CYVCV-SH01的CP基因序列，長度分別為652 bp和978 bp（登錄號：MT780545和MT780546）。為進一步明確CTV-SH01和CYVCV-SH01與已經報道的CTV和CYVCV分離物的進化關系，分別以同屬長線病毒科Closteroviridae的甜菜黃化病毒Beet yellows virus和甲型線狀病毒科Alphaflexiviridae的印度柑橘環(huán)斑病毒Indian citrus ringspot virus為外群構建了CTV和CYVCV的系統(tǒng)進化樹。

結果表明：CTV-SH01分離物與美國T36（U16304）和埃及Qaha（AY340974）CTV分離物聚為一簇，親緣關系較近?？傮w而言，沒有嚴格的地域相關性（圖3a）。CYVCV-SH01分離物與浙江分離物ZJ-4（KY933797）和ZJ-1（KY933794）聚為一小簇，與中國其他各地區(qū)分離物聚為一大簇，這些地區(qū)包括湖南、廣東、重慶、四川，云南，浙江、江西等，其他國家包括印度和土耳其的分離物聚為另一大簇。因此，CYVCV的分離物具有明顯的地域特異性（圖3b）。

2.4 CBCVd和CVd-Ⅴ全基因組的系統(tǒng)進化分析

以蘋果銹果類病毒屬Apscaviroid的蘋果銹果類病毒Apple scar skin viroid作為外群，構建了CBCVd和CVd-Ⅴ的基因組進化樹。

對CBCVd的進化樹分析結果表明，上海地區(qū)‘紅美人’柑橘上的分離物（CBCVd-SH01）和古巴分離物Cu39（AJ630360）及日本分離物LE（AB054633）聚為一小簇，與其他國家如塞浦路斯、希臘、南非等國家以及中國其他地區(qū)分離物親緣關系也較近，而與巴基斯坦的兩株分離物親緣關系最遠（圖3c）。

對CVd-Ⅴ的進化樹分析結果表明：上海地區(qū)‘紅美人’柑橘上的分離物CVd-Ⅴ-SH01與巴基斯坦兩株分離物AL（JQ348931）和JK2（JQ348933）聚為一小簇，與中國其他地區(qū)分離物，例如浙江、重慶和湖南的分離物親緣關系較遠，與澳大利亞的兩株分離物親緣關系最遠（圖3d）?？傮w而言，基于全基因組的進化樹分析結果表明：兩種柑橘類病毒沒有明顯的地域特異性。

3 討論

本研究利用小RNA深度測序技術對采自上海崇明、金山、奉賢、嘉定、閔行和浦東的‘紅美人’柑橘葉片樣品進行檢測，通過提取葉片總RNA、構建小RNA文庫并進行測序，生物信息學分析結合RT-PCR驗證，明確了樣品中存在CTV和CYVCV兩種病毒及CVd-Ⅴ和CBCVd 兩種類病毒。

CTV屬長線病毒屬Closterovirus，其引起的柑橘衰退病已經在全世界許多地區(qū)造成數(shù)百萬棵柑橘樹死亡[16]。柑橘屬多數(shù)植物可被CTV侵染。不同柑橘產區(qū)分離的CTV分離物在致病性上有一定差異[17]。我國主要發(fā)生在中部和南部的柑橘屬植物上[18]。不同的CTV株系可引起3種不同類型的癥狀：速衰型、莖陷點型和苗黃型[19]。本研究中主要采集的為葉片樣品，C1、C5和C9樣品中檢測到CTV，葉片呈現(xiàn)黃化特征，根據癥狀可初步判定為苗黃型。CYVCV為印度柑橘病毒屬Mandarivirus成員，我國于2009年首次發(fā)現(xiàn)[12]，其寄主范圍較為廣泛，可危害檸檬、酸橙及一些寬皮柑橘品種[20]。張艷慧等首次在浙江‘紅美人’柑橘上檢測出CYVCV，并且在這些植株中未檢測到其他柑橘病毒[21]。CYVCV引起的癥狀主要為葉片卷曲黃化，后期葉片下卷、皺縮、畸形甚至嫩葉脫落，導致樹勢減弱[22]。本研究通過小RNA深度測序結合PCR驗證證實C5，C8和C10樣品中能夠檢測到CYVCV，且3份樣品均表現(xiàn)明顯的卷曲黃化，葉片皺縮，畸形和樹勢減弱的癥狀，這與已報道的CYVCV在易感品種上的癥狀一致，一方面證實鑒定結果準確，另一方面說明“紅美人”柑橘也是CYVCV的易感品種之一。CTV和CYVCV傳播途徑相似，均可通過媒介昆蟲和嫁接進行傳播。本研究在上海地區(qū)‘紅美人’柑橘葉片樣品中同時檢測出CTV和CYVCV，同時還檢測到兩種柑橘類病毒。劉惠芳研究發(fā)現(xiàn)CYVCV的群體進化關系與地理來源具有相關性，與寄主及品種相關性不明顯[23]。本研究構建的CYVCV系統(tǒng)進化樹結果顯示，CYVCV的分離物具有明顯的地域特異性，CYVCV-SH01分離物與浙江分離物聚為一小簇，與中國其他各地區(qū)分離物聚為一大簇。

CBCVd也稱為柑橘類病毒IV（CVd-IV），屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科Pospiviroidae椰子死亡類病毒屬Cocadviroid[24]。CVd-Ⅴ屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科蘋果銹果類病毒屬[7]。由于柑橘育苗多采用嫁接技術，在田間長期無性繁殖過程中往往存在類病毒混合侵染現(xiàn)象[25]，且由于柑橘類病毒復合侵染可能會產生協(xié)同效應，往往會使癥狀加重。將CVd-Ⅴ與CBLVd 或CVd-Ⅲ共同接種至指示植物‘Etrog’香櫞上時，葉片癥狀更加明顯，且植株出現(xiàn)明顯的矮化現(xiàn)象[26]。柑橘類病毒與病毒也可互作產生協(xié)同作用，Lu等報道CTV與CDVd共侵染后有利于CDVd復制[26]。與CYVCV和CTV相比，CBCVd和CVd-Ⅴ等柑橘類病毒侵染許多柑橘屬植物和柑橘近屬植物時，并不引起明顯癥狀[25]，但復合侵染時可能導致癥狀加劇，本研究中能檢測到CBCVd、CVd-Ⅴ和CYVCV、CTV的復合侵染，這種復合侵染是否導致癥狀的加劇還有待進一步驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)，柑橘病毒和類病毒復合侵染在上海‘紅美人’柑橘種植區(qū)發(fā)生普遍，樣品C5同時檢測出CTV、CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;樣品C8同時檢測出CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;樣品C9同時檢測出CTV和CBCVd;樣品C10同時檢測出CYVCV和CBCVd，這些結果說明柑橘病毒和類病毒混合感染的情況較為普遍，這些病毒與類病毒之間是否具有協(xié)同效應等相關機制需進一步研究。為保障上海地區(qū)‘紅美人’柑橘產業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，需加強種苗病毒檢測，重視種苗質量的監(jiān)督和管理，保障種苗來源。

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（責任編輯：楊明麗）