兩類抗生素藥劑對‘紐荷爾’臍橙黃龍病菌的抑制作用及根際細菌群落結構的影響

黃洋 關巍 王鐵霖 晏建紅 田二淵 劉堰鳳 劉博 楊玉文 趙廷昌

摘要 ：為探究磺胺二甲氧嘧啶鈉鹽（sulfadimethoxine sodium salt，SDM）和氨芐青霉素（ampicillin，AMP）對柑橘黃龍?。╟itrus Huanglongbing，HLB）的防效以及對柑橘根際細菌群落結構的影響，本試驗以‘紐荷爾’臍橙為研究對象，采用0.5 g/L SDM和1 g/L AMP進行灌根，使用TaqMan qPCR技術監(jiān)測病樹葉內黃龍病菌菌量的動態(tài)變化，并利用宏基因組技術分析根際細菌群落結構的變化。結果顯示，AMP連續(xù)處理后病樹葉片內黃龍病菌菌含量在一定程度上受到抑制，初步判斷AMP對黃龍病有一定的抑制效果，SDM處理對黃龍病菌菌含量抑制效果較差;2類抗生素處理組中根際主要優(yōu)勢類群結構和相對豐度在門、屬分類水平上均發(fā)生改變，解磷細菌中慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium細菌的相對豐度在處理后有明顯變化，pstA、pstC等部分磷循環(huán)功能基因相對豐度發(fā)生改變，表明2類抗生素藥劑均影響了‘紐荷爾’臍橙病樹根際細菌群落結構。

關鍵詞 ：柑橘黃龍病; 根際細菌; 宏基因組; 抗生素; 抑制作用

中圖分類號：

S 436.66

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020219

Effects of two antibiotics on pathogen causing Huanglongbing of ‘newhall’ navel orange and the community structure of rhizosphere bacteria

HUANG Yang1#， GUAN Wei1#， WANG Tielin2， YAN Jianhong1， TIAN Eryuan1，

LIU Yanfeng1， LIU Bo1， YANG Yuwen1， ZHAO Tingchang1*

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of plant protection， Chinese Academy

of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 2. State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs， National

Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

Abstract

In order to investigate the control effects of sulfadimethoxine sodium salt （SDM） and ampicillin （AMP） on citrus Huanglongbing （HLB） and the effects of these two chemical agents on the citrus rhizosphere bacteria， the dynamic changes of the quantity of Candidatus Liberibacter asiaticus （CLas） in the leaves of ‘newhall’ navel orange was monitored by using TaqMan qPCR detection technology， and the changes of the bacterial community structure in rhizosphere soil was analyzed by using metagenomic technology. The results showed that the quantity of CLas in the leaves of diseased tree was lower than initial bacteria after root irrigation with 1 g/L AMP， indicating that AMP can suppressed content of the CLas in HLB-infected citrus plants， while the control effect was poor after root irrigation with 0.5 g/L SDM. The structure and relative abundance of the dominant rhizosphere bacteria were changed at the levels of phylum and genus. The relative abundance of Bradyrhizobium with phosphorus-dissolving ability and some phosphorous cycle-related functional genes such as pstA and pstC were changed after treatment with AMP and SDM. It suggested that both antibiotics affected the community structure of the rhizosphere bacteria in ‘newhall’ navel orange.

Key words

citrus Huanglongbing; rhizosphere bacteria; metagenome; antibiotic; inhibition effect

柑橘黃龍病是目前柑橘產業(yè)面臨的一種最嚴重的病害，給柑橘產業(yè)造成了巨大的經濟損失。黃龍病菌以木虱為傳播媒介，可侵染蕓香科Rutaceae植物如甜橙Citrus sinensis、柚Citrus maxima等多種植物[12]。柑橘黃龍病菌主要分為亞洲種、非洲種和美洲種，擴散最廣的是亞洲種Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）。目前，黃龍病防控手段仍然以“三板斧”為主，即使用無毒苗木，及時鏟除病樹和防控木虱[3]。黃龍病菌是革蘭氏陰性細菌，施用廣譜性的細菌抗生素可有效控制黃龍病病情發(fā)展。田間和溫室條件下的抗生素防治試驗結果表明無論是向樹干注射或浸根，都能在一定程度上控制病原菌[46]。因此藥劑防治成了目前在“三板斧”之外防控黃龍病的一個有效手段。

根際土壤微生物對植物健康具有重要作用，其可以通過產生抗生素、調節(jié)激素水平等拮抗作用與營養(yǎng)競爭的方式阻止病原菌侵入植物，還可以幫助植物完成物質循環(huán)，其中參于磷循環(huán)的微生物可以將有機磷轉化為無機磷，明顯提高土壤中可溶性磷含量，進而提高植株抗旱、抗寒和抗病等能力[712]。研究表明，黃龍病菌侵染柑橘后會優(yōu)先定殖在根部，可能與根際微生物存在一定的聯(lián)系[13]。因此開展患黃龍病的柑橘根際細菌群落結構的研究具有重要意義。

為明確氨芐青霉素（ampicillin，AMP）和磺胺二甲氧嘧啶鈉鹽（sulfadimethoxine sodium salt，SDM）灌根對柑橘黃龍病菌的抑制效果，本研究選取江西省贛州市柑橘科學研究所內嚴格防控木虱的臍橙果園，采取灌根方式連續(xù)多次施入AMP和SDM，采用TaqMan qPCR定量檢測技術評價藥劑對樹體內黃龍病菌的抑制效果，同時基于宏基因組測序技術分析根際土壤細菌群落結構的變化，旨在了解藥劑處理對帶菌臍橙根際細菌群落結構的影響，同時進一步揭示菌群的動態(tài)變化，為解析藥劑對柑橘黃龍病的作用機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與供試植物

試驗地位于江西省贛州市柑橘科學研究所。供試植物包括健康和患黃龍病的‘紐荷爾’臍橙。柑橘樹在果園中的詳細坐標信息見表1。本試驗中所有患病植株均感染黃龍病5年以上。在試驗期間，果園按照當?shù)卣吖芾?，嚴格防控木虱，在病害調查和取樣期間均未發(fā)現(xiàn)木虱為害。

1.2 試驗試劑

氨芐青霉素（ampicillin，AMP）和磺胺二甲氧嘧啶鈉鹽（sulfadimethoxine sodium salt，SDM）購自中國源葉生物科技有限（上海）公司。

1.3 試驗設計

分別于2018年8、10、11、12月，2019年2、3、4、5月進行灌根處理。處理組采用0.5 g/L SDM和1 g/L AMP溶液對感染柑橘黃龍病的病樹灌根，每株1 L，每處理重復3株樹;分別設等量清水對病樹灌根對照（QHLB）和等量清水對健康樹灌根對照（QHealth）。每次灌根前在感染柑橘黃龍病的病樹樹冠東西南北4個方向各采集4～5片葉，每棵樹總共采集16～20片葉，混為1個樣品，采集過程避免樣品之間交叉污染，并于采樣后進行藥劑灌根處理。采用TaqMan qPCR檢測葉片樣品內黃龍病菌（CLas）的含量，以監(jiān)測CLas含量的動態(tài)變化。2018年8月藥劑處理前

和2019年5月藥劑處理后分別采集臍橙根際土樣品，用于分析根際細菌群落結構的變化。

1.4 葉片樣品總DNA的提取及CLas含量的檢測

取切碎后的臍橙葉中脈約20 mg裝入裂解介質管，加入500 μL PBS緩沖液（美國 GE Healthcare Life Sciences），用MP FastPrep-24 5G研磨機（美國 MP Biomedicals）研磨。采用AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep kit（美國 Axygen）提取葉片總DNA。采用TaqMan熒光定量檢測方法于QuantStudio6 Flex（美國 ABI）檢測CLas的含量?；诒緦嶒炇医⒌腡aqMan熒光定量檢測體系，用含有CLas基因片段的陽性質粒制作標準曲線，為使通過該標準曲線獲得的植物總DNA的量具有更好的可比性，將DNA濃度單位轉化為CD值（CD=模板拷貝數(shù)/總DNA濃度）作為菌含量單位[14]。引物和探針[15]由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.5 根際土樣品的采集與制備

在距離樹干基部80～120 cm處分別設置5個取樣點，用土鏟逐段逐層挖去上層覆土，沿側根找到須根部分，輕輕抖落黏附在根上的較大顆粒。將5個采集點樣品合并，裝入無菌自封袋干冰運輸。將根放入PBS緩沖液中充分攪動，反復清洗至澄清，收集濁液。將濁液過孔徑149 μm的尼龍網(wǎng)篩，濾液轉移至新的50 mL離心管中，4℃、7 830 r/min離心7 min，棄上清即得到根際土樣品，于-80℃保存?zhèn)溆谩８H土樣品委托北京諾禾致源科技股份有限公司進行宏基因組測序。

1.6 根際細菌群落的宏基因組測序

將檢測合格的根際土DNA樣品用超聲波破碎儀打斷，經末端修復、加A尾和測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成文庫制備。對文庫濃度進行準確定量并驗證文庫質量，最后按照需求進行Illumina PE150測序。質控過濾后得到有效數(shù)據(jù)（clean data），進行Metagenome組裝，完成基因預測、物種注釋、功能數(shù)據(jù)庫注釋，進一步基于物種豐度、功能豐度進行聚類分析和差異分析[1617]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

使用DIAMOND軟件將unigenes與從NCBI的NR（Version： 20141019）數(shù)據(jù)庫中篩選出的細菌序列進行比對。從各個分類層級上的豐度出發(fā)，進行物種相對豐度分析、PCA降維分析。

采用GraphPad prism 8進行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制，運用SPSS軟件進行單因素方差分析和獨立樣本t測驗分析。

2 結果與分析

2.1 藥劑灌根對臍橙植株體內黃龍病菌的抑制作用

自2018年8月至2019年5月患病植株共施用AMP和SDM 8次。每次施藥前定點定枝采集不同處理組及清水處理患HLB植株對照組（QHLB）病株的葉片，采用實時熒光定量PCR檢測臍橙葉片的帶菌量。結果顯示，AMP和SDM處理后CLas含量均有變化，但變化趨勢不同。2018年8月首次施藥后，從2018年10月至2019年3月AMP處理組植株CLas含量均低于起始帶菌量，2019年3月下降至最低（1.74×106 CD），而SDM處理組初次施藥后于2018年10月菌含量上升，2018年11月至2019年3月呈下降趨勢，2019年3月下降至1.94×106CD，除2019年3月外各監(jiān)測時期CLas含量均高于起始帶菌量。兩種藥劑處理組CLas含量均在2019年4月明顯升高，并在5月顯著降低。QHLB對照組病株葉片內CLas含量也存在一定的起伏變化，在2019年5月出現(xiàn)增長高峰，上升至1.20×107 CD，分別是AMP和SDM組的43倍和6倍（圖1）。處理前AMP組與對照組帶菌量無顯著差異，除2019年2月和4月AMP組菌含量高于對照組，其他處理時間均低于對照組且差異顯著（圖1）;根據(jù)以上結果初步判斷AMP灌根對患病臍橙植株內的CLas含量有潛在抑制效果，而SDM灌根后在初次施藥2個月后CLas含量明顯升高，雖然隨后的灌根處理有一定的抑制作用，但并不穩(wěn)定。

2.2 藥劑處理后根際細菌群落結構的變化

根際細菌是植物根際微生態(tài)的重要組成成分，直接參與植物多種代謝活動和免疫防御。本試驗對AMP和SDM處理前后的臍橙根際土壤樣品進行宏基因組測序分析，結果表明，處理后，酸桿菌門Acidobacteria和擬桿菌門Bacteroidetes相對豐度提高、放線菌門Actinobacteria相對豐度降低。主成分分析（PCA）顯示，AMP處理、SDM處理分別和患病臍橙對照組（QHLB）不存在交叉重疊，說明藥劑對根際細菌群落結構和相對豐度產生重要影響。

門水平的分析結果顯示，處理前患病臍橙根際細菌群落的主要成分是放線菌門、變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門、擬桿菌門等。處理前，健康臍橙對照組（QHealth）根際中酸桿菌門相對豐度高于患病臍橙，而變形菌門相對豐度遠低于患病臍橙。處理后，患病臍橙植株根際土壤主要優(yōu)勢類群和相對豐度發(fā)生改變。硝化螺旋菌門在抗生素處理組和QHLB對照組中的相對豐度均低于QHealth對照組。與QHLB對照相比，AMP處理和SDM處理組中放線菌門相對豐度均降低了近50%，而擬桿菌門相對豐度分別提高了0.7倍和0.3倍，SDM處理組中酸桿菌門相對豐度提高了0.5倍。另外，排名前十菌門相對豐度之和在AMP處理、SDM處理和QHLB對照和QHealth對照中分別為79%、69%、81%、80%（圖2）。以上結果說明藥劑使用影響了一部分有益微生物的相對豐度，AMP處理組物種相對豐度高于SDM處理組，SDM處理后紐荷爾臍橙根際微生物群落結構變化更大。

屬水平分析結果顯示，處理前，患HLB臍橙根際土壤中慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium、沙雷氏菌屬Serratia、假單胞菌屬Pseudomonas、戴氏菌屬Dyella細菌的相對豐度均高于健康臍橙。處理后，與QHLB對照相比，AMP處理組和SDM處理組中無色桿菌屬Achromobacter、假單胞菌屬細菌相對豐度降低，與QHealth對照組相比相對豐度相近。處理前節(jié)細菌屬Arthrobacter在各樣品組間相近，但處理后，各樣品組間節(jié)細菌屬的相對豐度增加（圖3）。

主成分分析（PCA）顯示，處理前，不同患病臍橙組的根際土壤樣品點聚集在一起，主要分布在第1、2象限，不同組間樣品點之間存在交叉重疊，而QHealth組中的樣品點聚集在特定區(qū)域，主要分布在第3象限，與患病臍橙樣品點不存在交叉重疊。藥劑灌根處理后，QHealth組根際樣品點仍聚集在特定區(qū)域，主要分布在第3和第4象限，與抗生素處理組和患病臍橙對照組（QHLB對照）不存在交叉重疊;AMP處理、SDM處理和QHLB對照組中樣品點分布在第1象限，QHLB對照與AMP和SDM處理組無交叉重疊區(qū)域，與QHealth對照組中樣品點距離較處理組更遠;AMP和SDM處理組樣品點無交叉部分。與QHLB對照組相比，AMP和SDM處理后群落結構均發(fā)生顯著變化（圖4）。

磷是植物體內重要化合物組成成分，是維持植物生長和發(fā)育的重要營養(yǎng)元素。我們對相關文獻報道的土壤中存在的已知解磷微生物進行了屬水平上的分析。處理前在臍橙病株根際土壤樣品中共檢測到9種解磷微生物，而AMP和SDM處理后，檢測到11種解磷微生物，分別屬于慢生根瘤菌屬、假單胞菌屬、戴氏菌屬、黃桿菌屬Flavobacterium、沙雷氏菌屬、節(jié)細菌屬、歐文氏菌屬Erwinia、無色桿菌屬、泛生菌屬 Pantoea、酸桿菌屬Acidobacterium、芽孢桿菌屬 Bacillus，其中酸桿菌屬、芽胞桿菌屬在處理前臍橙根際樣品中沒有檢測到。相對豐度分析發(fā)現(xiàn)，處理前各組解磷細菌相對豐度之和以慢生根瘤菌屬豐度最高、其次是戴氏菌屬、再次是假單胞菌屬。進一步分析發(fā)現(xiàn)，藥劑處理前各組間慢生根瘤菌屬相對豐度相近，但健康對照組相對豐度略低于染病組;藥劑處理后AMP處理組和SDM處理組慢生根瘤菌屬相對豐度與處理前差異顯著，而QHLB對照組與處理前差異不顯著;藥劑處理前各組間假單胞菌屬細菌的相對豐度相近;藥劑處理后，AMP處理組和SDM處理組的假單胞菌屬細菌的相對豐度與健康臍橙相近，且相對豐度較處理前差異均不顯著，而QHLB對照組中假單胞菌屬相對豐度大幅增長，極顯著高于處理前（圖5）。以上分析結果表明，藥劑可影響解磷屬微生物群落，所選的2類抗生素藥劑均可能對慢生根瘤菌屬細菌有潛在的促進作用，對假單胞菌屬細菌有抑制作用。本試驗中藥劑處理對不同解磷微生物產生了不同程度的促進和抑制效果。

2.3 藥劑處理前后黃龍病植株根際微生物磷循環(huán)相關功能基因表達水平的差異

利用DIAMOND軟件將宏基因組鑒定到的基因與各功能數(shù)據(jù)庫進行比對。分析藥劑處理前后根際細菌參與磷循環(huán)功能基因表達差異。結果顯示處理后部分參與磷循環(huán)功能基因相對豐度變化顯著。處理前的樣品中注釋到磷循環(huán)功能基因K02038（pstA）、K02037（pstC）和K05986在處理后的樣品中沒有注釋到;而K06080（rcsF）、K09994（phnO）、K03280（lnt）、K00323（NNT）在處理前樣品中沒有注釋到，但處理后相對豐度增加。結合相對豐度比較分析發(fā)現(xiàn)，K02221、K06019（corC）、K05306（phnX）、K06080（phnA）相對豐度表現(xiàn)為QHealth對照>QHLB對照>SDM處理>AMP處理。磷酸酶基因相對豐度比較分析發(fā)現(xiàn)，處理前K01085（agp）、K01096（pgpB）、K09612（iap）、K03788（aphA）、K12945（nudK）、K12978（lpxF）在抗生素處理組中的相對豐度低于QHLB對照，而K01078（PHO）、K05695（PTPRF）、K17458（PPP1R16A）、K17499（PPM1G）、K03456（PPP2R1）、K04461（PPM1B）在抗生素處理組中的相對豐度高于QHLB對照。處理后在健康臍橙中沒有注釋到K05695、K17499、K01096和K03788。磷酸酶基因K01078、K17458、K04461相對豐度表現(xiàn)為QHealth對照>AMP處理>SDM處理>QHLB對照，但K09612、K12945相對豐度表現(xiàn)為QHLB對照>SDM處理>AMP處理>QHealth對照（圖6）。說明藥劑處理對臍橙根際磷循環(huán)功能基因產生了影響。

3 結論與討論

贛南臍橙是贛州主要特色產業(yè)，近年來受柑橘黃龍病影響經濟損失巨大。因病原菌無法培養(yǎng)，目前暫無抗黃龍病柑橘品種，故藥劑防治傳播介體是目前有效的黃龍病防治方法。即便如此，使用藥劑直接防治病原菌依然是目前黃龍病研究熱點之一。研究表明樹干注射0.1 g/株土霉素能夠有效治療感染黃龍病 4年的夏橙[18]，樹干注射青霉素和鏈霉素可有效緩解柑橘植株黃龍病癥狀和病菌含量[19]。本研究結果進一步揭示，采用氨芐青霉素灌根在一定程度上能有效抑制臍橙植株體內黃龍病菌含量，而磺胺二甲氧嘧啶鈉鹽的抑制效果較差。

針對上述研究結果，進一步結合宏基因組測序技術，比較藥劑處理前后患病臍橙植株根際細菌群落結構差異。目前越來越多研究證明植物和微生物在長期進化過程中可以達到一種高度密切的共生關系，進而幫助植物完成營養(yǎng)吸收、加速生長和增強抗逆性[2022]。研究表明黃龍病與根際細菌群落密切相關，柑橘患黃龍病后其根際微生物群落結構和基因功能均發(fā)生變化[2324]。本研究中，門水平上分析發(fā)現(xiàn)處理前健康臍橙中酸桿菌門的相對豐度高于患病臍橙，變形菌門相對豐度低于患病臍橙，與先前研究結果存在差異，分析原因可能是地理位置或者柑橘品種不同導致[25]。灌根處理后，AMP和SDM處理組酸桿菌門、擬桿菌門的相對豐度均高于QHLB對照。慢生根瘤菌屬相對豐度在AMP和SDM處理前后均差異顯著，其中SDM對根際有益微生物的影響大于AMP。已有研究表明土壤中的酸桿菌、根瘤菌在植物生長過程中具有重要作用，具有明顯的生物降解和生物合成能力，可以抵抗多種病原菌、促進根際營養(yǎng)吸收，保持植株土壤氮磷平衡以及促進植物的生長[2627]。Trivedi等

對患黃龍病柑橘根際微生物進行溶磷、固氮等能力測試，發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、伯克氏菌屬Burkholderia對患黃龍病柑橘生長具有有益作用[28]。而在本研究中發(fā)現(xiàn)慢生根瘤菌屬可能對黃龍病防治和根際土壤物質循環(huán)及生態(tài)環(huán)境構建中具有重要作用。磷循環(huán)相關功能基因對根際微生物維持植物磷代謝平衡具有重要作用，與輪作花生相比，輪荒后楊樹林磷循環(huán)功能基因升高，解磷微生物活性增強;pstA、pstC組成pst系統(tǒng)有助于根際細菌完成對Pi 的吸收和利用[2933]。本研究中基因功能分析表明患病臍橙經過藥劑處理后部分磷循環(huán)關鍵功能基因和磷酸酶基因相對豐度存在差異，說明藥劑處理對磷循環(huán)功能基因具有影響，可能改變了磷循環(huán)代謝能力，因此后期可結合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和高通量測序方法，準確掌握藥劑處理后臍橙根際細菌群落功能，改善解磷微生物活性，提高患病植株抗病能力。

綜上，本試驗中1 g/L的氨芐青霉素在一定程度上能抑制臍橙植株內黃龍病原菌，而0.5 g/L磺胺二甲氧嘧啶鈉鹽不能有效防治黃龍病。在各分類水平上微生物表現(xiàn)出明顯差異，這些微生物在植物生長和物質循環(huán)過程中具有重要作用。因試驗期間贛州市正值雨季，細菌群落結構組成與土壤、季節(jié)等環(huán)境因素共同決定[34]，因此后期試驗將結合環(huán)境因子進行詳細的數(shù)據(jù)分析。

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（責任編輯：楊明麗）