山西蘋(píng)果褪綠葉斑病毒的分布及遺傳多樣性分析

續(xù)海紅 王燕飛 竇彥鑫 陳偉 楊凱

摘要 ：蘋(píng)果褪綠葉斑病毒Apple chlorotic leaf spot virus （ACLSV） 是侵染蘋(píng)果的主要潛隱性病毒之一，在我國(guó)蘋(píng)果植株上發(fā)生普遍，嚴(yán)重威脅我國(guó)蘋(píng)果的品質(zhì)與產(chǎn)量。本研究從山西省12個(gè)蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)隨機(jī)采集360份表現(xiàn)褪綠和斑駁等癥狀的蘋(píng)果葉片作為研究樣本，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，360份樣本中有209份樣本為ACLSV陽(yáng)性，對(duì)209份陽(yáng)性樣本的外殼蛋白（coat protein， CP）基因進(jìn)行分離、測(cè)序、克隆，得到12個(gè)新的ACLSV分離物（分別命名為 Shanxi 1～Shanxi 12）。選擇17個(gè)來(lái)自不同國(guó)家的分離物與12個(gè)新的ACLSV分離物在核苷酸和氨基酸層面上進(jìn)行序列一致性和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示，29個(gè)ACLSV分離物被劃分為2個(gè)不同進(jìn)化群體。進(jìn)一步對(duì)2個(gè)不同ACLSV群體進(jìn)行選擇壓分析和中性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，組Ⅰ與組Ⅱ的ACLSV群體之間存在明顯的遺傳差異，其中負(fù)向選擇可能是ACLSV遺傳變異的原因之一。本研究較全面地分析了ACLSV的發(fā)生、危害，并對(duì)山西蘋(píng)果的ACLSV分離物進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析，為山西蘋(píng)果褪綠葉斑病毒病的防治提供了理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 ：山西蘋(píng)果; 隱性病毒; 蘋(píng)果褪綠葉斑病毒; 外殼蛋白; 遺傳變異

中圖分類(lèi)號(hào)：

S 432.41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020578

Analysis on distribution and genetic diversity of Apple leaf spot virus from Shanxi province

XU Haihong1， WANG Yanfei2， DOU Yanxin1， CHEN Wei2*， YANG Kai1，3

（1.Shanxi Key Laboratory of Germplasm Improvement and Utilization in Pomology， Institute of Pomology，

Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， China; 2.School of Life Science， Shanxi Normal University，

Linfen 041000， China; 3. Institute of Cotton Research， Shanxi Agricultural University， Yuncheng 044000， China）

Abstract

Apple chlorotic leaf spot virus （ACLSV） is one of the main recessive viruses infecting apples.It occurs widely on apple plants in China， posing a serious threat to the quality and yield of apples in China.In this study， 360 samples of apple leaves with symptoms such as fading and mottling were randomly collected from 12 major apple production areas in Shanxi province.Based on RT-PCR test results， 209 out of 360 samples showed ACLSV-positive.The CP genes of 12 new ACLSV isolates， named as Shanxi 1—Shanxi 12， were isolated， sequenced and cloned from these positive samples.Phylogenetic analysis was performed based on the nucleotide and amino acid sequences of the CP genes of 29 ACLSV isolates （17 were obtained online）.The results showed that these isolates were divided into two distinct evolutionary populations， with a possible relation to the region and host.The genetic diversity of different ACLSV populations was further studied.Selective pressure analysis and neutrality test showed that these isolates had significant genetic differences between group Ⅰ and group Ⅱ.Negative selection might play an important role in the genetic variation of ACLSV.The knowledge on the occurrence， damage， genetic structure and evolutionary mechanism of Shanxi ACLSV is useful for the design of sustainable management strategies for controlling ACLSV.

Key words

apple; recessive viruses; Apple chlorotic leaf spot virus; coat protein; genetic diversity

蘋(píng)果是世界四大水果之一，廣泛分布在許多國(guó)家和地區(qū)，如中國(guó)、歐洲、日本、澳大利亞和美國(guó)。中國(guó)作為最大的蘋(píng)果生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，天然的地理環(huán)境形成了很多蘋(píng)果優(yōu)勢(shì)種植區(qū)，蘋(píng)果的種植面積和產(chǎn)量、人均占有量和出口量等均居世界前列[12]，已成為農(nóng)民增收，脫貧致富的重要支柱產(chǎn)業(yè)[34]。近些年隨著黃土高原優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)面積增加，渤海灣產(chǎn)區(qū)果園更新及西南冷涼高地新型果園的崛起，蘋(píng)果病毒病成為制約果園發(fā)展的首要病害，其中蘋(píng)果褪綠葉斑病毒病發(fā)生最為普遍，嚴(yán)重影響了蘋(píng)果的產(chǎn)量和質(zhì)量以及果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益[5]。目前蘋(píng)果病毒病缺乏有效的防治方法，因此蘋(píng)果病毒病的系統(tǒng)研究對(duì)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

蘋(píng)果病毒病在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。目前已報(bào)道侵染蘋(píng)果的病毒有39種，中國(guó)已鑒定的蘋(píng)果病毒有17種[68]。蘋(píng)果病毒分為潛隱性病毒和非潛隱性病毒，其中蘋(píng)果莖溝病毒Apple stem grooving virus （ASGV）、蘋(píng)果褪綠葉斑病毒Apple chlorotic leaf spot virus （ACLSV）、蘋(píng)果莖痘病毒Apple stem pitting virus （ASPV）是蘋(píng)果上報(bào)道的最主要的3個(gè)潛隱性病毒[911]。ACLSV是侵染蘋(píng)果的主要潛隱性病毒之一，屬于乙型線形病毒科Betaflexiviridae，纖毛病毒屬Trichovirus[12]。ACLSV為正義單鏈RNA病毒，病毒粒子呈長(zhǎng)線狀或絲狀，基因組大小約7 545～7 555 nt，5′端帶有帽狀結(jié)構(gòu)， 3′端有一個(gè)Poly（A）尾，編碼3個(gè)開(kāi)放式閱讀框（open reading frames， ORFs）[1315]。ORF1編碼蛋白大小為1 877～1 887 aa，分子量約為216 kDa。具有依賴RNA的RNA聚合酶（Pol）、類(lèi)木瓜蛋白酶（P-Pro）、解旋酶（Hel）和甲基轉(zhuǎn)移酶（Mt）活性，在ACLSV復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要功能[16]。 ORF2編碼運(yùn)動(dòng)蛋白（movement protein， MP），大小為446～460 aa，分子量約為50 kDa。參與ACLSV在細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng) [17]。ORF3編碼ACLSV的外殼蛋白（coat protein， CP）[18]，大小為193 aa，分子量約為22 kDa。CP蛋白是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，序列相對(duì)保守， N端高度可變，是ACLSV株系劃分的重要依據(jù)[1920]。

本研究于2015年-2016年在山西省12個(gè)蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)隨機(jī)采集360份表現(xiàn)為褪綠和斑駁等癥狀的新鮮蘋(píng)果葉片。對(duì)ACLSV發(fā)生危害、分子變異等情況進(jìn)行系統(tǒng)性調(diào)查和鑒定，了解ACLSV在山西蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)的遺傳與流行規(guī)律。此外，本研究借助生物學(xué)與生物信息學(xué)對(duì)分離獲得的山西ACLSV全長(zhǎng)CP基因進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和分子變異分析，為山西ACLSV的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物樣品采集

2015年和2016年的4月-6月，在山西省12個(gè)蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)（臨汾市堯都區(qū)、運(yùn)城市區(qū)、霍州、吉縣、臨猗、平遙、平陸、曲沃、太谷、萬(wàn)榮、襄汾、新絳）開(kāi)展ACLSV病毒病調(diào)查，采集360份表現(xiàn)為褪綠或斑駁等癥狀的新鮮蘋(píng)果葉片，迅速放入冰盒，在24 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室分析。

1.2 ACLSV引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的ACLSV（登錄號(hào)為 KC935956）序列中6727-6746位核苷酸設(shè)計(jì)引物ACLSV-CPF（5′-GAGARTTTCAGTTTGCTMGR-3′，M=A/C;R=A/G），7519-7543位核苷酸設(shè)計(jì)引物ACLSV-CPR（5′-AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3′），用于ACLSV檢測(cè)和全長(zhǎng)CP基因克隆。目標(biāo)片段長(zhǎng)度為817 bp。

1.3 RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增與測(cè)序

使用植物總RNA提取試劑盒（Tiangen公司）提取蘋(píng)果葉片樣品的總RNA。使用Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒（Tiangen公司）合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán); 72℃ 延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)體系為25 μL，其中，cDNA 2 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠純化試劑盒（CW2302M，康維試劑）純化并回收陽(yáng)性擴(kuò)增條帶，ACLSV回收產(chǎn)物與PMD19-T載體16℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物在水浴鍋中42℃熱激90 s轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH-5α，LB培養(yǎng)基（含有50 μg/mL Amp）上篩選陽(yáng)性菌落，經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性的菌液送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。每個(gè)ACLSV陽(yáng)性樣本至少進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)序。

1.4 山西ACLSV群體的遺傳多樣性分析

對(duì)本研究獲得的山西ACLSV的CP基因序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)分析，獲得17條來(lái)自不同國(guó)家和寄主上的，與本研究序列相似的ACLSV CP基因序列。采用SDTv 1.2軟件[20]計(jì)算核苷酸序列和氨基酸序列的一致性。使用MEGA 7.0軟件[21]對(duì)本研究分離并克隆的山西ACLSV CP基因進(jìn)行遺傳變異分析?；谏轿鰽CLSV分離物CP基因核苷酸序列，通過(guò)最大似然法（construct/test maximum likelihood tree）中的general time reversible模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展值設(shè)定為1 000，低于50%的進(jìn)化分支在本研究被自動(dòng)舍棄。

1.5 山西ACLSV種群特征與遺傳學(xué)分析

借助DnaSP 5.10.01 軟件，基于CP基因的核苷酸序列，進(jìn)行山西 ACLSV種群遺傳與進(jìn)化分析，計(jì)算參數(shù)按照軟件設(shè)定參數(shù)進(jìn)行[22]。

同時(shí)，計(jì)算Tajima’s D、Fu & Li’s D 和Fu & Li’s F 參數(shù)，對(duì)本研究獲得的山西ACLSV分離物進(jìn)行中性檢驗(yàn)[23]。使用DnaSP 5.0計(jì)算山西ACLSV分離物CP基因非同義突變頻率（Ka）和同義突變頻率（Ks）的比值，進(jìn)行選擇壓分析，若Ka/Ks=1，表示這些群體處在中性或者近似中性選擇中;Ka/Ks<1，群體處在負(fù)向選擇中;如果Ka/Ks>1，群體處在正向選擇中。

1.6 山西ACLSV種群重組分析

基于CP基因的核苷酸序列，利用重組檢測(cè)軟件RDP 4.31自帶的7種檢測(cè)方法（MaxChi、RDP、SiScan、BootScan、Chimaera、GENECONV和3Seq）對(duì)ACLSV不同分離物重組和重組斷點(diǎn)進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別，若至少4種不同方法檢測(cè)到同一重組事件，且P<10-6，則該事件被認(rèn)定為陽(yáng)性重組事件[2425]。

1.7 山西ACLSV種群差異檢驗(yàn)和基因流分析

利用DnaSP 5.10.01 軟件，基于CP基因的核苷酸序列，分別計(jì)算反映山西ACLSV種群差異的5個(gè)檢驗(yàn)值（Kst*、Ks*、Snn、 Z* 和Fst）[26]。通常在沒(méi)有遺傳分化的情況下，Kst*、Ks*、Snn、 Z*的值接近于0。通過(guò)1 000次檢驗(yàn)，4個(gè)檢驗(yàn)值（Kst*、Snn 、Ks*、Z*）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則能反映ACLSV種群遺傳差異情況[27]。Fst作為重要的基因分化系數(shù)，常被用來(lái)衡量種群間多樣性程度。一般來(lái)說(shuō)，未分化至完全分化群體的Fst絕對(duì)值范圍為0～1。Fst的絕對(duì)值>0.33，表明基因流動(dòng)不頻繁;Fst的絕對(duì)值<0.33，表明基因流動(dòng)頻繁[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西ACLSV發(fā)生情況

本研究在山西省12個(gè)蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)隨機(jī)采集了360份具有ACLSV特征的葉片樣本， 通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中有209份樣本被ACLSV浸染，各采樣點(diǎn)檢出率為43.59%～68.18%，平均檢出率為58.06%（表1）。萬(wàn)榮地區(qū)檢出率最高，為68.18%，其余依次為運(yùn)城、霍州、太谷、吉縣、曲沃、臨猗、襄汾、新絳、平遙和臨汾。臨汾的檢出率最低，為43.59%。對(duì)209份樣品的RT-PCR產(chǎn)物回收測(cè)序后，通過(guò)NCBI-BLAST分析（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/），有197份樣品的RT-PCR產(chǎn)物核苷酸序列與已公布的ACLSV 的核苷酸和氨基酸序列一致性為100%，為已知的ACLSV分離物;而其余12份樣品RT-PCR產(chǎn)物核苷酸序列與已登錄的ACLSV分離物在核苷酸和氨基酸水平均有差異，為新的ACLSV分離物（Shanxi 1～Shanxi 12）（表2）。

2.2 山西 ACLSV 群體的遺傳多樣性分析

將來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的17個(gè)分離物與本研究分離的12個(gè)分離物，共計(jì)29個(gè)ACLSV分離物的CP基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育和遺傳變異分析。結(jié)果顯示，29個(gè)ACLSV分離物被分為2組（圖1）。其中，組Ⅰ包含16個(gè)分離物，這些分離物分別來(lái)自于5個(gè)國(guó)家的6個(gè)寄主。就國(guó)家而言，來(lái)自中國(guó)的分離物有6個(gè)，日本3個(gè)，印度3個(gè)，法國(guó)2個(gè)，伊朗2個(gè)。就寄主而言，分離自蘋(píng)果的有7個(gè)，山楂3個(gè)，桃子2個(gè)，李子2個(gè)，梨1個(gè)，杏1個(gè)。組Ⅱ包含13個(gè)ACLSV分離物，均是從中國(guó)的蘋(píng)果上分離獲得。包括本研究分離的12個(gè)山西ACLSV分離物與來(lái)自山東的分離物（KJ522693.1）。

基于CP基因序列一致性分析表明，29個(gè)ACLSV分離物 CP基因核苷酸一致性為81.10%～100%，CP基因氨基酸一致性為88.60%～100%，這說(shuō)明山西ACLSV中CP基因氨基酸在進(jìn)化中具有較高保守性（圖2）。本研究獲得的山西分離物MW410910（Shanxi 1）與 KJ522693.1 的CP基因核苷酸一致性最高，為97.42%;MW410916（Shanxi 7）與D14996.1 序列的CP基因核苷酸一致性最低，為83.33%。其次，山西ACLSV分離物MW410910（Shanxi 1）、MW410912（Shanxi 3）和MW410918（Shanxi 9）與 KJ522693.1的氨基酸一致性最高，為97.93%;MW410917（Shanxi 8）與D14996.1序列的氨基酸一致性最低，為89.12%。

2.3 山西 ACLSV種群特征與變異情況

將來(lái)自于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的17個(gè)分離物與本研究分離的12個(gè)分離物 共29個(gè)ACLSV 分離物按照系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分為2個(gè)組，并使用DnaSP 5.10.01軟件對(duì)ACLSV的種群特征進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，組Ⅰ的突變總數(shù)（η=258）、分離位點(diǎn)數(shù)（S=196）、序列間核苷酸差異的平均數(shù)（K=78.04）和核苷酸多樣性（π=0.134 1）都是最高的（表3）。隨后，對(duì)ACLSV CP基因的多態(tài)性進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示CP基因在1-50、201-250、326-375、401-450和501-550位點(diǎn)的多態(tài)性水平較高，對(duì)應(yīng)Pi值分別為0.099 8、0.198 4、0.144 1、0.127 0、0.059和0.101 5（圖4a）。

2.4 山西ACLSV種群重組分析

重組是病毒遺傳變異的一個(gè)重要來(lái)源。為了研究重組在ACLSV種群進(jìn)化中的作用，利用重組檢測(cè)軟件RDP 4.31對(duì)來(lái)自本研究的12個(gè)分離物和來(lái)自GenBank的 17個(gè)分離物的CP基因進(jìn)行了重組事件檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，在29個(gè)ACLSV分離物中均未發(fā)現(xiàn)明顯的重組事件。

為了進(jìn)一步分析ACLSV CP基因的變異和選擇壓，本研究計(jì)算了29個(gè)ACLSV分離物非同義突變位點(diǎn)和同義突變位點(diǎn)的比值（Ka/Ks）（表3）。結(jié)果顯示，ACLSV兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分組的非同義突變頻率/同義突變頻率的比值（Ka/Ks）均小于1，表明ACLSV 的CP基因進(jìn)化主要受負(fù)向選擇。進(jìn)一步對(duì)2個(gè)進(jìn)化枝的選擇壓差異進(jìn)行分析，組Ⅰ和Ⅱ的Ka/Ks平均值分別為0.078 2和0.141 0（表3）。此外，組Ⅰ和組Ⅱ選擇壓的兩兩分析結(jié)果表明，組Ⅰ和組Ⅱ的Ka/Ks值分布存在差異（圖3b）。雖然ACLSV兩個(gè)組的Ka/Ks值均小于1，但是組Ⅱ的Ka/Ks值明顯高于組Ⅰ，表明組Ⅰ比組Ⅱ受到更強(qiáng)的負(fù)向選擇。

2.5 山西ACLSV的種群的差異檢驗(yàn)和基因流分析

本研究評(píng)估了ACLSV種群組內(nèi)與組間的遺傳分化程度。根據(jù)Ks*， Kst*， Z* 和 Snn的P值，我們發(fā)現(xiàn)組Ⅰ與組Ⅱ在遺傳分化上存在顯著差異，而組Ⅰ內(nèi)和組Ⅱ內(nèi)分離物之間沒(méi)有顯著差異。同時(shí)我們可以看到在組Ⅰ內(nèi)和組Ⅱ內(nèi)的|Fst|均小于0.33，組Ⅰ與組Ⅱ組間的|Fst|大于0.33。說(shuō)明ACLSV分離物在組內(nèi)的基因流動(dòng)非常頻繁，組間的基因流動(dòng)很少。進(jìn)一步計(jì)算了組內(nèi)與組間的遺傳距離，結(jié)果顯示，組Ⅰ內(nèi)和組Ⅱ內(nèi)分離物間的遺傳距離分別為（0.173 3±0.014 3）和（0.030 8±0.005 1），而組Ⅰ與組Ⅱ間的遺傳距離為（0.156 2±0.014 8）（表4）。

2.6 山西ACLSV中性檢驗(yàn)和群體動(dòng)態(tài)

本研究基于Fu & Li’s D、Tajima’s D、Fu & Li’s F 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)值評(píng)估了29個(gè)ACLSV分離物CP基因的核苷酸多樣性模式（表5）。研究結(jié)果顯示，ACLSV組Ⅰ和組Ⅱ的Tajima’s D、Fu & Li’s D、Fu & Li’s F均為正值，但這些值均沒(méi)有顯著差異，這可能是由于種群瓶頸結(jié)構(gòu)或/和平衡選擇造成的。此外，單倍型多樣性（Hd=0.987 0）高和核苷酸多樣性（π=0.029 0）低均在組Ⅱ中出現(xiàn)。綜上結(jié)果表明，山西ACLSV種群多樣性可能是由于平衡選擇造成的。

3 結(jié)論與討論

蘋(píng)果褪綠葉斑病毒是侵染蘋(píng)果的主要潛隱性單鏈RNA病毒，嚴(yán)重威脅蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，采樣的山西9個(gè)產(chǎn)區(qū)ACLSV的發(fā)病率超過(guò)50%，給果農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外， ACLSV的寄主范圍廣，除可以侵染蘋(píng)果外，還可侵染梨、桃、李、杏、櫻桃等多種果樹(shù)，對(duì)果樹(shù)的生長(zhǎng)、產(chǎn)量和質(zhì)量均造成嚴(yán)重的影響[29]。ACLSV在不同宿主和環(huán)境中會(huì)發(fā)生突變以適應(yīng)不同寄主，而高突變率加重了ACLSV危害[30]。本研究通過(guò)對(duì)山西及GenBank中登記的ACLSV分離物CP基因核苷酸序列、氨基酸序列、種群多樣性和種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，基本明確了山西12個(gè)蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)的ACLSV存在變異，種群多樣性較高，是危害山西蘋(píng)果優(yōu)產(chǎn)、高產(chǎn)的重要因素，有效預(yù)防ACLSV已經(jīng)成為山西蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)亟待解決的問(wèn)題。

山西蘋(píng)果ACLSV種群是較為穩(wěn)定的類(lèi)群。ACLSV分離物系統(tǒng)發(fā)育分析和核酸序列一致性分析顯示，來(lái)自中國(guó)山西蘋(píng)果的分離物單獨(dú)分為一組;其他的分離物（如中國(guó)山楂、中國(guó)桃子、日本蘋(píng)果和印度蘋(píng)果等）分為一組。這表明ACLSV分離株的遺傳多樣性主要是由地理和寄主因素共同決定的，該結(jié)果與2015年李科等報(bào)道的山東蘋(píng)果分離物的聚類(lèi)與地理或寄主并無(wú)明顯關(guān)系的結(jié)果相反[18]，這可能是由于本研究?jī)H是基于CP基因分析，ACLSV遺傳多樣性是否與地理或寄主因素相關(guān)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)中國(guó)山西蘋(píng)果的ACLSV種群與其他種群之間的遺傳多樣性存在明顯差異，其種群內(nèi)的突變數(shù)和核苷酸多樣性都是最小，說(shuō)明山西蘋(píng)果的ACLSV種群相比其他已知的ACLSV分離物多樣性較低。結(jié)合前人研究結(jié)果ACLSV在自然環(huán)境存在較大的由環(huán)境因子、地理位置、寄主等引起的負(fù)向選擇壓力[31]。可能是這種負(fù)選擇壓力影響了山西蘋(píng)果ACLSV種群的CP基因變異，同時(shí)，不同ACLSV種群CP基因的Ka/Ks值表現(xiàn)出高度多樣性，這些都證明ACLSV種群可能經(jīng)歷了不同的壓力。本研究中來(lái)自山西蘋(píng)果的ACLSV種群受到負(fù)選擇壓遠(yuǎn)小于組Ⅰ，說(shuō)明該種群與其他ACLSV種群相比正趨于穩(wěn)定。

地域和寄主的負(fù)向選擇壓力可能是山西蘋(píng)果ACLSV種群變異的主要因素。有研究報(bào)道ACLSV種群之間存在顯著的遺傳差異和頻繁的基因交流[6]，而本研究發(fā)現(xiàn)，ACLSV分離株在組內(nèi)的基因交流非常頻繁，而在組Ⅰ與組Ⅱ之間很少出現(xiàn)基因交流。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，組Ⅱ內(nèi)的遺傳距離小于組Ⅰ與組Ⅱ間的遺傳距離，但有趣的是組Ⅰ內(nèi)的遺傳距離大于組Ⅰ與組Ⅱ間的遺傳距離。這可能是由于組Ⅰ的分離物來(lái)自不同國(guó)家和寄主，而組Ⅱ的分離物均來(lái)自中國(guó)蘋(píng)果。不同的宿主、環(huán)境和載體都可能對(duì)ACLSV產(chǎn)生選擇壓力，在強(qiáng)大的選擇壓力下ACLSV能夠非常快速地進(jìn)化，從而提高其遺傳多樣性。通過(guò)對(duì)山西ACLSV群體進(jìn)行中性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山西蘋(píng)果ACLSV種群可能發(fā)生了平衡選擇或種群收縮[32]。 以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)中國(guó)山西蘋(píng)果的ACLSV種群與其他種群之間存在明顯的遺傳差異，同時(shí)山西蘋(píng)果ACLSV種群是非常保守的。ACLSV作為單鏈RNA病毒，其RNA聚合酶缺乏DNA聚合酶的校對(duì)能力[33]。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉鳳之， 王海波， 胡成志. 我國(guó)主要果樹(shù)產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及“十四五”發(fā)展對(duì)策[J].中國(guó)果樹(shù)， 2021（1）： 15.

[2] 鄭國(guó)富. 我國(guó)蘋(píng)果出口貿(mào)易發(fā)展的特征、問(wèn)題與升級(jí)戰(zhàn)略[J].中國(guó)果樹(shù)， 2021（6）： 8992.

[3] 王金政， 毛志泉， 叢佩華， 等. 新中國(guó)果樹(shù)科學(xué)研究70年——蘋(píng)果[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)， 2019， 36（10）： 12551263.

[4] 王樹(shù)桐， 王亞南， 曹克強(qiáng). 近年我國(guó)重要蘋(píng)果病害發(fā)生概況及研究進(jìn)展[J]. 植物保護(hù)， 2018， 44（5）： 1325.

[5] 姚潤(rùn)東， 史文森， 孫吳潤(rùn)澤， 等. 中國(guó)西南主要蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)潛隱性病毒分子鑒定[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2019， 56（2）： 357362.

[6] CHEN Wei， JING Xiaoya， SUN Liuqing， et al. Genome cloning and genetic diversity of Apple chlorotic leaf spot virus[J]. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics， 2019， 56： 514519.

[7] 李保華， 王彩霞， 董向麗. 我國(guó)蘋(píng)果主要病害研究進(jìn)展與病害防治中的問(wèn)題[J]. 植物保護(hù)， 2013， 39（5）： 4654.

[8] ABTAHI F， SHAMS-BAKHSH M， SAFAIE N， et al. Incidence and genetic diversity of apple chlorotic leaf spot virus in Iran [J]. Journal of Plant Pathology， 2019， 101（3）： 513519.

[9] 秦子禹， 孫建設(shè)， 王娜， 等. 蘋(píng)果莖痘病毒TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2015， 42（7）： 14001408.

[10]MA Xiaofang， HONG Ni， MOFFETT P， et al. Genetic diversity and evolution of Apple stem pitting virus isolates from pear in China [J]. Canadian Journal of Plant Pathology， 2016， 38（2）： 218230.

[11]陳雅寒， 孫平平， 馬強(qiáng)， 等. 東北冷寒產(chǎn)區(qū)蘋(píng)果褪綠葉斑病毒檢測(cè)及其分子多樣性分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2019， 46（12）： 23972405.

[12]BRAKTA A， THAKUR P D， HANDA A. First report of apple top working disease caused by viruses （Apple stem grooving virus， Apple chlorotic leaf spot virus， and Apple stem pitting virus） in apple in India [J]. Plant Disease， 2013， 97（7）： 1001.

[13]CHEN Shanyi， ZHOU Ying， YE Ting， et al. Genetic variation analysis of apple chlorotic leaf spot virus coat protein reveals a new phylogenetic type and two recombinants in China[J]. Archives of Virology， 2014， 159（6）： 14311438.

[14]NICKEL O， SILVA F N， FAJARDO T V M， et al. Characterization and genetic variability of coat protein genes of Apple chlorotic leaf spot virus isolates from southern Brazil[J]. Tropical Plant Pathology， 2017， 43（2）： 109116.

[15]WANG M， DAI H. First report of apple chlorotic leaf spot virus in hawthorn in China[J]. Plant Disease， 2015， 99（1）： 164.

[16]URBANOVICH O. Molecular variability of Apple chlorotic leaf spot virus isolated in Belarus [J]. Environmental and Experimental Biology， 2016， 14（3）： 121126.

[17]KESHAVARZ T， HAJNAJARI H. Status of the Apple chlorotic leaf spot virus infection in native and imported apple tree cultivars in the national collection of Kamalshahr horticulture [J]. Journal of Plant Protection， 2019， 33（4）： 387396.

[18]李科， 時(shí)洪偉， 荊陳沉， 等. ACLSV山東蘋(píng)果分離物基因重組及CP序列多樣性分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 48（14）： 28572867.

[19]RANA T， CHANDEL V， KUMAR Y， et al. Molecular variability analyses of Apple chlorotic leaf spot virus capsid protein[J]. Journal of Biosciences， 2010， 35（4）： 605615.

[20]HE Zhen， YASAKA R， LI Wenfeng， et al. Genetic structure of populations of sugarcane streak mosaic virus in China： comparison with the populations in India[J]. Virus Research， 2016， 211： 103116.

[21]張虎， 景曉雅， 孫柳清， 等. 玉米矮花葉病毒分離物基因組克隆及多樣性分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)， 2019. 21（9）： 3643.

[22]HOSSEINI H， MEHRVAR M， ZAKIAGHL M， et al. Comparative genetic diversity of potato virus Y populations based on coat protein gene [J]. Acta Virologica， 2017， 61（2）： 161174.

[23]XIE Xiansheng， CHEN Wei， FU Qiang， et al. Molecular variability and distribution of Sugarcane Mosaic Virus in Shanxi， China [J/OL]. PLoS ONE， 2016， 11（3）： e0151549. DOI： 10.1371/journal.pone.0151549.

[24]DALMON A， DESBIEZ C， COULON M， et al. Evidence for positive selection and recombination hotspots in Deformed wing virus （DWV） [J/OL]. Scientific Reports， 2017， 7： 41045. DOI： 10.1038/srep41045.

[25]WANG Yanan， WU Beilei， BORTH W B， et al. Molecular characterization and distribution of two strains of Dasheen mosaic virus on taro in Hawaii [J]. Plant Disease， 2017， 101（12）： 19801989.

[26]SAMIEI A， MEHRVAR M， ZAKIAGHL M， et al. Distribution and phylogenetic analysis of the 3′UTR and coat protein gene of Iranian Beet black scorch virus[J]. Journal of Plant Diseases and Protection， 2019， 126（6）： 535542.

[27]MURPHY J F， MORAWO T. Comparative evaluation of disease induced by three strains of Tobacco etch virus in Capsicum annuum L.[J]. Plant Disease， 2016， 101（1）： 217223.

[28]LI Xiangdong， ZHU Tiansheng， YIN Xiao， et al. The genetic structure of Turnip mosaic virus population reveals the rapid expansion of a new emergent lineage in China [J/OL]. Virology Journal， 2017， 14（1）： 165. DOI： 10.1186/s12985-017-0832-3

[29]秦子禹， 孫建設(shè)， 王娜， 等. 一種高效的蘋(píng)果褪綠葉斑病毒TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2015， 42（4）： 7479.

[30]SONG Yansu， HONG Ni， WANG Liping， et al. Molecular and serological diversity in Apple chlorotic leaf spot virus from sand pear （Pyrus pyrifolia） in China [J]. European Journal of Plant Pathology， 2011， 130（2）： 183196.

[31]GAO Fangluan， LIN Wuzhen， SHEN Jianguo， et al. Genetic diversity and molecular evolution of Arabis mosaic virus based on the CP gene sequence [J]. Archives of Virology， 2016， 161（4）： 10471051.

[32]TORRICO A K， CELLI M G， CAFRUNE E E， et al. Genetic variability and recombination analysis of the coat protein gene of Strawberry mild yellow edge virus [J]. Australasian Plant Pathology， 2016， 45（4）： 401409.

[33]XING Fei， ROBE B L， ZHANG Zhijia， et al. Genomic analysis， sequence diversity， and occurrence of Apple necrotic mosaic virus， a novel ilarvirus associated with mosaic disease of apple trees in China [J]. Plant Disease， 2018， 102（9）： 18411847.

（責(zé)任編輯：楊明麗）