概述基因工程中的工具酶

張淑萍

摘要催化特異性反應(yīng)的工具酶在基因工程中發(fā)揮著重要的作用，根據(jù)其催化反應(yīng)特性可分為限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶和末端修飾酶4種類型。對這四種工具酶的發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制進(jìn)行概述，并展望工具酶的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 限制酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 末端修飾酶

中圖分類號Q-49文獻(xiàn)標(biāo)志碼E

20世紀(jì)70年代，Paul Berg等人用限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱限制酶）將大腸桿菌（E.coli）的DNA切開后與病毒DNA連接，從而獲得了第一個(gè)重組DNA分子，實(shí)現(xiàn)了化學(xué)水平上DNA分子的重新組合。雖然這并沒有實(shí)現(xiàn)其遺傳和增殖的生物學(xué)意義，但在這一思想的指導(dǎo)下，Cohen和Boyer于1973年開展了具有劃時(shí)代意義的基因重組實(shí)驗(yàn)，為基因工程的誕生與發(fā)展奠定了重要基石。

基因工程從狹義上講是指將載體與一種或多種生物體（供體）的基因在體外進(jìn)行拼接重組，然后導(dǎo)入另一種生物體（受體）內(nèi)，從而按照人們的意愿改變并表達(dá)出新的性狀。從廣義上講，基因工程是指基因操作原理和基因工程應(yīng)用兩部分，包括上游技術(shù)（即狹義的基因工程）和下游技術(shù)（即大規(guī)模培養(yǎng)重組外源基因的生物細(xì)胞以及分離純化外源基因表達(dá)產(chǎn)物）。在基因操作過程中催化特異性反應(yīng)的工具酶發(fā)揮著重要作用，根據(jù)其催化反應(yīng)特性可分為限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶和末端修飾酶4種類型。

1限制酶

1.1限制酶的發(fā)現(xiàn)

早在20世紀(jì)50年代初，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)兩種不同來源的λK和λB噬菌體分別可以高頻感染它們各自的大腸桿菌K株和B株宿主細(xì)胞，當(dāng)它們各自與其他宿主菌交叉混合培養(yǎng)時(shí)，感染頻率會下降數(shù)千倍。λK噬菌體成功感染B株后，由B株繁殖出的λK后代在第二輪接種中便能像λB一樣高頻感染B株，但卻不再有效地感染它原來的宿主K株。10年后，人們搞清了這個(gè)過程的分子機(jī)制。在1968年，人們采用分步純化細(xì)胞提取物技術(shù)首次從E.coli中分離得到了限制酶。目前發(fā)現(xiàn)，限制酶廣泛存在于原核生物中，在細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)1 200余種。

1.2限制酶的作用機(jī)制

根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)與作用方式，可將其分為Ⅰ類限制酶（TypeⅠ）、Ⅱ類限制酶（TypeⅡ）和Ⅲ類限制酶（TypeⅢ）3種類型。其中，Ⅱ類限制酶識別切割位點(diǎn)比較專一，且不具有甲基化酶的活性，在DNA重組中被廣泛應(yīng)用。而Ⅰ類和Ⅲ類限制酶由于在酶分子中包含限制性核酸內(nèi)切活性和甲基化活性，因此被稱為限制/修飾酶，具體見表1。

2DNA連接酶

2.1DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

1967年，三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶，它連接DNA鏈上的5′-磷酸基團(tuán)與另一DNA鏈的3′-羥基，生成磷酸二酯鍵，進(jìn)而封閉缺口，在DNA的復(fù)制、重組和修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)催化過程中所需的能量來源可分為三磷酸腺苷（ATP）依賴型和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴型。迄今為止，DNA連接酶在病毒、細(xì)菌和真核生物體內(nèi)均被發(fā)現(xiàn)，但NAD+依賴型未在真核生物中發(fā)現(xiàn)。

2.2DNA連接酶的作用機(jī)制

2.2.1ATP依賴型

一般動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體的DNA連接酶以ATP作為能量來源，可連接黏性末端和平末端，其作用機(jī)制分為三步：

①DNA連接酶在ATP和輔助因子Mg2+的作用下，形成酶-ATP復(fù)合物，ATP+DNA連接酶→酶-ATP+PPi。

②酶-ATP復(fù)合物上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5′-磷酸基團(tuán)，釋放出酶使其活化。

③活化的5′-磷酸基團(tuán)與另一DNA鏈的3′-羥基生成磷酸二酯鍵，并釋放出一磷酸腺苷（AMP），封閉缺口。

2.2.2NAD+依賴型

與ATP依賴型相比，只是第一步不同，NAD+依賴型的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，如大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶。與ATP依賴型相比，其參與的反應(yīng)只是第一步不同，具體反應(yīng)如下：

NAD++DNA連接酶→酶-ATP+NMN。

3DNA聚合酶

3.1DNA聚合酶Ⅰ

3.1.1DNA聚合酶Ⅰ的發(fā)現(xiàn)

1957年，美國科學(xué)家阿瑟·科恩伯格等人最先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶，并將其命名為DNA聚合酶I，其分子量為109 kD，是由約930個(gè)氨基酸組成的單肽鏈。

3.1.2DNA聚合酶Ⅰ的作用機(jī)制

DNA聚合酶I不參與復(fù)制延長過程，但在合成岡崎片段的過程中發(fā)揮著重要作用，可催化延長約20個(gè)核苷酸的DNA。同時(shí)校讀復(fù)制中的錯(cuò)誤，填補(bǔ)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙，具體過程如下：

①DNA聚合酶活性：以DNA單鏈為模板，在4種脫氧核糖核苷酸和引物存在下，使DNA鏈沿5′→3′方向延長；②3′→5′核酸外切酶活性：沿3′→5′方向識別和切除DNA復(fù)制過程中錯(cuò)配的堿基，起到校對作用，從而保證DNA復(fù)制的正確性；④5′→3′核酸外切酶活性：從5′端降解雙鏈DNA或RNA，用于切除引物；⑤焦磷酸解作用：催化3′末端DNA分子發(fā)生焦磷酸解作用；⑥焦磷酸基交換：催化脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTP）末端的焦磷酸基和無機(jī)焦磷酸（PPi）交換。

3.2DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）

3.2.1DNA聚合酶Ⅰ大片段的發(fā)現(xiàn)

1970年，漢斯·克列諾于用枯草桿菌蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ時(shí)，原來的酶分子被切成76 kD和34 kD兩個(gè)片段，其中大片段通常稱為Klenow片段。它是由400個(gè)氨基酸形成α螺旋構(gòu)型，其分子量是760 kD。

3.2.2DNA聚合酶Ⅰ大片段的作用機(jī)制

Klenow片段保持了DNA聚合酶Ⅰ中的DNA聚合酶活性和3′→5′核酸外切酶活性，但沒有5′→3′核酸外切酶活性。

3.3Taq DNA聚合酶

3.3.1Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)

1988年，Saiki等人從溫泉中的水生噬熱桿菌分離提取獲得Taq DNA聚合酶，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，其最適反應(yīng)溫度高達(dá)75～80℃，分子量為65kD。

3.3.2Taq DNA聚合酶的作用機(jī)制

Taq DNA聚合酶自一種耐熱菌提取，廣泛應(yīng)用于PCR技術(shù)中，它具有5′→3′聚合作用（以DNA雙鏈為模板，結(jié)合特定的引物后，以四種脫氧核苷酸為原料按照堿基互補(bǔ)配對的方式從5′→3′方向合成新的DNA鏈）和5′→3′核酸外切酶活性，但不具有3′→5′核酸外切酶活性。

3.4逆轉(zhuǎn)錄酶

3.4.1逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)

1970年，Temin H M等人在致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶（也稱反轉(zhuǎn)錄酶），它是一種依賴RNA的DNA聚合酶。目前，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)其也存在于其他細(xì)胞中，如煙草、蛙卵、哺乳動(dòng)物分裂中的淋巴細(xì)胞和胚胎細(xì)胞等。

3.4.2逆轉(zhuǎn)錄酶的作用機(jī)制

逆轉(zhuǎn)錄酶是一種具有RNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶活力、DNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶活力和核糖核酸酶H（RNase H）活力的多功能酶，具體如下：

①RNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶活力：催化以RNA為模板，在引物tRNA（主要是色氨酸t(yī)RNA）的3′-末端以5′→3′方向以dNTP為原料，聚合形成DNA的過程。由于其不具有3′→5′外切酶活性，因此無校正功能，催化合成的DNA具有較高的出錯(cuò)率；②DNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶活力：催化以逆轉(zhuǎn)錄合成的第一條單鏈DNA為模板，以dNTP為原料，再合成第二條DNA分子的過程；③RNase H活力：在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成的cDNA與模板RNA形成DNA-RNA雜合鏈，再發(fā)揮其RNase H活力水解掉RNA分子的5′端。

3.5末端轉(zhuǎn)移酶

3.5.1末端轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)

1958年，Bollum等從小牛胸腺中純化出末端轉(zhuǎn)移酶，此后在煙草培養(yǎng)的細(xì)胞、骨髓中的前淋巴細(xì)胞及分化早期的類淋巴細(xì)胞中提取出了末端轉(zhuǎn)移酶，其分子量為58.3 kDa，在輔因子Mg2+、Mn2+、Co2+等作用下，可加速其催化速率。

3.5.2末端轉(zhuǎn)移酶的作用機(jī)制

和大多數(shù)的DNA聚合酶不同，末端轉(zhuǎn)移酶是一種不需要模板的DNA聚合酶，其催化底物是帶有突出、凹陷或平投3′-游離羥基末端的單雙鏈DNA分子。末端轉(zhuǎn)移酶在突出末端時(shí)，被Mg2+激活后，兩條鏈的3′-端可以隨機(jī)聚合脫氧核苷酸，而在平頭或凹陷末端，被輔因子激活后，不按模板要求進(jìn)行聚合反應(yīng)。其反應(yīng)過程需要的引物至少含有3個(gè)堿基短序列，可延長5～300 nt的長度。

4末端修飾酶

末端修飾酶包括多聚核苷酸激酶、堿基磷酸酶和S1核酸酶等，具體情況詳見表2。

目前，基因工程改善著人們的生活，為醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域創(chuàng)造了巨大的價(jià)值。在基因工程中工具酶扮演著關(guān)鍵角色，其制備、性質(zhì)研究和市場買賣已經(jīng)形成了一個(gè)巨大產(chǎn)業(yè)。在基因工程的實(shí)際操作中使用的酶遠(yuǎn)不止以上常用的工具酶。隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，未來在基因操作中還會有新的酶不斷參與進(jìn)來并發(fā)揮重要作用。

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