紅松籽油中皮諾斂酸富集純化工藝

包三三， 王希清， 楊雨春， 武曉丹， 趙春建， 付玉杰,3*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.吉林省林業(yè)科學(xué)研究院,吉林 長春 130031； 3.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,北京 100083)

紅松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)，又名海松、果松，其松籽油中富含人體所需的Δ5-多不飽和脂肪酸(Δ5-UPIFAs)，如亞麻酸、亞油酸、皮諾斂酸、棕櫚酸、二十碳五烯酸、二十碳六烯酸等[1-4]。其中皮諾斂酸是紅松籽油中特有的十八碳三烯酸，其質(zhì)量約占總脂肪酸的14%～19%[5]，具有降血脂、降膽固醇和減肥等功效[6]。皮諾斂酸與其他十八碳三烯酸相比，生物活性更突出，應(yīng)用前景更廣闊。但因皮諾斂酸是高度不飽和脂肪酸，穩(wěn)定性較差，而皮諾斂酸乙酯的功能與皮諾斂酸相近，且穩(wěn)定性更好、更安全，無不良?xì)馕?，更容易被人體吸收[7]，因此可通過制備皮諾斂酸乙酯作為皮諾斂酸前體物發(fā)揮其在醫(yī)藥及食品領(lǐng)域的應(yīng)用。國內(nèi)外最常用的脂肪酸乙酯的制備方法有脂肪酸乙醇酯化法和油脂乙醇醇解法?？紤]到環(huán)境影響以及能源消耗等因素，在催化作用下工藝流程較短、成本較低廉、產(chǎn)物易于分離且收率高[8]的油脂乙醇醇解法更適于紅松籽油脂肪酸乙酯的制備。常用的脂肪酸富集純化方法主要有超臨界流體萃取法、專一性酶法、分子蒸餾法、銀離子絡(luò)合法和尿素包合法等[9-12]，其中尿素包合法因具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、操作簡單、溶劑和尿素都可回收再利用、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性[13]。目前，已報(bào)道的尿素包合法單次富集純化紅松籽油中皮諾斂酸的純度最高只能達(dá)到45.8%～53.36%，回收率僅為27.3%[6]。本研究采用一種新型高效的油脂乙醇醇解法制備脂肪酸乙酯，并結(jié)合尿素包合法對(duì)紅松籽油中皮諾斂酸乙酯進(jìn)行富集純化，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定了尿素包合的最佳工藝并獲得了高純度皮諾斂酸乙酯，以期為皮諾斂酸在食品和醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

紅松籽油由東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。正己烷，色譜級(jí)；KOH、尿素、無水乙醇、氯化鈉、無水硫酸鈉，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

VP2002型分析天平；78HW-1型恒溫加熱磁力攪拌器；MAS-Ⅱ型微波輔助提取儀，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Varian 450-GC/240-MS氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)儀，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1紅松籽油脂肪酸乙酯的制備 稱取10 g紅松籽油放入250 mL三頸燒瓶中，當(dāng)油浴裝置加熱到反應(yīng)所需溫度75 ℃時(shí)，分3次加入配置好的氫氧化鈉/無水乙醇溶液，其中氫氧化鈉的質(zhì)量為紅松籽油質(zhì)量的1.0%，無水乙醇與紅松籽油的物質(zhì)的量之比為8 ∶1。啟動(dòng)油浴攪拌加熱裝置并開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)全程在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行，2 h后立即結(jié)束反應(yīng)。將反應(yīng)后的混合物倒入分液漏斗中進(jìn)行萃取，首先向混合物中加入適量的正己烷，接著用5%氯化鈉溶液洗滌2次，重復(fù)3次以上操作后靜置分層。將靜置分層后的溶液放出下層水相，上層有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥12 h后過濾，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃下旋蒸出濾液中剩余的乙醇和正己烷，最終得到紅松籽油脂肪酸乙酯。

1.2.2皮諾斂酸乙酯的分離及純化 打開微波反應(yīng)器預(yù)熱30 min，將尿素和乙醇按一定比例混合在500 mL三口燒瓶中，在80 ℃下攪拌混合溶液直至澄清，反應(yīng)全程在在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。然后向三口燒瓶中加入適量紅松籽油脂肪酸乙酯，反應(yīng)溫度始終保持在75～80 ℃，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下繼續(xù)攪拌60 min直到溶液透明為止。將三頸燒瓶中的澄清溶液置于設(shè)定溫度下冷凍并結(jié)晶至設(shè)定時(shí)間后，立即將冷凍晶體抽濾。抽濾后的母液用熱的飽和鹽水和蒸餾水洗滌至中性，然后用正己烷萃取，以上操作重復(fù)3次。合并萃取后的上層溶液并用無水硫酸鈉干燥12 h，干燥后過濾除去無水硫酸鈉，通過減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去過量的有機(jī)溶劑，從而獲得高純度的皮諾斂酸乙酯。

1.2.3尿素回收再利用評(píng)價(jià) 尿素包合后混合物固液分離，將抽濾后得到的冷凍結(jié)晶加入一定量的蒸餾水，在100 ℃下攪拌1 h，釋放包合的脂肪酸乙酯[14]。然后向得到的混合溶液中加入正己烷萃取脂肪酸乙酯，上層為脂肪酸乙酯和正己烷，下層為尿素水溶液。將下層尿素溶液在100 ℃下繼續(xù)濃縮至幾乎無水，低溫下結(jié)晶，即可回收得到尿素晶體。

1.3 分析方法

1.3.1紅松籽油脂肪酸乙酯的成分分析 將1.2.1節(jié)制備的紅松籽油脂肪酸乙酯樣品經(jīng)進(jìn)樣前處理后，采用氣相色譜法分析其脂肪酸乙酯的組成。采用VF-5ms硅膠毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：150 ℃下啟動(dòng)升溫程序，以10 ℃/min升至180 ℃(保持2 min)，接著以2 ℃/min升至188 ℃(保持2min)，緊接著以0.2 ℃/min升至190 ℃(保持2 min)，再以5 ℃/min升至220 ℃(保持2min)，最后以10 ℃/min升至260 ℃。進(jìn)樣器溫度240 ℃；檢測(cè)器溫度290 ℃；載氣為高純度氦氣，分流比1 ∶40；燃?xì)鉃楦呒儦錃?，助燃?xì)鉃閴嚎s空氣；樣品進(jìn)樣量1 μL。

1.3.2皮諾斂酸乙酯純度及回收率的測(cè)定 將1.2.2節(jié)得到的皮諾斂酸乙酯樣品經(jīng)過進(jìn)樣前處理后，采用氣相色譜測(cè)定皮諾斂酸乙酯的純度。采用VF-5ms硅膠毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；烘箱升溫程序：150 ℃下啟動(dòng)升溫程序，然后以5 ℃/min升至185 ℃后恒溫保持2 min，接著以0.2 ℃/min升溫至192 ℃后恒溫保持2min，最后以10 ℃/min升溫至280 ℃。氫火焰離子檢測(cè)器；進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度分別為240 ℃和290 ℃；載氣為高純度氦氣，分流比為1 ∶40；燃?xì)鉃楦呒儦錃猓細(xì)鉃閴嚎s空氣；樣品進(jìn)樣量1 μL。皮諾斂酸乙酯GC含量(ω，%)及回收率(η,%)按式(1)～式(2)計(jì)算：

ω=A0/As×100%

(1)

η=m0/m1×100%

(2)

式中：A0—皮諾斂酸乙酯峰面積；As—紅松籽油脂肪酸乙酯峰面積；m0—包合后皮諾斂酸乙酯質(zhì)量，g；m1—包合前皮諾斂酸乙酯質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅松籽油脂肪酸乙酯成分分析

通過GC-MS分析酯化反應(yīng)后紅松籽油中的脂肪酸乙酯成分，將分析結(jié)果與NIST05標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索比對(duì)，確定出紅松籽油脂肪酸乙酯成分及GC含量見表1。由表1可知，紅松籽油混合脂肪酸乙酯中不飽和脂肪酸乙酯的GC含量約為97.67%，其中皮諾斂酸乙酯GC含量約為15.57%。

表1 紅松籽油脂肪酸乙酯組成及含量

2.2 不同條件對(duì)皮諾斂酸乙酯純化效果的影響

2.2.1尿素與混合脂肪酸乙酯質(zhì)量比 在乙醇與尿素比例5 ∶1(mL ∶g，下同)、結(jié)晶溫度為-20 ℃、結(jié)晶時(shí)間為24 h條件下，考察尿素與紅松籽油脂肪酸乙酯質(zhì)量比對(duì)純化效果的影響(每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)，結(jié)果見圖1(a)。由圖可知，尿素用量對(duì)富集效果影響顯著，當(dāng)尿素與脂肪酸乙酯質(zhì)量比為3 ∶1時(shí)，皮諾斂酸乙酯GC含量達(dá)到最大值。這是因?yàn)槟蛩赜昧窟^少時(shí)，形成尿素包合物的框架少，不能最大程度地包合飽和或單不飽和脂肪酸乙酯，富集效果差；用量增加時(shí)，更多的飽和或單不飽和脂肪酸乙酯被尿素包合，使得多不飽和脂肪酸乙酯即皮諾斂酸乙酯GC含量相應(yīng)提高；但是當(dāng)尿素用量達(dá)到一定程度后繼續(xù)增加尿素用量，會(huì)造成尿素過量而皮諾斂酸乙酯GC含量相對(duì)減少。綜含考慮皮諾斂酸乙酯的含量及溶劑消耗，尿素與脂肪酸乙酯質(zhì)量比宜選擇3 ∶1。

2.2.2乙醇與尿素比例 乙醇與尿素比例是影響尿素包合效果的重要因素之一。在尿素與脂肪酸乙酯質(zhì)量比3 ∶1、結(jié)晶溫度-20 ℃、結(jié)晶時(shí)間24 h條件下，考察乙醇與尿素比例對(duì)皮諾斂酸乙酯純化效果的影響(每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)，結(jié)果見圖1(b)。由圖可知，乙醇與尿素比例從4 ∶1(mL ∶g，下同)增加到6 ∶1 時(shí)，皮諾斂酸乙酯GC含量逐漸升高；當(dāng)乙醇與尿素比例超過6 ∶1時(shí)，皮諾斂酸乙酯的含量卻逐漸下降。在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)溶劑量少時(shí)，很難完全溶解尿素，溶液的分子運(yùn)動(dòng)阻力增大；當(dāng)溶劑過量時(shí)，尿素包合反應(yīng)沿逆方向進(jìn)行，這也會(huì)導(dǎo)致皮諾斂酸乙酯的含量逐漸降低，同時(shí)還將增加溶劑回收的難度。因此，在接下來實(shí)驗(yàn)中乙醇與尿素比例宜選擇6 ∶1。

2.2.3包合溫度 合適的包合溫度在尿素包合過程中起著至關(guān)重要的作用。在乙醇與尿素比例6 ∶1、尿素與脂肪酸乙酯質(zhì)量比3 ∶1、結(jié)晶時(shí)間24h條件下，考察包合溫度對(duì)純化效果的影響(每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)，結(jié)果見圖1(c)。由圖可知，當(dāng)包合溫度為-10 ℃時(shí)，皮諾斂酸乙酯GC含量達(dá)到最大值；而當(dāng)溫度升高到0 ℃以上時(shí)，含量急劇下降。該現(xiàn)象歸因于尿素包合反應(yīng)是放熱過程，溫度升高則尿素包合物逐漸分解，導(dǎo)致尿素包合效果差；當(dāng)溫度低時(shí)反應(yīng)朝著尿素包合物形成的方向進(jìn)行。但是，溫度過低，過濾困難，脂肪酸損失大，這也會(huì)導(dǎo)致尿素包合效果變差。因此，綜合考慮反應(yīng)能耗和皮諾斂酸乙酯GC含量，合適的包合溫度為-10 ℃。

a.m(尿素)/m(脂肪酸乙酯)m(urea)/m(fatty acid ethyl esters); b.乙醇與尿素比 ratio of ethanol to urea;

2.2.4包合時(shí)間 反應(yīng)時(shí)間在反應(yīng)過程中也起著重要的作用。在乙醇與尿素比例6 ∶1、尿素與脂肪酸乙酯質(zhì)量比3 ∶1、包合溫度-10 ℃的條件下，考察包合時(shí)間對(duì)純化效果的影響(每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)，結(jié)果見圖1(d)。由圖可知，包合時(shí)間總體上對(duì)皮諾斂酸乙酯GC含量的影響不顯著。皮諾斂酸乙酯GC含量在包合時(shí)間為24 h達(dá)到最大值，繼續(xù)延長包合時(shí)間，皮諾斂酸乙酯的GC含量降低。這是因?yàn)榘戏磻?yīng)在24 h達(dá)到平衡，繼續(xù)延長包合時(shí)間，反應(yīng)向相反方向進(jìn)行。故最佳反應(yīng)時(shí)間為24 h。

2.3 皮諾斂酸乙酯純化的響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以皮諾斂酸乙酯GC含量(Y)為響應(yīng)值，影響較為顯著的3個(gè)因素：尿素與脂肪酸乙酯質(zhì)量比(X1)、乙醇與尿素比例(X2)、包合溫度(X3)為自變量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)結(jié)果和回歸方程，利用Design Expert 8.0.6軟件分析皮諾斂酸乙酯最佳純化工藝，得到皮諾斂酸乙酯GC含量的二次回歸模型方程為：Y=-893.085+149.495X1+242.236X2-7.096X3+0.617X1X2+0.054X1X3+0.044X2X3-25.692X12-20.444X22-0.262X32。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析

從表3的模型方差分析中可以看出，本試驗(yàn)的回歸方程模型P<0.05具有顯著性，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.1051>0.05)，表明該模型擬合成功[15-16]。根據(jù)回歸方程繪制皮諾斂酸乙酯GC含量隨各影響因素變化的響應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖2。尿素包合法中任意2個(gè)顯著性影響因素所形成的響應(yīng)曲面均呈現(xiàn)中心凸起四周下降的趨勢(shì)，說明尿素包合法富集純化皮諾斂酸乙酯實(shí)驗(yàn)中響應(yīng)面選取水平范圍準(zhǔn)確，并且存在皮諾斂酸乙酯GC含量的最大值，通過模型預(yù)測(cè)的最佳純化工藝科學(xué)合理。

通過軟件分析，該回歸方程擬合的皮諾斂酸乙酯GC含量達(dá)到最大值時(shí)的工藝條件為：尿素與紅松籽油脂肪酸乙酯質(zhì)量比3.04 ∶1，乙醇與尿素比例5.99 ∶1(mL ∶g)，包合溫度-12.85 ℃，模型預(yù)測(cè)的皮諾斂酸乙酯GC含量最高為94.84%。為了驗(yàn)證擬合結(jié)果并考慮到實(shí)際操作的可行性，在尿素與紅松籽油脂肪酸乙酯質(zhì)量比3 ∶1、乙醇與尿素比例6 ∶1(mL ∶g)、包合溫度-13 ℃和包合時(shí)間24 h條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到皮諾斂酸乙酯平均GC含量為94.75%，回收率為66.25%。實(shí)際驗(yàn)證值與理論預(yù)測(cè)值非常接近，說明響應(yīng)面法優(yōu)化皮諾斂酸含量的條件真實(shí)可靠。

a.Y=f(X1, X2)； b.Y=f(X1, X3)； c.Y=f(X2, X3)

對(duì)回收尿素重復(fù)包合、分離、再包合過程進(jìn)行了考察，通過對(duì)尿素3次包合和回收后，得到皮諾斂酸乙酯的純度依次為94.75%、88.37%、72.72%，回收率依次為66.25%、61.24%、50.62%。皮諾斂酸乙酯平均純度仍可達(dá)85.28%，雖然純度略有所下降，但證明尿素仍有較好的重復(fù)利用性。

2.4 與傳統(tǒng)純化皮諾斂酸方法的對(duì)比

圖3 新工藝純化皮諾斂酸乙酯GC含量Fig.3 GC content of pinolenic acid ethyl ester purified by the novel technology

圖3為本工藝富集純化出的皮諾斂酸乙酯的GC圖。尿素是一種四方系的晶體，當(dāng)尿素與脂肪族化合物生成包合物后，包合物呈六棱柱的結(jié)晶。一般飽和脂肪酸乙酯和單不飽和脂肪酸乙酯可進(jìn)入尿素形成的六棱柱空管道中，比多不飽和脂肪酸乙酯更容易形成穩(wěn)定的包合物，最終通過減壓抽濾法除去包合物就可以得到高純度的多不飽和脂肪酸乙酯。傳統(tǒng)尿素包合法純化皮諾斂酸的方法較為繁瑣，首先將紅松籽油經(jīng)過皂化反應(yīng)制備紅松籽油混合脂肪酸鹽，再經(jīng)酸化得到紅松籽油混合脂肪酸，接著采用尿素包合法富集純化皮諾斂酸，最后再對(duì)皮諾斂酸采用甲酯化或乙酯化處理后經(jīng)過氣相色譜檢測(cè)其純度。楊明非等[6]經(jīng)此方法得到皮諾斂酸純度約為45.8%，回收率約為27.3%。本實(shí)驗(yàn)利用新工藝純化皮諾斂酸乙酯只包含2個(gè)步驟：采用乙醇醇解油脂法制備紅松籽油混合脂肪酸乙酯，再優(yōu)化尿素包合法富集純化皮諾斂酸乙酯。純化后得到的皮諾斂酸乙酯無需再經(jīng)過甲酯化或者乙酯化處理，可直接利用氣相色譜進(jìn)行純度檢測(cè)。相比傳統(tǒng)方法省去較多實(shí)驗(yàn)步驟，有效減少了實(shí)驗(yàn)過程中皮諾斂酸的損失，且以乙酯形式存在的脂肪酸在實(shí)驗(yàn)條件下結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，有利于富集純化過程的進(jìn)行。本工藝富集純化出的皮諾斂酸乙酯純度可高達(dá)94.75%，回收率可達(dá)66.25%，可以看出，相比傳統(tǒng)方法[6]，皮諾斂酸乙酯純度提高107%，回收率提高143%。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)合乙醇醇解油脂反應(yīng)和尿素包合法，將紅松籽油中皮諾斂酸以脂肪酸乙酯的形式進(jìn)行了高效的富集純化，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了純化工藝。結(jié)果表明：皮諾斂酸乙酯的最佳純化工藝條件為尿素與紅松籽油脂肪酸乙酯質(zhì)量比3 ∶1、乙醇與尿素比例6 ∶1(mL ∶g)、包合溫度-13 ℃和包合時(shí)間24 h，此條件下分離純化出皮諾斂酸乙酯純度高達(dá)94.75%，回收率達(dá)66.25%。與傳統(tǒng)尿素包合法純化皮諾斂酸相比，純度提高107%，回收率提高近143%，并且尿素在回收實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的回收利用性。本方法克服了常規(guī)富集純化皮諾斂酸方法中實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜且純度不高的缺點(diǎn)，建立了一種高效富集純化紅松籽油中皮諾斂酸乙酯的新工藝，將為后續(xù)皮諾斂酸在相關(guān)食品、醫(yī)藥、保健領(lǐng)域的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。