新型對香豆酰氨基酸乙酯的合成與抗氧化活性

王 東, 翟文麗, 肖 瀟, 穆凱代斯·太外庫力, 祝 鈞,2*

(1.北京工商大學 理學院，北京 100048; 2.中國輕工業(yè)化妝品重點實驗室，北京 100048)

過量自由基會加速食品中脂類的氧化，降低食品質(zhì)量和消費者的接受度[1]?？寡趸瘎┛蓽p少慢性疾病(如DNA損傷、突變、致癌)的發(fā)生，這通常與生物系統(tǒng)中自由基傳播的終止有關[2-3]。因此，篩選高效的抗氧化劑對減少自由基損害有積極意義。

對香豆酸(p-CoA)，屬于天然存在的簡單酚酸化合物[4]，主要分布在植物中[5-6]，具有抗菌[7]、抗氧化[8]、抗病毒[9]等多種生物活性，在食品和藥品領域有廣泛應用[10-11]。p-CoA由于溶解性、穩(wěn)定性較差[10]，進一步應用受到限制。對香豆酸酰胺是p-CoA的重要衍生物，自然界中對香豆酰胺衍生物的提取純化過程較復雜。Fu等[12]將p-CoA與3-甲基-2-烯胺在苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)耦合劑下生成(E)-N-乙基-3-(4-羥基苯基)丙烯酰胺，并證實了化合物的抗菌能力。Stankova等[13]以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)與4-二甲氨基吡啶(DMAP)作催化劑，p-CoA在二甲基甲酰胺(DMF)中與纈氨酸噻唑反應，合成了對香豆酰纈氨酸噻唑型酰胺。活性測試結(jié)果表明，化合物具有清除DPPH自由基活性及抗流感病毒功效。

氨基酸常具有多種生物活性，如纈氨酸和酪氨酸具有抗菌作用[14]，賴氨酸和精氨酸具有抗氧化作用[15]。Noh等[16]利用曲酸與氨基酸結(jié)合，發(fā)現(xiàn)與氨基酸結(jié)合后的曲酸對酪氨酸酶的抑制率明顯強于曲酸單體。

受此啟發(fā)，本文采用EDC法，以p-CoA和3種氨基酸乙酯鹽酸鹽為原料，合成了對香豆酰纈氨酸乙酯(a)、對香豆酰亮氨酸乙酯(b)和對香豆酰蛋氨酸乙酯(c)，目標化合物均為新化合物(Scheme 1)，其結(jié)構經(jīng)1H NMR, IR和MS(ESI)表征。并利用體外清除DPPH自由基和羥基自由基實驗研究了目標產(chǎn)物抗氧化活性。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AV 600 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標)；Nicolet IS10型傅里葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；LC201-AB SCIEXAP13200型液質(zhì)聯(lián)用儀。

p-CoA、L-亮氨酸乙酯鹽酸鹽、L-纈氨酸乙酯鹽酸鹽、L-蛋氨酸氨酸乙酯鹽酸鹽、EDC、1-羥基苯并三唑(HOBt)，北京伊諾凱科技有限公司；1，1二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；菲啰啉，北京化玻站生物分析技術有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 a～c的合成(以b為例)[17]

將p-CoA 1.354 g(8.25 mmol)、L-亮氨酸乙酯鹽酸鹽1.614 g(8.25 mmol)和HOBt 1.15 g(8.5 mmol)溶解于DMF(25 mL)中，冰浴冷卻下，攪拌10 min；緩慢滴加三乙胺3.45 mL(24.75 mmol)，滴畢，攪拌反應10 min；撤去冰浴，加入EDC 1.6 g(8.35 mmol)，攪拌下于30 ℃反應20 h。加入100 mL蒸餾水，用乙酸乙酯(150、100、50 mL)萃取，收集有機相，用飽和食鹽水(2×50 mL)洗滌，回收有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，濾液濃縮，殘余物蒸除溶劑后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=乙酸乙酯/石油醚=2/3，V/V)純化得白色粉末狀固體b2.0624 g，收率81.98%, m.p.99～102 ℃;1H NMRδ: 9.86(s, 1H, OH), 8.31(d,J=7.7 Hz, 1H, NH), 7.43～7.37(m, 2H, ArH), 7.34(d,J=15.7 Hz, 1H, CH=C), 6.82～6.76(m, 2H, ArH), 6.48(d,J=15.7 Hz, 1H, C=CH), 4.38(ddd,J=10.0 Hz, 7.8 Hz, 5.1 Hz, 1H, CH), 4.09(qd,J=7.1 Hz, 1.1 Hz, 2H, OCH2), 1.70～1.62(m, 1H, CH), 1.62～1.49(m, 2H, CH2), 1.19(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3), 0.91(d,J=6.6 Hz, 3H, CH3), 0.87(d,J=6.5 Hz, 3H, CH3); IRν: 3340.59(N—H), 1714.89(C=O), 1212.04(C—O), 1194.69(C—O)cm-1; MS(ESI)m/z: 306.18{[M+H]+}。

用類似的方法合成a和c。

a：收率43.2%，淡黃色固體粉末, m.p.141～143 ℃;1H NMRδ: 9.85(s, 1H, OH), 8.19(d,J=8.2 Hz, 1H, NH), 7.43～7.37(m, 2H, ArH), 7.34(d,J=15.7 Hz, 1H, CH=C), 6.84～6.76(m, 2H, ArH), 6.62(d,J=15.8 Hz, 1H, C=CH), 4.28(dd,J=8.2 Hz, 6.2 Hz, 1H, CH), 4.18～4.06(m, 2H, OCH2), 2.13～2.02(m,J=6.8 Hz, 1H, CH), 1.20(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3)，0.91(dd,J=10.4 Hz, 6.8 Hz, 6H, CH3+CH3); IRν: 3356.98(N—H), 1731.76(C=O), 1199.51(C—O), 1173.95(C—O)cm-1; MS(ESI)m/z: 292.02{[M+H]+}。

c：收率47.6%，淡黃色固體粉末, m.p.109～111 ℃;1H NMRδ: 9.86(s, 1H, OH), 8.37(d,J=7.6 Hz, 1H, NH), 7.44～7.37(m, 2H, ArH), 7.35(d,J=15.7 Hz, 1H, CH=C), 6.83～6.76(m, 2H, ArH), 6.48(d,J=15.7 Hz, 1H, C=CH), 4.47(ddd,J=9.1 Hz, 7.6 Hz, 4.9 Hz, 1H, CH), 4.11(qd,J=7.1 Hz, 2.5 Hz, 2H, OCH2), 2.58～2.50(m, 2H, CH2), 2.05(s, 3H, SCH3), 2.10～1.87(m, 2H, SCH2), 1.19(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3); IRν: 3316.96(N—H), 1737.07(C=O), 1211.08(C—O), 1173.95(C—O)cm-1; MS(ESI)m/z: 324.21{[M+H]+}。

1.3 活性測試

DPPH自由基清除作用[18]：待測樣品用無水乙醇溶解，配制不同濃度。取0.5 mL待測液與2.5 mL DPPH·(2×10-4mol/L)乙醇溶液混合搖勻，避光放置30 min，在波長517 nm處測定吸光度。

羥基自由基清除作用[19]：取200 μL 0.75 mM菲啰啉乙醇溶液，依次加入400 μL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH = 7.4)和200 μL待測液混合搖勻，加入200 μL 0.75 mM 硫酸亞鐵溶液，混勻，加入200 μL 0.01%雙氧水，于37 ℃水浴1 h，在波長536 nm處測量吸光度，并計算羥基自由基抑制率。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成[17,20]

采用三因素三水平的正交實驗優(yōu)化了b的合成條件，因素水平見表1。由正交實驗結(jié)果可知，因素對反應收率的影響為C>B>A，最優(yōu)反應條件為A2B2C2，即反應溫度為30 ℃，反應時間為20 h，反應溶劑為DMF。

表1 正交實驗的因素和水平

2.2 自由基清除活性

對香豆酰氨基酸乙酯清除自由基結(jié)果見表2，各物質(zhì)清除自由基能力由強到弱的順序為：c>b>p-CoA>a。與對香豆酸單體相比較，化合物b和c清除自由基活性明顯增強(P<0.05)。各化合物清除自由基能力的與其側(cè)鏈氨基酸基團有關(蛋氨酸乙酯>亮氨酸乙酯>纈氨酸乙酯)。在生物膜系統(tǒng)中，抗氧化活性不僅與羥基的數(shù)量有關，還取決于化合物本身的溶解度，疏水性(或分配系數(shù)，logP)[3]。3種化合物結(jié)構相似，b比a多了一個亞甲基，與c相比用硫原子取代了碳元素并變換了空間構型，不同氨基酸的疏水值不同(纈氨酸>亮氨酸>蛋氨酸)[22]，推知氨基酸疏水值越小，清除自由基能力越強。表明氨基酸基團對于對香豆酰胺酯類物質(zhì)的抗氧化性影響顯著。

表2 自由基清除活性

3 結(jié)論

合成了3種新型對香豆酰氨基酸乙酯(a～c)，并進行了初步體外活性測試。結(jié)果表明：b和c對DPPH半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為79.67±0.51、71.72±0.51 mmol/L，顯著高于p-CoA(88.51±0.50 mmol/L)(p<0.05)；a、b和c對羥自由基的抑制率分別為25.71±3.4%、37.38±0.6%、44.72±1.5%，顯著強于同濃度p-CoA(8.15±0.6%)(p<0.05)。