五倍子、兒茶和黃連對130株艱難梭菌的體外抗菌活性研究

趙峰，楊靖，李志榮，強翠欣，李茹鑫，趙杏珍，王曉明，趙寶鑫，翟宇，李仲興，趙建宏*

(1.石家莊市第一醫(yī)院，河北 石家莊 050000; 2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院,省臨床檢驗中心，河北 石家莊 050000；3.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

艱難梭菌(Clostridiumdifficile，CD)是一種革蘭陽性專性厭氧芽孢桿菌。艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)引起的癥狀輕重不一，輕者僅有輕度腹瀉，嚴重者可引起死亡。2013年和2019年美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)將其列為幾種導(dǎo)致公共健康威脅的微生物之一，耐藥威脅等級為最高的“緊急”級別。近年來，艱難梭菌高產(chǎn)毒株(027/NAPl/BI)在美國、加拿大、歐洲許多地區(qū)出現(xiàn)感染暴發(fā)情況以及流行傳播，病死率及復(fù)發(fā)率高[1-3]，在全世界范圍內(nèi)已引起廣泛的關(guān)注。中草藥在我國具有上千年的使用歷史，在目前耐藥菌株大量產(chǎn)生的背景下，我國傳統(tǒng)中草藥卻沒有出現(xiàn)顯著的耐藥情況，這可能是由于中藥獨特的抗菌(增效)機制[4]。目前，甲硝唑與萬古霉素是治療CDI的首選藥物[5]。但CD對甲硝唑耐藥率在逐步增高，且已發(fā)現(xiàn)了對甲硝唑耐藥和對萬古霉素敏感性下降的菌株[6]。有研究表明CDI患者在接受萬古霉素、甲硝唑治療30 d以內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達15%～35%，復(fù)發(fā)的患者比初次感染患者治療難度大[7]。此外，Nathwani等研究發(fā)現(xiàn)，萬古霉素治療過程中可使人體正常專性厭氧菌在整個腸道菌群所占比例減少，兼性厭氧菌和微需氧菌群所占比例增多[8]。這對臨床治療CDI造成了困難，因此發(fā)現(xiàn)和研制治療CDI的新藥勢在必行。

本實驗選取了具有收斂固澀作用的五倍子、收濕斂瘡功效的兒茶和清熱燥濕作用的黃連3味中藥，研究其對CD的體外抗菌活性，為中藥治療CDI提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器

微量多點接種儀(日本佐久間制作所)；比濁儀(France BioMerieux公司)；生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)；超低溫冰箱(China Haier公司)；精密分析天平(Japan A&D公司)；全自動高壓蒸汽滅菌儀(Japan ALP公司)；厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)(廣州尤德公司)。

1.2 試劑

布魯氏瓊脂(Becton,Dickinson and Company)；布魯氏肉湯(Becton,Dickinson and Company)；氯化血紅素(西安拉維亞生物科技有限公司)；維生素K1(辰欣藥業(yè)股份有限公司)；氫氧化鈉(天津市大陸化學(xué)試劑廠)；脫纖維羊血(北京陸橋科技有限公司)。

1.3 藥材與產(chǎn)地

五倍子(河北)、兒茶(云南)、黃連(四川)均購自石家莊市中醫(yī)院,經(jīng)由藥師張占鑒定,符合2015版《中國藥典》規(guī)定，為正品。

1.4 菌種

本實驗所用的130株CD均來自河北省醫(yī)學(xué)微生物菌種保存中心(Hebei provincial centre for medical culture collection, HBCMCC)。

2 方法

2.1 中藥水煎劑制備

五倍子和黃連煎液制備以五倍子為例:稱取五倍子50 g,加水適量浸泡35～45 min,一煎30 min,收集煎液,再將藥渣加適量水二煎20 min,兩煎共收集煎液100 mL并過濾，此為50%(1∶2)五倍子水煎液，過濾液無菌儲存?zhèn)溆谩?/p>

兒茶煎液制備:稱取兒茶50 g，切成約0.5 cm×0.5 cm大小。加適量清水浸泡30～40 min，先用武火煮沸，然后改用文火使其保持沸騰，一煎30 min, 收集上清煎液, 再將藥渣加適量水二煎20 min, 兩煎共收集煎液100 mL并過濾。此為50%(1∶2)兒茶水煎液，過濾液無菌儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 中藥瓊脂平板制備

取10只無菌試管并標記為1～10號，在第1號管中加入50%(1∶2)水煎液2 mL，2～9號管做水煎液的倍比稀釋。取2 mL無菌蒸餾水分別加入2～9號管中。在2號管加入50%(1∶2)中藥過濾水煎液2 mL，混勻后取出2 mL加到第3號管，混勻，取出2 mL加入到第4號管，依次方法直到第9號管。這樣1～9號管為2 mL的倍比稀釋液，第10號管加入2 mL無菌蒸餾水做對照。取無菌培養(yǎng)基瓶10只，每瓶加入溶化的無菌布魯氏瓊脂18 mL，將第1～9號管的中藥倍比稀釋和10號管的對照液分別倒入10只培養(yǎng)基瓶中，混勻后依次倒入1～10號培養(yǎng)皿平板。1～9號平板為20 mL含藥瓊脂培養(yǎng)皿，10號平板為對照，凝固后備用。第1號的瓊脂平板實際含中藥1∶20(5%),第2號1∶40(2.5%),第3號1∶80(1.25%),第4號1∶160(0.625%)……。

2.3 MIC測定

取CD菌落，配制成0.5麥氏濁度的菌懸液，然后將CD菌懸液接種到含藥培養(yǎng)皿瓊脂平板和對照板上，無菌烤箱烘干，置于厭氧罐中，37 ℃培養(yǎng)48 h。觀察CD生長情況，記錄MIC值。

2.4 含中藥培養(yǎng)皿的藥物濃度計算

將熬制的100 mL煎液用濾紙過濾。取20 mL濾液放于50 ℃無菌烤箱中烘干，得出干重量。干重量除以20就是1 mL濾液的中藥含量，再除以瓊脂的稀釋倍數(shù)可得出1 mL瓊脂中含中藥的藥量。例如20 mL兒茶水煎液(1∶2)干重為4 484.6 mg，在第1號兒茶培養(yǎng)皿中，含布魯氏瓊脂18 mL和煎液2 mL(1∶2)，則培養(yǎng)基兒茶中藥濃度為22.423 mg/mL。

3 結(jié)果

3.1 五倍子、兒茶和黃連對130株CD的抗菌活性

本實驗研究了五倍子、兒茶和黃連3味中藥對130株CD的體外抗菌活性。其中以五倍子對CD的體外抗菌活性最強，其次是兒茶，最弱的是黃連，3味中藥對CD的抗菌活性見表1。

表1 五倍子、兒茶和黃連對130株CD的抗菌活性(mg/mL)

3.2 五倍子等3種中藥對130株CD的累積抑菌率

本實驗采用瓊脂稀釋法研究五倍子、兒茶和黃連3味中藥對CD的抗菌活性，隨著試驗藥物稀釋倍數(shù)的增加，3味中藥的抑制菌株數(shù)和累積抑菌率逐漸下降，見表2。

表2 五倍子等3種中藥對130株CD的累積抑菌率

隨著五倍子藥物濃度的增加，其對CD的累積抑菌率也在增加，當五倍子濃度為0.250 mg/mL時，累積抑菌率達100%。五倍子對CD的累積抑菌百分率見圖1。

圖1 五倍子對130株CD的累積抑菌百分率(%)

兒茶濃度為22.423 mg/mL時，累積抑菌率達100%。兒茶對130株CD的累積抑菌百分率見圖2。

圖2 兒茶對130株CD的累積抑菌百分率(%)

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃連只對12株(9.2%)CD有抑菌作用，對另外118株CD無抗菌作用。黃連的累積抑菌百分率見圖3。

圖3 黃連對130株CD的累積抑菌百分率(%)

4 討論

本實驗以水煎液為研究對象，與中藥劑型中的“湯劑”一致。中藥湯劑在我國已有千年的歷史?！夺樉募滓医?jīng)》序言有“湯液始于伊尹”之說，說明湯劑在商代就已出現(xiàn)。五倍子作為傳統(tǒng)中藥，在《開寶本草》就有記載，具有澀腸固精、收濕斂汗等多種臨床功效[9]?；瘜W(xué)成分以五倍子鞣質(zhì)為主，鞣質(zhì)是一種復(fù)雜的酚類化合物，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，是倍酰葡萄糖的化合物，即葡萄糖上的醇羥基與沒食子酸上的羥基所形成的酯類化合物。β-五-間雙沒食子酰葡萄糖的特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予了五倍子鞣質(zhì)特有的抗菌活性[10]。五倍子對細菌、真菌有很強抑菌作用[11-12]。李仲興等發(fā)現(xiàn)五倍子對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌有抑菌效果[13-14]。并發(fā)現(xiàn)五倍子對表皮葡萄球菌的抗菌作用是干擾細胞壁合成的同時損傷細胞膜，使細菌溶解，破裂死亡。五倍子對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有較強體外抗菌活性，其抗菌作用強于黃連和黃芩[15]。本實驗中五倍子對130株CD的MIC90為0.225 mg/mL，也就是說，當五倍子水煎液的藥物濃度達到0.225 mg/mL時，就可以抑制130株中90%的CD菌株。但五倍子對CD的抑菌作用具體機制不詳，是否是鞣質(zhì)對CD單獨有抗菌作用，還是和其他成分共同發(fā)揮抑菌作用這還有待于進一步的研究。其他五倍子劑型是否與湯劑一樣具有體外CD抗菌作用也有待于研究。此外，我國五倍子分布在十余個省份，藥材除應(yīng)選取道地藥材外，還應(yīng)注意藥材的產(chǎn)地。不同省份的五倍子藥材對細菌體外抑菌效果有差異。有研究發(fā)現(xiàn)河北、浙江、陜西、云南、湖南所產(chǎn)五倍子體外抑菌效果較強，其中云南產(chǎn)五倍子鞣質(zhì)對金葡菌、大腸桿菌、綠膿桿菌體外抑菌效果明顯，陜西、浙江產(chǎn)五倍子鞣質(zhì)對白色念株菌的有較強體外抑菌效果[16]。本研究中所用的五倍子產(chǎn)地為河北，不同省份的五倍子對CD的抑制作用如何還需進一步研究比較。

兒茶是一種常用的中藥材，廣泛種植于氣候濕潤地區(qū),具有收濕斂瘡、止血等功效。本實驗中兒茶對CD有體外抗菌活性，其MIC范圍是4.128～ 22.423 mg/mL。兒茶的MIC范圍較大，最大值和最小值相差約6倍。對其原因進行分析，發(fā)現(xiàn)其MIC值為4.128 mg/mL的菌株僅1株，PCR核糖體型別為HB24。MIC值為22.423 mg/mL的菌株也僅1株，其PCR核糖體型別為HB9。其他型別的MIC為8.100 1～16.200 3 mg/mL。由此推測兒茶的MIC值與艱難梭菌的PCR核糖體分型有關(guān)。但本實驗的艱難梭菌樣本數(shù)僅130株，因此需要增加樣本量來進一步確認它們之間的關(guān)系。兒茶中含有黃酮和酚酸類成分。研究發(fā)現(xiàn)兒茶水煎液對金葡菌、表皮葡萄球菌、腸球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌有體外抑制作用[17]，但其對細菌的具體作用機制有待于進一步研究。

本實驗中黃連只對12株CD有抗菌活性，對另外118株CD無抑制作用，抑菌率為9.2%。這可能是由于黃連水煎液藥物濃度較低，沒有達到有效的抗菌作用濃度。其次可能是黃連本身對CD抗菌能力弱。本實驗的黃連產(chǎn)地為四川，不同的產(chǎn)地，氣候條件、溫濕度變化等因素均可能影響藥效。

本研究發(fā)現(xiàn)五倍子、兒茶和黃連對CD均有抑制作用。五倍子對CD的抗菌活性最強，其次是兒茶，最后是黃連。但這僅是體外實驗結(jié)果，至于體內(nèi)作用如何，尚需進一步的研究。我國地跨溫帶和亞熱帶，適宜中藥材的生長。研究中藥方劑對CD的抗菌作用，可以為臨床采用中藥治療CDI提供新的治療途徑和思路。