蛋白激酶N1 對腦膠質(zhì)瘤生物學行為的影響

郝玉冰 張安玲 王虎 王廣秀 高照 賈志凡

腦膠質(zhì)瘤是一種由多基因、多因素誘發(fā)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，在遺傳學、組織學和臨床特征方面存在異質(zhì)性。膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是原發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤中最為常見的類型，具有較強的侵襲性和增殖能力，患者預后差、病死率高［1?3］。膠質(zhì)瘤的侵襲特性和某些基因如O6?甲基鳥嘌呤?DNA 甲基轉移酶（MGMT）引起的耐藥性使現(xiàn)有治療方法難以達到臨床治愈效果［4］，因此從基因水平尋找新的治療靶點是當前研究的重點。蛋白激酶N1（PKN1）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT），與乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌等多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關［5?7］，PKN1 基 因 可 在 雄 激 素 的 參 與 下 調(diào) 節(jié) 前 列腺癌細胞增殖、細胞集落形成［7?8］，并參與宮頸癌細胞肌動蛋白骨架形成和腫瘤細胞增殖［9］。動物實驗顯示，PKN1 蛋白廣泛表達于大鼠腦組織，對多巴胺能、5?羥色胺能和膽堿能神經(jīng)元的生物學行為有一定影響［10］，同時，PKN1 基因還在小腦平行纖維形成、軸突生長與突觸分化平衡的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用［11］。然而，目前關于PKN1 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的作用較少受到關注，本研究采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫檢索PKN1 基因在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達情況，通過干擾RNA 敲低膠質(zhì)瘤細胞系A172 細胞株PKN1 基因表達觀察腫瘤細胞生物學行為的改變，以期為膠質(zhì)瘤基因治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料

1. PKN1 基因數(shù)據(jù)來源 登錄GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）檢索PKN1 基 因，獲 得PKN1 基因在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達分布圖并可直接使用，在“Expression DIY”功能區(qū)選擇“Boxplot”，自動生成正常腦組織和膠質(zhì)瘤PKN1 基因表達箱式圖。

2.細胞系來源 膠質(zhì)瘤細胞系LN229、U87 和A172 細胞株由天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經(jīng)病學研究所神經(jīng)腫瘤實驗室提供；PKN1 小干擾RNA（siRNA）載體為腺病毒，購于中國上海吉瑪制藥技術有限公司。上述膠質(zhì)瘤細胞株和腺病毒均置于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3. 試劑與儀器 （1）主要試劑：RIPA 工作液［RIPA 與苯甲基磺酰氟（PMSF）體積比為100 ∶1］和Western blotting 檢測試劑盒購自上海索萊寶生物技術公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）由美國Gibco 公司提供；細胞培養(yǎng)箱為德國Heraeus 公司產(chǎn)品；轉染劑Entranster?R4000 購自中國Engreen 公司。PKN1 siRNA 由上海吉瑪制藥技術公司提供，包 括 無 意 義 siRNA （siRNA ? NC： 5’ ?UUCUCCGAACGUGUCACGUTT?3’）和siRNA?PKN1（5’?AAGGGCACGGGAACTGGAGTT?3’）。Ⅰ抗工作液（PKN1 與質(zhì)量分數(shù)為5%脫脂牛奶體積之比為1 ∶1000）和Ⅱ抗 工 作 液［甘 油 醛?3?磷 酸 脫 氫 酶（GAPDH）與磷酸鹽緩沖液（PBS）的體積之比為1 ∶10 000］為美國Santa Cruz 公司產(chǎn)品；增強型化學發(fā)光液購自美國Millipore 公司；CCK?8 檢測試劑盒為日本同仁公司產(chǎn)品；Annexin V?異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒由上海愛必信生物科技公司提供；胰酶細胞消化液、焦碳酸二乙酯處理（DEPC）管、DEPC 水和Transwell 小室均為美國Corning 公司產(chǎn)品；Matrigel 基質(zhì)膠購自美國BD公司。（2）主要儀器：L500 型小型離心機由中國湘儀公司提供；5417R 型4 ℃高速離心機為中國香港基因有限公司產(chǎn)品；6Box iChemi XT 凝膠成像系統(tǒng)購自美國Syngene 公司；IX81 型光學倒置相差顯微鏡由日本Olympus 公司提供；PowerPac 電泳儀由美國Bio?Rad 公 司 生 產(chǎn)；SN258642 型 酶 標 儀 購 自 美 國BioTek 公司。

二、研究方法

1. 細胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤細胞系LN229、U87 和A172 置37 ℃水浴鍋復蘇5 min，離心半徑10 cm、800 r/min 離心5 min，去上層凍存液；加入含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基充分混勻，轉移至新的細胞培養(yǎng)皿搖勻，置37 ℃、含5%二氧化碳（CO2）恒溫箱培養(yǎng)，隔夜更換培養(yǎng)基。細胞達75%~90%融合時消化處理傳代，傳至第3 代時用于細胞轉染實驗。

2. 干擾RNA 敲低膠質(zhì)瘤細胞系A172 細胞PKN1 基因表達實驗 實驗前24 h 將膠質(zhì)瘤細胞系A172 細胞鋪種于6 孔板，細胞數(shù)為200×103個/孔，細胞融合達60%~70%時轉染攜帶siRNA 序列腺病毒，于首次轉染驗證性實驗中加入空白對照組，以排除腺病毒對A172 細胞的影響。敲低實驗分為siRNA?NC 組（對照組）和siRNA?PKN1 組（實驗組），兩組各有2 支200 μl DEPC 管，每管均加入無血清DMEM 培 養(yǎng) 液50 μ l，其 中 一 管 滴 加 轉 染 劑Entranster?R4000 5 μl，另一管則滴加siRNA 工作液（1 OD 的siRNA 粉末以125 μl DEPC 水溶解）5 μl，于室溫靜置5 min，每組兩管充分混勻，于室溫靜置15 min，更換為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，然后分別加入轉染工作液，搖勻，置于37 ℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，6~8 h 后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h備用。

3. Western blotting 法檢測PKN1 蛋白表達變化 分別檢測LN229、U87、A172 膠質(zhì)瘤細胞和敲低PKN1 基因后A172 細胞PKN1 蛋白表達量。腫瘤細胞去除培養(yǎng)基后以4 ℃預冷PBS 1 ml 洗滌2 次，滴加RIPA 工作液（RIPA 與PMSF 體積之比為100 ∶1）150~200 μl/孔，并充分鋪勻培養(yǎng)皿底部，置于冰上裂解30 min，收集細胞裂解液，于4 ℃、離心半徑為10 cm、2000 r/min 離心10 min，取上清蛋白質(zhì)原液，酶標儀測定蛋白質(zhì)原液光密度（OD）值并計算總蛋白含量（總蛋白含量=1.494×OD-0.283），滴加適量4×蛋白上樣緩沖液（緩沖液與蛋白原液體積比為1 ∶3），水浴 煮沸5 min，分裝于1.50 ml EP 管中（150 μl/管），置?80 ℃保存?zhèn)溆?。將備用細胞蛋白液行SDS?PAGE，蛋白質(zhì)移至PVDF 膜，37 ℃、質(zhì)量分數(shù)為5%脫脂牛奶封閉1 h，根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量剪膜，滴加Ⅰ抗工作液（PKN1 與5%脫脂牛奶體積之比為1 ∶1000），4 ℃過夜，恢復至室溫，滴加Ⅱ抗工作液（GAPDH 與PBS 體積比為1 ∶10 000），室溫下?lián)u床慢搖1 h，滴加1 ml 增強型化學發(fā)光液，于曝光儀上檢測目的蛋白印跡，Image J 軟件測定電泳條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參照物，計算目的蛋白相對表達量。

4.敲低PKN1 基因表達觀察膠質(zhì)瘤細胞生物學行為變化 通過干擾RNA 敲低膠質(zhì)瘤細胞系A172細胞株PKN1 基因表達，觀察腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。（1）CCK?8 實驗檢測細胞增殖能力：將處于對數(shù)生長期的A172 細胞接種于6 孔板并使細胞數(shù)達200×103個/孔，隔夜，確保每孔細胞融合達60%~75%再行siRNA 轉染，置于37 ℃、含5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。將siRNA?NC 組和siRNA?PKN1 組A172 細胞接種于96 孔板，細胞數(shù)為2×103個/孔，待細胞完全貼壁后行CCK?8 實驗。腫瘤細胞去培養(yǎng)基，滴加100 μl 無血清DMEM 培養(yǎng)液，再滴加10 μl CCK?8 試劑，置37 ℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，酶標儀上于450 nm 波長測定OD 值，連續(xù)檢測6 d。（2）流式細胞術檢測細胞凋亡變化：采用胰酶細胞消化液消化處理siRNA?NC 組和siRNA?PKN1 組A172 細 胞，Binding Buffer 試 劑（凋亡檢測試劑盒）使細胞重懸于1.50 ml EP 管，細胞數(shù)為50×103個/管，滴加Annexin V?FITC 5 μl/管，室溫靜置10 min，滴加5 μl PI，室溫靜置5 min，流式細胞儀上檢測腫瘤細胞凋亡程度，并計算細胞凋亡率（右上象限和右下象限細胞所占比例）。（3）細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力：將siRNA?NC 組和siRNA?PKN1 組A172 細胞接種于6 孔板，細胞數(shù)為250×103個/孔，37 ℃、含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞融合達75%~80%；再以200 μl 無菌槍頭尖部在6 孔板中劃“十”字，去培養(yǎng)基，加入無血清DMEM 培養(yǎng)液，以首次劃痕拍照計為0 h，此后每12 小時拍照1 次，記錄劃痕面積并計算劃痕愈合率［劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕面積-測量時劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%］，后者即為腫瘤細胞遷移能力。（4）Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力：將Transwell 小室置于24 孔板，小室中鋪Matrigel 基質(zhì)膠60 μl，使無血清DMEM 培養(yǎng)基與Matrigel 基質(zhì)膠體積之比達3 ∶1，置于37 ℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，待Matrigel 基質(zhì)膠凝集，上室滴加無血清DMEM 培養(yǎng)基200 μl，其中包含轉染的A172細胞（siRNA?NC 組和siRNA?PKN1 組細胞數(shù)各30×103個），下室滴加含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出小室，蒸餾水清洗，以體積分數(shù)為4%多聚甲醛溶液固定20 min，蒸餾水清洗，以體積分數(shù)為0.4%結晶紫染色20 min，于光學顯微鏡（×100）下選擇任意4 個視野，計數(shù)細胞穿膜數(shù)目，取平均值，即為腫瘤細胞侵襲能力。

5.統(tǒng)計分析方法 采用GraphPad PRISM 6.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用兩獨立樣本的t 檢驗或單因素方差分析，兩兩比較行LSD?t 檢驗；siRNA?NC 組與siRNA?PKN1 組A172 細 胞不同觀察時間點劃痕愈合率的比較采用重復測量設計的方差分析，兩兩比較行LSD?t 檢驗。以P ≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

經(jīng)檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，PKN1 mRNA 在多種腫瘤組織中的表達量均高于正常組織，其中，膠質(zhì)母細胞瘤PKN1 mRNA 表達量高于正常腦組織，詳見圖1。

Western blotting 法檢測顯示，不同膠質(zhì)瘤細胞系PKN1 蛋白相對表達量差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.002，表1），其中A172 細胞PKN1 蛋白相對表達量高于U87 細胞（t = 3.096，P = 0.036）和LN229 細胞（t=8.994，P=0.000），而U87 細胞與LN229 細胞之間PKN1 蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（t =2.511，P = 0.066；圖2）。敲 低PKN1 基 因 表 達 后，A172 細胞PKN1 蛋白相對表達量低于空白對照組（t = 48.010，P = 0.000）和siRNA?NC 組（t = 43.770，P=0.000），而siRNA?NC 組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（t=0.888，P=0.425；圖3，表2）。

敲低PKN1 表 達第1 和2 天，siRNA?PKN1 組 與siRNA?NC 組膠質(zhì)瘤細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）；第3~6 天，siRNA?PKN1 組膠質(zhì)瘤細胞增殖能力低于siRNA?NC 組且差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.031，0.004，0.000，0.003；表3）。

敲低PKN1 基因表達后發(fā)現(xiàn)，A172 細胞凋亡率為23.90% ~ 28.20%、平 均 為（26.66 ± 1.39）%，而siRNA?NC 組A172 細胞凋亡率為16.33%~19.01%、平均（17.90±0.81）%，組間差異具有統(tǒng)計學意義（t=5.461，P=0.006；圖4）。

隨著時間推移，siRNA?NC 組和siRNA?PKN1 組A172 細胞劃痕愈合率逐漸增加（P=0.000），其中，12 h（P=0.001，0.000）和36 h（P=0.000，0.000）A172細胞劃痕愈合率高于0 h，36 h 劃痕愈合率亦高于12 h（P=0.001，0.017）；而敲低PKN1 基因表達后，A172 細胞劃痕愈合率低于siRNA?NC 組（P=0.000；圖5；表4~6）。

敲 低PKN1 基因 表 達 后，siRNA?PKN1 組A172細胞的穿膜數(shù)目為17 ~ 18 個、平均為（17.330 ±0.577）個，而siRNA?NC 組A172 細胞的穿膜數(shù)目為26~33 個、平均（29.330±3.512）個，組間差異具有統(tǒng)計學意義（t=5.840，P=0.004；圖6）。

討 論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，其發(fā)生與發(fā)展由多基因、多因素所引起，并且腫瘤的侵襲性和相關基因誘發(fā)的耐藥性使治療愈發(fā)困難，患者生存率較低。PKN1 基因可參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，例如可以通過PKN1?WDR5?KAT8 和PKN1?H3T11P?WDR5?H3K4me3 信號轉導通路調(diào)節(jié)前 列 腺 癌 細 胞 的 增 殖［7?8］，亦 可 以 與GTP 酶Rho 結合從而發(fā)揮相應的生物學功能［12?13］。

GEPIA 數(shù)據(jù)庫涵蓋大量基因數(shù)據(jù)，可從中尋找到許多基因的差異體和相似體，也可檢索到某一基因在正常組織及其相應腫瘤組織中的相對表達量，以及該基因相對表達量與腫瘤級別的相關性，從而預測該基因與腫瘤之間的關系。通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫可以發(fā)現(xiàn)，PKN1 mRNA 在膠質(zhì)瘤、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中的表達量明顯高于其所對應的正常組織，提示PKN1 可能為膠質(zhì)瘤相關基因，但該基因在膠質(zhì)瘤惡性進展中的作用目前尚不明確。

對多 個 膠 質(zhì) 瘤 細 胞系（U87、LN229 和A172）PKN1 蛋白表達量的分析顯示，以膠質(zhì)瘤A172 細胞PKN1 蛋白相對表達量最高，因此，后續(xù)研究可采用RNA 干擾（RNAi）技術敲除A172 細胞PKN1 基 因，以觀察該基因?qū)172 細胞生物學行為的影響。

細胞增殖能力可直接反映腫瘤細胞活力，本研究CCK?8 實驗顯示，敲低PKN1 基因表達后第3 天，A172 細胞增殖能力明顯受到抑制，并可以持續(xù)至第6 天，表明下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞PKN1 基因表達可抑制腫瘤細胞增殖。細胞凋亡是基因調(diào)控的細胞程序性死亡形式［14］，腫瘤細胞凋亡受到抑制，可促進腫瘤生長，也可使腫瘤細胞發(fā)生耐藥［15］。本研究流式細胞術檢測顯示，敲低PKN1 基因表達后，A172 細胞凋亡率增加，表明下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞PKN1 基因表達可誘導腫瘤細胞凋亡，進而抑制膠質(zhì)瘤進展。遷移和侵襲能力是腫瘤細胞的另一生物學特性，與腫瘤惡性程度和預后直接相關，本研究采用細胞劃痕實驗檢測腫瘤細胞遷移能力，其結果顯示，siRNA?PKN1組和siRNA?NC 組A172 細胞劃痕愈合率隨時間推移具有不同程度增加，而敲低PKN1 基因表達后A172細胞劃痕愈合率降低且低于siRNA?NC 組，表明下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞PKN1 基因表達可以抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移；與此同時，Transwell 實驗顯示，敲低PKN1 基因表達后，A172 細胞穿過Matrigel 基質(zhì)膠的數(shù)目明顯減少，表明下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞PKN1 基因表達可抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲性。

圖1 GEPIA 數(shù)據(jù)庫PKN1 mRNA 表達量 1a 多種腫瘤組織及其對應的正常組織PKN1 基因表達譜 1b 膠質(zhì)母細胞瘤（163 例）PKN1 mRNA 表達量高于正常腦組織（207 例，P<0.05） 1c 所有腫瘤組織及其對應的正常組織PKN1 基因表達譜（每點代表樣本表達量）Figure 1 Expression of PKN1 mRNA in the GEPIA database The PKN1 gene expression profile across some tumor samples and paired normal tissues (Panel 1a). The expression of PKN1 mRNA in glioblastoma (163 cases)was higher than that in normal brain tissue (207 cases, P < 0.05; Panel 1b). The PKN1 gene expression profile across some tumor samples and paired normal tissues (Each dot represents expression of samples, Panel 1c).

表1 不同膠質(zhì)瘤細胞系PKN1 蛋白相對表達量的比較（±s）Table 1. Relative expression of PKN1 in glioma cell lines (±s)

組別A172 細胞U87 細胞LN229 細胞F 值P 值例數(shù)3 3 3 PKN1 蛋白相對表達量0.95±0.09 0.69±0.12 0.51±0.01 20.180 0.002

圖2 Western blotting 法檢測顯示，A172 細胞PKN1 蛋白相對表達量高于U87 和LN229 細胞Figure 2 Western blotting showed the PKN1 protein expression in A172 cells was higher than that in U87 and LN229 cells.

圖3 Western blotting 法檢測顯示，轉染siRNA?PKN1 后A172細胞PKN1 蛋白相對表達量降低Figure 3 Western blotting showed the expression of PKN1 in A172 cells after siRNA?PKN1 transfection was reduced.

表2 不同組別A172 細胞PKN1 蛋白相對表達量的比較（±s）Table 2. Relative expression of PKN1 in blank group,siRNA?NC group and siRNA?PKN1 group (±s)

表2 不同組別A172 細胞PKN1 蛋白相對表達量的比較（±s）Table 2. Relative expression of PKN1 in blank group,siRNA?NC group and siRNA?PKN1 group (±s)

siRNA，small interference RNA，小 干 擾RNA；PKN1，protein kinase N1，蛋白激酶N1。The same for Table 3 and 4

例數(shù)組別空白對照組siRNA?NC 組siRNA?PKN1 組F 值P 值3 3 3 PKN1 蛋白相對表達量0.70±0.01 0.69±0.01 0.24±0.01 1351.000 0.000

表3 siRNA?PKN1 組與siRNA?NC 組A172 細胞增殖能力的比較（±s，OD450 nm）Table 3. The proliferation ability of A172 cells between siRNA?PKN1 group and siRNA?NC group (±s, OD450 nm)

表3 siRNA?PKN1 組與siRNA?NC 組A172 細胞增殖能力的比較（±s，OD450 nm）Table 3. The proliferation ability of A172 cells between siRNA?PKN1 group and siRNA?NC group (±s, OD450 nm)

組別siRNA?NC 組siRNA?PKN1 組t 值P 值例數(shù)3 3第1 天0.38±0.01 0.37±0.01 0.889 0.424第2 天0.39±0.01 0.37±0.01 1.040 0.357第3 天0.63±0.03 0.51±0.02 3.275 0.031第4 天0.72±0.02 0.53±0.03 5.949 0.004第5 天0.81±0.03 0.48±0.01 10.430 0.000第6 天0.83±0.05 0.46±0.02 6.645 0.003

圖4 流式細胞術顯示，轉染siRNA?PKN1 后A172 細胞凋亡率增加 4a siRNA?NC 組 4b siRNA?PKN1 組Figure 4 Flow cytometry showed the cell apoptosis of A172 cells was increased after siRNA?PKN1 transfection. siRNA?NC group (Panel 4a). siRNA?PKN1 group (Panel 4b).

圖5 細胞劃痕實驗結果顯示，siRNA?PKN1 組A172 細胞劃痕的愈合能力明顯低于siRNA?NC 組 HE染色 ×100Figure 5 Scratch healing test showed the scratch healing ability of siRNA?PKN1 group was significantly weaker than that of siRNA?NC group. HE staining ×100

綜上所述，膠質(zhì)瘤PKN1 mRNA 表達量高于正常腦組織，敲低PKN1 基因表達可抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，進而抑制膠質(zhì)瘤細胞的惡性生物學行為，同時誘導腫瘤細胞凋亡，進而抑制膠質(zhì)瘤進展。本研究僅對PKN1 基因在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達變化，以及敲除PKN1 基因?qū)δz質(zhì)瘤細胞生物學行為的影響進行了初步探討，PKN1基因影響膠質(zhì)瘤生物學行為的具體分子機制和相關信號轉導通路，以及對患者預后和生存影響尚待進一步深入研究，以期為膠質(zhì)瘤的診斷與治療提供新的靶標。

表4 siRNA?PKN1 組與siRNA?NC 組不同觀察時間點A172 細胞劃痕愈合率的比較（±s，%）Table 4. The scratch healing rate of A172 cells at different time points between siRNA ? PKN1 group and siRNA?NC group (±s, %)

表4 siRNA?PKN1 組與siRNA?NC 組不同觀察時間點A172 細胞劃痕愈合率的比較（±s，%）Table 4. The scratch healing rate of A172 cells at different time points between siRNA ? PKN1 group and siRNA?NC group (±s, %)

組別siRNA?NC 組siRNA?PKN1 組例數(shù)3 3 0 h（1）0.00±0.00 0.00±0.00 12 h（2）11.42±5.66 11.40±0.36 36 h（3）48.25±1.49 29.24±0.85

表5 siRNA?PKN1 組與siRNA?NC 組不同觀察時間點A172 細胞劃痕愈合率重復測量設計的方差分析Table 5. Repeated measurement design analysis of variance of the scrath healing rate of siRNA?PKN1 group and siRNA?NC group at different time points in A172 cells

表6 同一處理組不同觀察時間點A172 細胞劃痕愈合率的兩兩比較Table 6. Pairwise comparison of the scratch healing rate of A172 cells at the different time points in the same treatment group

圖6 光學顯微鏡觀察顯示，敲低PKN1 基因表達后A172 細胞穿膜數(shù)目減少 結晶紫染色 × 100 6a siRNA?NC 組 6b siRNA?PKN1 組Figure 6 Optical microscopy showed the number of A172 cells passing through the membrane decreased after PKN1 gene was knocked down Crystal violet staining ×100 siRNA?NC group (Panel 6a). siRNA?PKN1 group (Panel 6b).

利益沖突無