男性不育實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立的研究進(jìn)展

李怡佳 邊艷超 李 碩 肖 瑞

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059

男性不育是一種多因素病理狀況，影響全球約75%的男性。闡明男性不育遺傳機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)了許多關(guān)鍵途徑。例如，在性分化減數(shù)分裂過程中，由于減數(shù)分裂過程的復(fù)雜性，大量基因被認(rèn)為參與了減數(shù)分裂過程的調(diào)控。這一過程中存在的缺陷可能導(dǎo)致減數(shù)分裂失敗、產(chǎn)生非整倍體配子和不育。非整倍體配子可以導(dǎo)致胚胎死亡或后代發(fā)育缺陷[1]。目前男性不育的臨床治療主要依靠輔助生殖技術(shù)，但其存在費(fèi)用高、操作繁瑣以及高多胎率等一系列亟待解決的問題。因此，研究男性不育的發(fā)病機(jī)制并針對(duì)病因給予治療是今后的主要研究方向。本文對(duì)常見物理方法、化學(xué)方法、手術(shù)方法及基因敲除方法進(jìn)行總結(jié)。

1 物理方法

1.1 熱刺激

哺乳動(dòng)物中，睪丸溫度低于體溫的2～8℃是精子發(fā)生的前提條件[2]。睪丸溫度異常升高使代謝加快，需氧量增加，破壞平衡的氧化穩(wěn)態(tài)，致使精子損傷，導(dǎo)致不育。溫度越高，加熱時(shí)間越長，對(duì)生殖能力的損害越大。這種高溫誘發(fā)的精子損傷是可逆的。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道通過熱刺激來建立不育模型，處理的方法有水浴加熱、高溫照射、紅外線、激光等，考慮到可操控性及安全性，水浴加熱最為常用。

Hamilton 等[3]通過對(duì)公羊睪丸連續(xù)加熱288 h 并持續(xù)9 周收集精液后，發(fā)現(xiàn)精子運(yùn)動(dòng)性、活力和質(zhì)量運(yùn)動(dòng)性均降低。在第5 周時(shí)，缺陷精子的數(shù)量顯著增加，具體表現(xiàn)在膜和頂體受損的精子百分比增加；完整的膜和頂體的精子百分比降低；完整的膜和受損的頂體精子百分比升高。Paul 等[4]發(fā)現(xiàn)公羊精子接受14 d或28 d 的熱刺激后可觀察到頂體和質(zhì)膜損傷。但從第6 周開始，實(shí)驗(yàn)組的公羊精子與未受熱刺激的公羊精子比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05），提示精子的損傷程度與熱刺激的時(shí)間和溫度呈正相關(guān)，但在一定程度上是可逆的。這可能是因?yàn)闊岽碳ず蠊虿G丸中的抗氧化劑（HMOX1、GPX1 和GSTA）表達(dá)增強(qiáng)，氧化應(yīng)激失衡導(dǎo)致的氧化穩(wěn)態(tài)被破壞[3]，這種損傷會(huì)持續(xù)約1 個(gè)精子周期（47 d）。

劉安娜等[5]收集了71 例高溫環(huán)境男性工作者（廚師、電焊工、鍋爐工）的精液進(jìn)行對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)長期暴露于高溫環(huán)境中，男性的精子密度、精子活率明顯下降，精子畸形率明顯升高，且暴露時(shí)間越長，癥狀越明顯。持續(xù)高溫導(dǎo)致睪丸內(nèi)環(huán)境和生精微環(huán)境改變，造成生精細(xì)胞脫落、曲細(xì)精管萎縮。隨著熱暴露時(shí)間的延長，附睪精子出現(xiàn)胞漿小滴，精子運(yùn)動(dòng)速度增快，未成熟精子被排出，并產(chǎn)生失活精子和各種畸形精子。Rao 等[6]將兩組試驗(yàn)者以不同頻率在43℃水中進(jìn)行水浴。通過觀察發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)者精子密度及總精子數(shù)均明顯降低，精子運(yùn)動(dòng)性、低滲腫脹試驗(yàn)評(píng)分和總頂體酶活性增加，但其是可逆的。與連續(xù)熱暴露比較，反復(fù)間歇性熱暴露更嚴(yán)重地抑制精子發(fā)生，具體表現(xiàn)在恢復(fù)時(shí)間更長，程度更重，這可能是由于間歇性熱暴露會(huì)在精子發(fā)生的多個(gè)階段產(chǎn)生影響。

1.2 輻射效應(yīng)

男性生殖細(xì)胞對(duì)電離輻射、輻射熱及有毒物質(zhì)敏感。經(jīng)X 線照射的小鼠睪丸組織中[7]可觀察到睪丸組織、生殖細(xì)胞的形態(tài)，DNA 含量均發(fā)生變化。經(jīng)X 線照射后小鼠睪丸重量減輕，睪丸生精小管內(nèi)精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞質(zhì)減少、核固縮，細(xì)胞膜破裂，壞死脫落。生精小管形狀不規(guī)則，管腔間隙增大,生精細(xì)胞層數(shù)明顯減少，管腔內(nèi)成熟精子占比減少甚至消失。精子及生精細(xì)胞DNA 鏈發(fā)生斷裂，影響生精功能。

Zhang 等[8]將小鼠精母細(xì)胞衍生的GC-1 細(xì)胞暴露于環(huán)境射頻場和X 線中發(fā)現(xiàn)，共同照射下的細(xì)胞較單獨(dú)暴露于X 線的細(xì)胞增殖水平顯著降低并且凋亡率顯著增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低以及Bax 蛋白表達(dá)增高，可觀察到生精小管的結(jié)構(gòu)、精子形態(tài)及數(shù)量和抑制生殖細(xì)胞增殖等方面的改變。提示Bcl-2 和Bax 可能參與輻射誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制，環(huán)境射頻場雖然不會(huì)對(duì)男性生殖能力有影響，但可加劇X 線誘導(dǎo)的細(xì)胞抑制增殖。

2 化學(xué)方法

2.1 化療藥物

近幾十年來，化療藥物的發(fā)展使癌癥患者的存活率急劇上升，但也因此出現(xiàn)生育問題。環(huán)磷酰胺（CTX），順鉑（CIS）和多柔比星（DOX）是臨床常用抗癌藥物。這些藥物通過對(duì)生發(fā)上皮內(nèi)特定細(xì)胞的選擇性損傷，阻礙精子成熟障礙，損傷支持細(xì)胞或上皮樣間質(zhì)細(xì)胞等，使正常的微環(huán)境受到破壞，影響精子產(chǎn)生。已有研究[9]顯示青春前期的孩童接觸這些化療藥物會(huì)影響生育能力，幸存的男性受孕概率降低，且單獨(dú)和聯(lián)合使用藥物差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05），女性妊娠的可能性及活產(chǎn)率均明顯降低。

Smart 等[10]發(fā)現(xiàn)將青春前期小鼠睪丸組織碎片分別培養(yǎng)于臨床治療濃度的CTX 活性代謝物磷酰胺芥末、CIS 及阿霉素中，觀察到這3 種藥物均導(dǎo)致小鼠睪丸組織中包括精原干細(xì)胞在內(nèi)的生殖細(xì)胞特異性及顯著性喪失，但體細(xì)胞沒有受影響。暴露于高濃度CTX 和DOX 中，95%的小管缺乏生殖細(xì)胞或大量細(xì)胞壞死；高濃度CIS 組在此基礎(chǔ)上同時(shí)并有生精小管的直徑減小。很多學(xué)者研究了大量化療藥物對(duì)青春后期嚙齒類動(dòng)物的性腺毒性，結(jié)果表明暴露于CTX、CIS、DOX 均導(dǎo)致精原細(xì)胞及精母細(xì)胞數(shù)量降低，并且CTX 不僅造成精原干細(xì)胞的死亡，存活干細(xì)胞中產(chǎn)生的精子也可能表現(xiàn)出一定程度的功能和DNA損傷[11]。

2.2 棉酚

魚精蛋白是成熟精子的主要核蛋白，其主要作用是濃縮精子細(xì)胞核，保護(hù)精子遺傳信息，通過組蛋白-魚精蛋白取代反應(yīng)使精子細(xì)胞核高度濃縮[12]。醋酸棉酚能夠破壞曲細(xì)精管中的精子細(xì)胞和精母細(xì)胞，干擾大鼠HPRR 及精核蛋白含量，抑制精子的發(fā)生過程，在大部分臨床不育患者中均存在HPRR 及精核蛋白異常。

Santana 等[13]研究顯示，棉酚會(huì)對(duì)精子運(yùn)動(dòng)及形態(tài)產(chǎn)生影響。大鼠灌胃給藥劑量為5 mg/kg 的棉酚乙酸混合液，實(shí)驗(yàn)組大鼠的后代數(shù)量為零，附睪精子數(shù)量減少，谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著增加，睪丸中GSH 的濃度顯著降低。El-Sharaky 等[14]對(duì)大鼠注射不同劑量的棉酚乙酸混合液，各劑量組大鼠生育能力均被影響，精子呈現(xiàn)不同程度的形態(tài)異常及運(yùn)動(dòng)性降低，睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞被完全破壞，精子數(shù)量減少，濃度降低。同時(shí)大鼠肝臟組織病理切片存在亞急性或慢性肝損傷。棉酚損傷動(dòng)物模型對(duì)臨床用藥劑量的選擇有重要意義，適當(dāng)劑量不僅能將藥物的副作用減弱，也能減少對(duì)其他組織臟器的損傷。

2.3 雷公藤多苷

雷公藤多苷干擾大鼠睪丸初級(jí)精母細(xì)胞DNA 合成，使睪丸萎縮，各級(jí)生精細(xì)胞變性、壞死、數(shù)量減少，其中以精子、精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞最敏感；附睪精子畸形率顯著提高，精子頭尾分離、無鉤、頸尾彎曲、無定形現(xiàn)象顯著增多[15]，但低劑量雷公藤多苷的作用是可逆的。

按30 mg/kg 的劑量灌胃SD 大鼠8 周[16]后大鼠精子密度及活性顯著降低，精子細(xì)胞質(zhì)和線粒體Ca2+含量顯著降低，經(jīng)治療30 d 后顯著恢復(fù)。以30、40、50 mg/kg 劑量的雷公藤混懸液分別灌胃SD 大鼠3～5 周后，大鼠睪丸的質(zhì)量、精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)率以及睪丸組織Makler 評(píng)分（testicular Makler score，TMS）隨劑量或灌胃時(shí)間的增加而持續(xù)降低。停藥后，低、中劑量組指征略有恢復(fù)；50 mg/kg 組未見恢復(fù)。給予雌性昆明小鼠50 mg/kg 雷公藤多苷后[17]可觀察到小鼠的發(fā)情期時(shí)長增加，但發(fā)情頻率顯著降低，雌性小鼠子宮內(nèi)膜變薄，并誘導(dǎo)卵巢早衰。

2.4 腺嘌呤

腺嘌呤在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通常是用來誘發(fā)慢性肝、腎功能損害模型。在腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎損傷早期Wistar 大鼠[18]中發(fā)現(xiàn)腺嘌呤通過抑制17β-羥基類固醇氧化還原酶產(chǎn)生抑制睪酮的合成。連續(xù)30 d 對(duì)大鼠灌胃200 mg/kg 劑量的腺嘌呤[19]，觀察到大鼠的交配數(shù)量并使交配潛伏期延長，且睪丸重量減少，精子密度和精子活力降低以及睪丸中的酸性磷酸酶（ACP）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、乳酸脫氫酶（LDH）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）活性降低，經(jīng)果糖二磷酸鍶鹽治療后可恢復(fù)。

3 手術(shù)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)性隱睪

Li 等[20]對(duì)10 日齡的昆明小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)隱睪手術(shù)35 d 后發(fā)現(xiàn)精液中僅存在精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，提示隱睪可能使精子的發(fā)育停滯在初級(jí)精母細(xì)胞階段。對(duì)小鼠進(jìn)行單側(cè)隱睪手術(shù)[21]，兩側(cè)對(duì)比效果更為明顯。手術(shù)側(cè)全部生精小管均顯示出萎縮和塌陷，在生發(fā)上皮中存在嚴(yán)重的退行性變化，并且所有階段都未出現(xiàn)晚期生殖細(xì)胞。

隱睪癥的手術(shù)誘導(dǎo)模型是經(jīng)常被用作研究睪丸組織熱應(yīng)激的模型[22]，提示隱睪癥導(dǎo)致小鼠生育能力的降低機(jī)制與熱應(yīng)激相似，都與高溫引起的抗氧化酶活性下降有關(guān)。

3.2 手術(shù)致精索靜脈曲張

精索靜脈曲張一直被認(rèn)為是導(dǎo)致男性不育的原因之一。Saypol 等[23]對(duì)大鼠和狗進(jìn)行了精索靜脈曲張實(shí)驗(yàn)，術(shù)后大鼠和狗的睪丸血流量增加，睪丸溫度升高，需氧量上升，成熟精子生精小管百分比下降，睪丸生殖細(xì)胞凋亡程度加重，同時(shí)睪丸萎縮。

4 遺傳因素

4.1 X 線修復(fù)交叉互補(bǔ)組1（Xrcc1）基因敲除

Xrcc1 是一種重要的DNA 修復(fù)基因，在精子發(fā)生早期高度表達(dá)[24]，以維持基因組穩(wěn)定性。Xrcc1 基因敲除小鼠與野生型小鼠比較，睪丸體積更小，精子濃度降低且精子活性減弱；生精小管數(shù)量減少，管壁層數(shù)缺失和上皮細(xì)胞紊亂。Xrcc1 缺乏會(huì)誘導(dǎo)睪丸活性氧水平升高，線粒體功能障礙，使細(xì)胞凋亡、損害精子和喪失精原干細(xì)胞。Xrcc1 敲除的精原干細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸孵育細(xì)胞24 h 可以部分逆轉(zhuǎn)損傷，但不能恢復(fù)生育能力或改善細(xì)胞凋亡。

4.2 雄激素受體（AR）基因敲除

雄激素和AR 促使睪丸發(fā)揮正常生理功能，在小鼠睪丸體細(xì)胞及精子細(xì)胞中廣泛表達(dá)，缺乏則會(huì)發(fā)生睪丸女性化綜合征。AR 基因特異性敲除小鼠生殖細(xì)胞發(fā)育不完整并伴有數(shù)目減少分裂遲緩，血清睪酮水平降低，從而導(dǎo)致無精子癥及不育[25]。敲除小鼠睪丸中雖然仍有正常生殖細(xì)胞，但AR 基因敲除致使某些基因不能正常表達(dá)，難以維持支持細(xì)胞生理功能和管周肌樣細(xì)胞正常收縮，影響正常的精子發(fā)生和排出[26]。

4.3 Piwi 基因突變

Piwi 基因最早在果蠅卵巢中被發(fā)現(xiàn)，以維持生殖系干細(xì)胞（GSC）發(fā)育。在小鼠睪丸中3 個(gè)Piwi 同源基因均表達(dá)，且都與雄性生育能力有關(guān)[27]。Gou 等[28]在脊椎動(dòng)物Piwi 蛋白的N 端結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)保守的破壞框（D-box），在小鼠精子發(fā)生晚期，Miwi 蛋白依賴D-box 被泛素化和降解[29]。

在特異性D-box 突變敲入小鼠中[30]，Miwi 蛋白水平升高，表現(xiàn)為雄性全部不育，而雌性均表現(xiàn)出正常的生育能力。雄性突變小鼠睪丸平均重量降低25%，精子數(shù)量減少，喪失運(yùn)動(dòng)能力，且形態(tài)異常，大多數(shù)表現(xiàn)為向背彎曲。精子染色質(zhì)壓縮較少，只在晚期精子細(xì)胞中觀察到廣泛凋亡信號(hào)。Miwi D-box 區(qū)域缺陷更為嚴(yán)重。敲入小鼠Miwi 蛋白水平的升高，會(huì)直接抑制泛素連接酶的活性，晚期精子細(xì)胞中Miwi 蛋白無法被降解，組蛋白與魚精蛋白交換不完全，精子功能受損[31]。

5 總結(jié)

不育人數(shù)逐年上升，且有高達(dá)30%～40%的患者病因不明。利用動(dòng)物模型深入了解男性不育的病因和潛在的分子機(jī)制將為臨床治療提供依據(jù)。

在眾多造模方法中，化學(xué)方法最為經(jīng)濟(jì)、快捷、簡便，是目前研究機(jī)制較為成熟且適用最廣的。但其缺點(diǎn)在于，有些化學(xué)藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臟器有損傷，且部分化學(xué)藥物的使用劑量沒有統(tǒng)一的定論，使得成模率降低，造模死亡率上升。物理造模方法操作簡單，并且損傷部位針對(duì)性強(qiáng)，但是損傷程度不夠徹底，部分方法模型生殖能力會(huì)主動(dòng)恢復(fù)，不夠穩(wěn)定。基因敲除雖然指向性明確，但成本高昂，操作難度大，難以廣泛使用。手術(shù)方法造模，病變部位明確，與其他方法比較，不會(huì)造成其他臟器的損傷。這些造模方法各有優(yōu)劣，研究者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)室條件選擇合適的造模方法，為男性不育的臨床診治提供研究基礎(chǔ)。