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    青錢柳多糖提取分離技術(shù)研究現(xiàn)狀

    2021-01-04 01:52:02鄭春磊呂楊俊朱建紅蔣玉蘭潘俊嫻施昌衍王孔錫朱躍進(jìn)
    中國茶葉加工 2021年3期
    關(guān)鍵詞:青錢柳脫色色素

    鄭春磊,呂楊俊,朱建紅,蔣玉蘭,潘俊嫻,施昌衍,王孔錫,朱躍進(jìn)

    (1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院,浙江杭州 310016; 2.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310016;3.衢州市衢江區(qū)檢驗(yàn)檢測(cè)中心,浙江衢州 324022; 4.龍游圣堂茶業(yè)專業(yè)合作社,浙江衢州 324022;5.瑞安市云頂農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社,浙江瑞安 325200)

    青錢柳(Cylocaryapaliurus (Batal.) Iljinskaja)是我國特有的瀕危樹種,在降 “三高”、抗氧化、抗菌、抗癌等方面具有顯著功效[1-6],被譽(yù)為 “醫(yī)學(xué)界的第三棵樹”。 2013 年,國家衛(wèi)計(jì)委將青錢柳葉列為新資源食品[7],為其開發(fā)利用提供新契機(jī)。 研究表明,青錢柳多糖是青錢柳的主要功能成分,在青錢柳葉、根、枝、莖等各個(gè)部位均有分布,且以葉片中含量最高[8],具有降血糖、降血脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能[9-11]。 近年,有關(guān)青錢柳多糖的研究主要圍繞提取分離(純化)、功能評(píng)價(jià)及機(jī)制研究、分子修飾、 深加工產(chǎn)品開發(fā)等方面,其中提取分離(純化)是各領(lǐng)域研究開展的基礎(chǔ),亦是當(dāng)下青錢柳資源深加工開發(fā)利用的熱點(diǎn)之一。

    青錢柳多糖以分子量300 kDa 以上的大分子多糖為主(69.5%),由半乳糖、葡萄糖、 阿拉伯糖、鼠李糖等單糖組成,易溶于水,難溶于有機(jī)溶劑[12-15]。 當(dāng)前,青錢柳多糖的提制主要是在植物多糖提制方法的基礎(chǔ)上展開工藝優(yōu)化,包括提取和分離純化兩個(gè)模塊。 基于此,文章綜述了青錢柳多糖提取分離技術(shù)的研究現(xiàn)狀,以期為青錢柳多糖的提取分離、開發(fā)利用提供依據(jù)。

    1 青錢柳多糖提取技術(shù)

    1.1 熱水直接浸提

    植物多糖的提取技術(shù)已相對(duì)成熟,一般先采用熱水將多糖浸出,進(jìn)而利用多糖不溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì),加入無水乙醇等有機(jī)溶劑沉淀得到粗多糖[16-18]。 青錢柳多糖作為植物多糖的一種,通常也采用水提法進(jìn)行粗提[19]。 粗提過程主要受提取時(shí)間、溫度、料液比、次數(shù)等因素的影響,因不同植物間多糖的組成及理化特性存在差異,其提取參數(shù)也有所不同。

    研究表明,青錢柳在水提的條件下,其多糖得率與提取溫度(60~100 ℃)、次數(shù)(1~3 次)、時(shí)間(60~150 min)呈正相關(guān)性,與料液比(1∶6~1∶10)呈負(fù)相關(guān)性,并在較優(yōu)條件下趨于穩(wěn)定[15]。 謝建華等[15]研究表明,在90 ℃水浴條件下,影響青錢柳多糖得率的因素順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)>時(shí)間>料液比,且在優(yōu)化的工藝條件下(提取次數(shù)3 次,時(shí)間150 min,料液比1∶8),青錢柳多糖得率達(dá)6.54%。陳木森等[14]通過100 ℃水浴提取,正交優(yōu)化提取時(shí)間、料液比、pH 值等參數(shù),結(jié)果表明,影響青錢柳多糖得率的因素順序?yàn)椋?料液比>時(shí)間>pH 值,最佳工藝為料液比1∶20,時(shí)間7 h,pH 9.0。 此外,熱水浸提前,也可通過80%乙醇回流的方法脫除青錢柳葉中單糖、低聚糖、多酚、氨基酸等醇溶性雜質(zhì),水提后進(jìn)一步利用醇沉的方法沉淀獲得青錢柳粗多糖[20]。

    常規(guī)水提法具有操作簡(jiǎn)單、得率高、設(shè)備投入小等優(yōu)點(diǎn),是工業(yè)化提取植物多糖最為普及的方法,但也存在提取時(shí)間長(zhǎng)、高溫破壞多糖活性、浸提液量大濃縮耗時(shí)耗力等缺點(diǎn)。

    1.2 輔助提取

    為提高熱水直接浸提的效率,可通過稀堿處理、酶解、超微粉碎、超聲波、微波等技術(shù)進(jìn)行輔助提取[21-23],利用細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、熱效應(yīng)、機(jī)械作用及空化效應(yīng)等方式提高傳質(zhì)效率,加快可溶性固形物的浸出。

    1.2.1 超聲、微波輔助提取

    上官新晨等[24]利用超聲波法輔助提取青錢柳多糖,研究了超聲功率、時(shí)間、料液比對(duì)青錢柳多糖得率的影響,結(jié)果表明,超聲功率和時(shí)間是影響青錢柳多糖得率的關(guān)鍵因素,最佳提取工藝為:時(shí)間70 min,功率1200 W,料液比1∶10。 應(yīng)瑞峰等[25]采用青錢柳超微粉-超聲-微波復(fù)合法提取多糖,先通過超微粉碎技術(shù)對(duì)青錢柳進(jìn)行超微粉碎,提高比表面積,再結(jié)合超聲-微波技術(shù)進(jìn)一步提高多糖在熱水中的浸出率,通過參數(shù)優(yōu)化,青錢柳多糖得率和純度分別達(dá)10.02%、26.11%,不僅將提取時(shí)間縮短為20 min,同時(shí)顯著提高青錢柳多糖得率、純度及降血糖、抗腫瘤和抗氧化的生物活性。但超聲、 微波輔助提取法對(duì)設(shè)備和工人技術(shù)水平等要求較高,目前仍未在青錢柳多糖提取中工業(yè)化應(yīng)用。

    1.2.2 酶解輔助提取

    微生物發(fā)酵(酶解)法亦是破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、提高多糖浸出率的有效方法。 鄭曉杰等[26]公開了一種提取青錢柳多糖的方法,主要通過酶解-乙醇溶液超聲-二次酶解的工藝-熱水浸提的工藝提取制備青錢柳多糖,第一次酶解是為了去除單糖、雙糖、低聚糖、生物堿等雜質(zhì),第二次酶解是為了充分釋放多糖; 該法所得青錢柳多糖得率可達(dá)10.53%。 魯青等[27]采用微生物發(fā)酵法同步提取青錢柳多糖和黃酮,在纖維素酶、半纖維素酶酶解基礎(chǔ)上,接種黑曲霉、枯草芽孢桿菌等微生物,通過酶和微生物聯(lián)合處理破壞青錢柳細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),提高了青錢柳多糖和黃酮的提取率。 該法存在發(fā)酵提取時(shí)間長(zhǎng)(2 d),引入微生物菌體、次級(jí)代謝產(chǎn)物等新雜質(zhì)等問題,有待進(jìn)一步攻克。

    1.2.3 其他方法

    鄭曉杰等[28]發(fā)明了一種青錢柳脈沖電場(chǎng)提取裝置,該裝置包括速凍、 擊碎和高壓脈沖提取裝置,先通過液氮實(shí)現(xiàn)青錢柳的速凍,再利用擊碎裝置將速凍青錢柳擊碎,最后采用高壓脈沖提取裝置達(dá)到青錢柳多糖等內(nèi)含物質(zhì)的高效提取。 但該裝置的具體應(yīng)用實(shí)例未見報(bào)道。

    2 青錢柳多糖分離純化技術(shù)

    粗提制得的青錢柳多糖,多為黑褐色,純度較低(一般<30%),需要進(jìn)一步脫除色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì),進(jìn)而分離純化得到較高純度的多糖。

    2.1 脫色

    葉綠素、黃酮類、酚類、胡蘿卜素、皂苷類等色素是植物多糖的主要雜質(zhì)之一,影響產(chǎn)品純度及品質(zhì),同時(shí)對(duì)其定性定量分析和功能作用研究等存在干擾[29]。 植物多糖脫色方法通常有:活性炭法、過氧化氫法、柱層析法、離子交換樹脂法、反膠束法等,對(duì)于同時(shí)含有游離蛋白質(zhì)和色素的多糖,也可通過生成金屬絡(luò)合物的方法,同時(shí)除去蛋白和色素。 其中,活性炭法具有安全、無毒、可再生、易去除、不破壞多糖理化性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn),受到廣泛應(yīng)用,但該法脫色率偏低,對(duì)脂溶性色素和與糖結(jié)合性色素的脫除效果較差; 雙氧水法適用于與糖結(jié)合性色素的脫除;柱層析法對(duì)黃酮類、酚類等色素具有特異吸附脫除的作用。 謝建華等[29]研究表明,活性炭吸附法對(duì)青錢柳多糖具有良好的脫色效果,并優(yōu)化獲得最佳工藝條件:溫度40 ℃,時(shí)間20 min,活性炭用量1.0%,pH 值3.5。 但鮑若晗等[30]的研究表明,青錢柳多糖經(jīng)過超聲鋪助提取后(純度達(dá)16.5%),采用活性炭脫色,工藝為活性炭添加量0%~1.4%,脫色時(shí)間30~70 min,結(jié)果表明該工藝條件下活性炭脫色效果不明顯,且對(duì)多糖有較大的吸附。

    柱層析、 離子交換樹脂等方法在青錢柳多糖脫色中的應(yīng)用常以多糖特異性吸附純化為目的,雙氧水法主要通過氧化降解多糖中的色素類物質(zhì)達(dá)到脫色效果。 謝建華團(tuán)隊(duì)[31]研發(fā)了一種超聲-雙氧水結(jié)合大孔樹脂的青錢柳多糖的脫色方法,該方法采用雙氧水法降解色素,并利用超聲提高雙氧水的脫色效率,再通過AB-8 樹脂進(jìn)一步富集青錢柳多糖,起到雙效脫色的作用,脫色率可達(dá)80.1%,多糖保留了75.1%。 當(dāng)前,有關(guān)反膠束法在青錢柳多糖脫水中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

    2.2 脫蛋白

    天然植物多糖與蛋白的分子量相近,且兩者常常會(huì)形成糖蛋白復(fù)合物,因此多糖中蛋白的脫除率較低,往往還伴隨多糖的大量損失。 目前,植物多糖脫蛋白常用的方法主要包括Sevage 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶法等[32],前三種方法需要氯仿、正丁醇、三氟三氯乙烷、三氯乙酸等有機(jī)溶劑,存在操作人員安全危害、污水處理和環(huán)境污染等問題; 酶法脫除蛋白相對(duì)溫和,但成本高,易引入新的蛋白。 謝建華等[32]對(duì)比了Sevage法、三氯乙酸法、鹽酸法、酶法(胰蛋白酶)聯(lián)合Sevage 法等四種經(jīng)典脫蛋白方法對(duì)青錢柳多糖的脫蛋白效果,結(jié)果表明,四種方法均造成青錢柳多糖較大的損失,這可能是由于脫蛋白工藝引起多糖與蛋白復(fù)合物的損失。 其中,酶解和Sevage 聯(lián)用法在實(shí)現(xiàn)較高蛋白脫除率(47.72%)的同時(shí)能獲得最高的多糖得率(59.26%),說明此法較其他方法更適合于青錢柳多糖提取液中蛋白質(zhì)的脫除。

    2.3 純化

    經(jīng)蛋白和色素脫除處理后的多糖通常是不同分子量多糖的混合物,其化學(xué)組成、聚合度是不均一、多分散性的,可通過進(jìn)一步的純化得到較高純度的單一多糖。 純化方法常用有沉淀法、 層析法等,此外,還包括透析法、超速離心法、區(qū)域電泳法及膜技術(shù)等[33]。

    陳木森等[14]利用石油醚將青錢柳葉脫脂脫色,晾干后用水提取,所得濾液經(jīng)濃縮、Sevage 法脫蛋白、醇沉后,研究不同樹脂對(duì)青錢柳多糖的靜態(tài)吸附性能,篩選出一種吸附較好的樹脂(D301R),并利用柱層析進(jìn)行青錢柳多糖的純化研究。結(jié)果表明,D301R 樹脂對(duì)青錢柳多糖吸附量最大,較優(yōu)吸附條件為:吸附溫度30 ℃,pH7.0,濃度4.0 mg/mL,流速1.5 mL/min;較優(yōu)洗脫劑為0.4 mol/L NaCl,洗脫率達(dá)82.12%。 謝建華等[32]運(yùn)用Sephacryl-400 葡聚糖凝膠層析柱與大分子純化系統(tǒng)AKTA Purifier 100 聯(lián)用對(duì)精制后的青錢柳多糖進(jìn)行純化,獲得一個(gè)青錢柳多糖中的主要組分,通過一系列的理化性質(zhì)研究,表明該多糖為淺黃色粉末,溶于水,不溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有機(jī)溶劑。

    綜上可見,青錢柳多糖的提取分離技術(shù)以植物多糖常用的技術(shù)為主,且由于青錢柳產(chǎn)業(yè)化起步較晚,其工廠化提取分離多為粗提,分離純化較為少見。

    3 展望

    多糖是天然植物功能物質(zhì)研究的熱點(diǎn),其提取分離技術(shù)研究已有大量報(bào)道,為青錢柳多糖的提取分離奠定夯實(shí)的基礎(chǔ)。 然而,因青錢柳種子果皮堅(jiān)硬具有深休眠特性,自然育種率低(0.1%~0.2%)[34-35],且青錢柳為強(qiáng)陽性樹種,幼苗在林蔭環(huán)境下難以生長(zhǎng)[36],導(dǎo)致青錢柳自然林種群瀕臨滅絕,被列為國家二級(jí)保護(hù)樹種。 青錢柳資源較為稀缺、 青錢柳葉價(jià)格昂貴是青錢柳功能物質(zhì)提取分離產(chǎn)業(yè)化推廣的主要難題之一。 為降低青錢柳多糖的提取成本、提高得率,不少學(xué)者開始關(guān)注青錢柳多糖提取原料的篩選、培育。 上官新晨等[37]采用生物反應(yīng)器規(guī)模化生產(chǎn)青錢柳多糖,幾種大量營(yíng)養(yǎng)素對(duì)青錢柳懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)及多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響較大,正交試驗(yàn)結(jié)果表明:培養(yǎng)液中添加40 g/L 的蔗 糖、30 mmol/L 總氮、3 mmol/L Mg2+、3 mmol/L Ca2+,較利于青錢柳細(xì)胞多糖含量提高(37.95 mg/g)。生物反應(yīng)器法具有周期短、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),避免了青錢柳資源匱乏、栽種周期長(zhǎng)等問題,將為青錢柳功能成分的提取分離和開發(fā)應(yīng)用提供新出路。

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