補腎活血方對慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜小鼠血小板功能的影響

劉曉 秦蘭 李巍 費飛 吳雪琴

摘要?目的：觀察補腎活血方對血小板活化和聚集相關(guān)糖蛋白表達的影響，探討該方是否能夠通過改善血小板功能進而治療慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜（CITP）。方法：將60只小鼠隨機分為正常對照組、CITP模型組、醋酸潑尼松組和補腎活血方組。通過被動免疫造模法成功建立CITP小鼠模型，然后分別用0.9%生理鹽水、醋酸潑尼松和補腎活血方干預(yù)14 d，采用全自動動物血液分析儀檢測小鼠外周血血小板數(shù)量和凝血時間;采用流式細胞儀檢測各組小鼠血小板活化和聚集相關(guān)糖蛋白（CD41、CD61、CD62p、PAC-1）的表達。結(jié)果：與正常對照組比較，CITP模型組血小板顯著下降、凝血時間顯著延長。醋酸潑尼松、補腎活血方干預(yù)14 d后，與CITP模型組比較，其血小板顯著增加，凝血時間顯著下降;其糖蛋白CD41、CD61、CD62p和PAC-1的熒光強度和陽性率顯著下降。結(jié)論：補腎活血方能在一定程度上有效增加血小板數(shù)量和降低凝血時間，并且能夠通過改變血小板糖蛋白的表達進而改善血小板的功能，減輕患者的出血。

關(guān)鍵詞?補腎活血方;慢性免疫性血小板減少癥;血小板糖蛋白;血小板功能;血小板聚集;血小板活化;模型小鼠;凝血時間

Abstract?Objective：To observe the effects of Bushen Huoxue Formula on platelet activation and aggregation-related glycoproteins expression，and to explore whether the the Formula can treat CITP by improving platelet function.Methods：A total of 60 mice were randomly divided into a normal control group，a CITP model group，a Prednisone acetate group，and a Bushen Huoxue Formula group.The mouse model of CITP was successfully established by passive immune modeling，and then treated with 0.9% saline，Prednisone acetate and Bushen Huoxue Decoction for 14 days，respectively.The peripheral blood platelet count and clotting time of mice were measured by a full-automatic animal blood analyzer.The platelet activation and aggregation-related glycoproteins （CD41，CD61，CD62p and PAC-1） of mice in each group were measured by flow cytometry.Results：Compared with the normal control group，the platelets in the CITP model group were significantly decreased and the clotting time was significantly extended.After 14 days of intervention of Prednisone acetate and Bushen Huoxue Decoction，compared with the CITP model group，its platelets increased significantly，and the clotting time decreased significantly.The fluorescence intensity and positive rate of its glycoproteins CD41，CD61，CD62p and PAC-1 decreased significantly.Conclusion：Bushen Huoxue Decoction can effectively increase platelet count and reduce the coagulation time to a certain extent，and can improve the function of platelets by reducing the expression of platelet glycoprotein and reduce bleeding in patients.

Keywords?Bushen Huoxue Formula; Chronic immune thrombocytopenia; Platelet glycoprotein; Platelet function; Platelet aggregation; Platelet activation; Model mice; Clotting time

中圖分類號：R285.5文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.013

特發(fā)性血小板減少性紫癜（Idiopathic Thrombocytopenic Purpura，ITP）是一種由免疫介導(dǎo)的血小板破壞增多和巨核細胞產(chǎn)生血小板不足導(dǎo)致的臨床出血性疾病。兒童以急性ITP較為常見，而成人則以慢性ITP（CITP）較為常見。ITP患者常因血小板減少而導(dǎo)致出血風(fēng)險增加，但臨床部分患者僅有血小板減少而沒有出血癥狀[1-3]。目前，CITP并無有效的治療方法，但越來越多的研究顯示采用“健脾補腎”治療原則具有一定的治療效果[4]。我們課題組根據(jù)該原則自創(chuàng)的補腎活血方在治療CITP方面效果明顯[5-6]。前期我們研究發(fā)現(xiàn)，大部分患者使用補腎活血方后能使其血小板增加;有部分患者在使用補腎活血方后血小板增加并不十分明顯，但臨床出血癥狀卻得到了有效的改善，這提示我們補腎活血方可能是通過其他途徑來減少出血。本研究通過觀察補腎活血方對小鼠凝血時間和血小板糖蛋白（CD41、CD61、CD62p和APC-1）的影響，探討補腎活血方是否能夠通過改善血小板功能治療CITP，為補腎活血方治療CITP提供實驗依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?選取4～5周齡豚鼠10只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g;8周齡的SPF級健康BALB/c小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g。以上實驗動物均購自維世爾生物科技有限公司，動物許可證號：SYXK（湘）2018-001，室溫飼養(yǎng)，避強光、噪聲，自由進食和飲水。此項研究已通過新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：2018D01C288）。

1.1.2?藥物?補腎活血方：由淫羊藿、巴戟天、鎖陽、山藥、山萸肉、炙黃芪、補骨脂、丹參、川芎、牛膝、菟絲子、當(dāng)歸、白術(shù)、茯苓、香附、雞血藤、花蕊石、紫草、仙鶴草、連翹、炙甘草組成。由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院煎煮并制成浸膏，含生藥2 mg/mL。醋酸潑尼松溶液：用蒸餾水將醋酸潑尼松片（天津力生藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H12018809）配制濃度為1 mg/mL的溶液。將制備好的各種藥液儲存至4 ℃冰箱備用。

1.1.3?試劑與儀器?完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑（Sigma公司，美國，批號：556879）、FITC-CD41（SandCruz公司，美國，批號：338954）和PE-CD61（SandCruz公司，美國，批號：379845）熒光素標(biāo)記的單克隆抗體及陰性對照試劑IgG1-FITC（SandCruz公司，美國，批號：546872）和IgG-PE（SandCruz公司，美國，批號：568497）、FITC-CD62p（SandCruz公司，美國，批號：395746）和PE-PAC-1（SandCruz公司，美國，批號：385694）熒光素標(biāo)記的單克隆抗體及陰性對照試劑IgG1-FITC（SandCruz公司，美國，批號：546872）和IgG-PE（SandCruz公司，美國，批號：568497）。高速冷凍離心機（賽特湘儀，型號：H1650R）;全自動動物血液分析儀（HORIBA ABX公司，法國，型號：MSLMS9-5 Vet）;流式細胞儀（COUL TER公司，美國，型號：EPCICS ELITE）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?將60只BALB/c小鼠隨機分為4組：正常對照組，CITP模型組，醋酸潑尼松組，補腎活血方組，每組15只。正常對照組常規(guī)飼養(yǎng)，不造模。其余各組均按100 μL/（20 g·d）的劑量向小鼠腹腔內(nèi)注射1∶4稀釋的APS，連續(xù)8 d。制備豚鼠抗血小板血清：通過心臟取血獲得BALB/c小鼠血小板，洗滌后與佐劑混合。在豚鼠足掌、背及皮下多點注射，心臟取血分離血小板，即得豚鼠抗小鼠血小板血清（APS）。將制備的APS保存在-20 ℃冰箱。實驗前水浴解凍，洗滌后的BALB/c小鼠紅細胞（1∶1）吸附APS 2次，0.9%生理鹽水1∶4稀釋APS備用。

1.2.2?給藥方法?造模成功后各組每天均按0.1 mL/10 g體積藥物（正常對照組和CITP模型組灌注0.9%生理鹽水，醋酸潑尼松組和補腎活血方組分別灌注醋酸潑尼松溶液和補腎活血浸膏）灌胃干預(yù)，連續(xù)14 d。

1.2.3?檢測指標(biāo)與方法

分別在注射APS后8 h，分別從正常對照組小鼠和造模小鼠尾靜脈取血，EDTA-Na2抗凝并充分混合后，用全自動動物血液分析儀檢測小鼠血小板數(shù)目。實驗結(jié)束后，從4組中隨機各選擇10只小鼠進行尾靜脈取血，EDTA-Na2抗凝和枸櫞酸鈉并充分混合后，用全自動動物血液分析儀檢測小鼠血小板數(shù)目和凝血時間。

1.2.3.1?流式檢測小鼠血小板聚集功能?實驗結(jié)束后，將各組小鼠眼球取血;以2% EDTA-Na2 100 μL抗凝;加100 μL PBS;800 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，去上清液。3 000 r/min（離心半徑10 cm），離心10 min;加入PBS 100 μL;分別于各管加入CD41、CD61抗體及陰性對照IgG1-FITC、IgG-PE各10 μL，放置10 min;加入1%草酸胺溶液2 mL，以溶解紅細胞。放置10 min。3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，去上清液。加入PBS后，上流式細胞儀檢測。

1.2.3.2?流式檢測小鼠血小板活化功能?實驗結(jié)束后，將各組小鼠眼球取血。以2%EDTA-Na2 100 μL抗凝;加100 μL PBS;800 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，去上清液。3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min;加入PBS 100 μL;分別于各管加入CD62p、PAC-1抗體及陰性對照IgG1-FITC、IgG-PE各10 μL，放置10 min;加入1%草酸胺溶液2 mL，以溶解紅細胞。放置10 min。3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，去上清液。加入PBS后，上流式細胞儀檢測。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法?采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析試驗數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計量資料，采用t檢驗比較2組之間的均數(shù)，采用方差比較多組之間的均數(shù)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?ITP模型的驗證?通過采集正常對照組小鼠和CITP模型組小鼠尾靜脈血液檢測其血小板數(shù)量，結(jié)果顯示注射APS后，與造模前比較，模型組各時間段小鼠外周血血小板數(shù)量顯著下降（P<0.05），在4 d后降至最低（P<0.05），隨后血小板有所回升，但仍處于較低水平;符合慢性ITP模型小鼠的特征，表明建模成功。見表1。此外，造模后，與正常對照組比較，CITP模型組小鼠外周血血小板數(shù)量顯著下降（P<0.05）。見表2。

2.2?補腎活血方對ITP模型小鼠血小板和凝血時間的影響?實驗結(jié)束后，通過檢測各組小鼠血小板后發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，CITP模型組、醋酸潑尼松組和補腎活血方組外周血血小板數(shù)量顯著下降（P<0.05），與CITP模型組比較，用藥各組外周血血小板數(shù)量顯著升高（P<0.05）;且補腎活血方組提升血小板數(shù)量的效果更佳（P<0.05）。此外，通過檢測其凝血時間發(fā)現(xiàn)，CITP模型組凝血時間較正常對照組明顯延長（P<0.05）。用藥各組凝血時間均有不同程度縮短，其中補腎活血方的作用更為明顯，與CITP模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3?補腎活血方對CITP小鼠模型血小板聚集功能的影響?實驗結(jié)束后，采用流式細胞術(shù)檢測血小板聚集相關(guān)糖蛋白CD41和CD61，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，CITP模型組小鼠血小板糖蛋白CD41和CD61熒光強度和陽性率顯著下降（P<0.05）。用藥后，與CITP模型組比較，醋酸潑尼松組和補腎活血方組小鼠血小板糖蛋白CD41和CD61熒光強度和陽性率顯著增加，尤其是補腎活血方組的效果尤為明顯（P<0.05），但仍低于正常對照組。見表4～5。

2.4?補腎活血方對CITP小鼠模型血小板活化功能的影響?實驗結(jié)束后，采用流式細胞術(shù)檢測血小板活化相關(guān)糖蛋白CD62p和PAC-1，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，CITP模型組小鼠血小板糖蛋白CD62p和PAC-1熒光強度和陽性率顯著下降（P<0.05）。用藥后，與CITP模型組比較，醋酸潑尼松組和補腎活血方組小鼠血小板糖蛋白CD62p、PAC-1熒光強度和陽性率顯著增加，尤其是補腎活血方組的效果尤為明顯（P<0.05），但仍低于正常對照組。見表6～7。

3?討論

ITP是一種以血小板破壞過多、外周血小板顯著減少，并伴有骨髓巨核細胞發(fā)育成熟障礙的自身免疫性疾病[7]。ITP在成人中常以慢性為主，約占80%，這些患者在臨床上常存在皮膚黏膜出血，嚴重情況可導(dǎo)致內(nèi)臟或顱內(nèi)出血，且其出血風(fēng)險會隨年齡增長而增加，這是導(dǎo)致CITP患者死亡的主要原因[8-9]。因此，及時控制出血、提升血小板是治療CITP患者的主要目的。目前我國治療ITP的指南推薦一線治療為糖皮質(zhì)激素，但長期使用糖皮質(zhì)激素會導(dǎo)致感染，血壓、血糖升高，骨質(zhì)疏松，股骨頭壞死等不良反應(yīng)，同時使患者生命質(zhì)量下降[10]。因此，尋找其他能有效改善CITP患者出血癥狀且減少不良反應(yīng)是目前治療CITP患者的重中之重。中醫(yī)中藥在治出血性疾病方面有著悠久的歷史，積累了大量的經(jīng)驗，因此，以中醫(yī)中藥理論為指導(dǎo)，開展ITP的治療實踐和機制研究，在ITP的治療中具有重要意義。

當(dāng)代中醫(yī)學(xué)界對ITP病因比較一致的看法是：虛損為本、邪實為標(biāo)、虛實錯雜。目前許多中醫(yī)界的學(xué)者都認為脾腎虧損是導(dǎo)致ITP（包括急性、慢性和難治性ITP）發(fā)病的根本原因[11-12]。近年來中醫(yī)多采用辨證分型論治、固定治法（肝、脾、腎論治）[13-15]、固定方藥以及自制中成藥治療等方法治療ITP。通過之前的臨床研究，我們發(fā)現(xiàn)使用補腎活血方能改善CITP患者的臨床出血癥狀，在治療CITP患者中取得了較好的療效[16]。而此次通過動物實驗，我們發(fā)現(xiàn)大部分CITP小鼠通過使用補腎補血方后能有效地提升血小板數(shù)量;有一小部分小鼠提升血小板的效果雖然不理想，卻仍能明顯改善出血癥狀，但其相關(guān)機制目前卻未完全闡述清楚。

除血小板數(shù)量外，血小板功能也是血小板發(fā)揮止血作用的重要參數(shù)。目前，有關(guān)補腎活血法治療CITP的機制研究只要集中在免疫方面[17-18]，而補腎活血法對血小板功能影響的研究是比較少的。本研究主要從血小板活化和聚集功能方面探討補腎活血法治療CITP的機制。血小板聚集和活化是血小板發(fā)揮止血的2個重要環(huán)節(jié)。正常情況下，血小板一般都是出于靜息狀態(tài)（靜息血小板），當(dāng)血管受損后受到其他刺激后，血小板會被激活，黏附至受損區(qū)域，并釋放多種顆粒內(nèi)容物，從而促進快速止血。在血小板活化和聚集過程中，會釋放出多種具有特異性的標(biāo)志物，其中最有特征性的是CD41、CD61、CD62p和PAC-1[19-20]。

GPⅡb（CD41）和GPⅢa（CD61）是血小板膜表面表達最豐富的中的2種糖蛋白[21]，在血小板受誘聚劑作用下2種蛋白相互作用成能與纖維蛋白原結(jié)合的GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物。止血過程中該復(fù)合物在血小板的黏附、聚集、血塊收縮、血小板活化過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用。本研究通過流式檢測CD41和CD61來反應(yīng)血小板的聚集功能，通過研究發(fā)現(xiàn)，CITP小鼠CD41和CD61熒光強度和陽性率顯著下降，而在使用補腎活血方后，CD41和CD61熒光強度和陽性率顯著增加，這表明補腎活血方能明顯增加血小板的聚集功能。

CD62p和PAC-1是血小板活化的重要和早期標(biāo)志物，可直接反映血小板的活化狀態(tài)[22]。在正常情況下，CD62p少量表達在血小板表面，而PAC-1已單體形式存在，無法與配體結(jié)合。當(dāng)血小板發(fā)生活化后，CD62p會迅速、大量表達在血小板表面，而PAC-1則會與多種黏附蛋白特異性結(jié)合，進一步促進止血。本研究通過流式檢測CD62p和PAC-1來反映血小板的聚集功能，研究發(fā)現(xiàn)，CITP小鼠CD62p和PAC-1熒光強度和陽性率顯著下降，而在使用補腎活血方后，CD62p和PAC-1熒光強度和陽性率顯著增加，這表明補腎活血方能明顯增加血小板的活化功能。上述結(jié)果表明血小板糖蛋白的異?？赡軙苯佑绊懷“宓陌l(fā)揮其止血功能，這也可以解釋為什么臨床上有些CITP患者血小板數(shù)量較少但出血風(fēng)險較低，這也是本研究CITP小鼠使用補腎活血方后，血小板數(shù)量提升不明顯，但能有效改善出血癥狀的重要原因。

本研究首次探討了補腎活血方對ITP小鼠血小板活化和聚集功能的影響。但同時還存在一定局限性，本研究未研究補腎活血方對ITP小鼠血小板數(shù)量、功能及凝血時間的動態(tài)變化，因為這些變化有助于判讀補腎活血方在臨床上的治療效果，值得更深入地研究。

綜上所述，補腎活血方通過影響CITP模型小鼠血小板糖蛋白CD41、CD61、CD62p和PAC-1的表達水平;從而影響外周血小板的聚集和活化功能，加強止血效應(yīng)。此外，本研究也為補腎活血方治療CITP患者提供了理論支撐和實驗依據(jù)。

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（2020-03-18收稿?責(zé)任編輯：王明）