DNA條形碼等分子鑒定技術(shù)與動植物類中藥材的鑒定

張國林，邢以文，薛滿

蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，江蘇 蘇州 215000

由于中藥材種類繁多、來源復(fù)雜及市場利益的驅(qū)使，中藥材品種混淆、摻偽現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。因此，控制中藥材質(zhì)量對中醫(yī)藥的發(fā)展和人民用藥安全具有重要價(jià)值。中藥材鑒定是中藥質(zhì)量控制的首要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的中藥材鑒定主要基于來源、性狀(形狀、大小、顏色、表面特征、質(zhì)地、斷面特征、氣味、水試和火試等)、顯微和理化分析4種手段。傳統(tǒng)鑒定手段在中藥材鑒定中發(fā)揮了重要的作用，但這些方法容易受到藥材產(chǎn)地環(huán)境、生物學(xué)遺傳因素、加工和炮制方法等的影響，而導(dǎo)致重復(fù)性和穩(wěn)定性較差。DNA分子標(biāo)記技術(shù)在中藥鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用使得從基因?qū)用嫔线M(jìn)行中藥材鑒定成為現(xiàn)實(shí)，且具有準(zhǔn)確率高，不易受發(fā)育階段、組織部位和樣品形態(tài)及外界環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)。本文綜述中藥材DNA分子標(biāo)記與鑒定技術(shù)研究進(jìn)展，并分析DNA條形碼在藥用動植物類中藥材鑒定中的應(yīng)用，為中藥材質(zhì)量控制研究和應(yīng)用提供參考。

1 電泳技術(shù)和免疫技術(shù)與中藥材鑒定

動植物中藥材中含有大量的多肽和蛋白質(zhì)、酶、生物堿及有機(jī)酸等。電泳鑒別的原理是由于上述成分的電荷數(shù)和相對分子質(zhì)量不同而在電場中表現(xiàn)為不同的電泳方向、速度。同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳已成為中藥材鑒定和親緣關(guān)系分析的常用手段。在對海蛇曬干制品進(jìn)行酯酶同工酶染色分析時(shí)證實(shí),6種海蛇干品的中段腹部肌肉組織處理后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)采用酯酶同工酶方法可以有效地鑒定不同種類的海蛇干品[1]。驢皮、鹿角和龜甲等基原動物藥用部位含有豐富的蛋白質(zhì)，經(jīng)加工后蛋白質(zhì)會呈現(xiàn)彌散分布，但3種膠類中藥的蛋白相對分子質(zhì)量不同，而采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳及雙向凝膠電泳(2-DE)蛋白譜分析可以有效鑒別3種膠類成分[2]。

免疫鑒定法主要通過以中藥材中特有的蛋白質(zhì)為抗原制備特異性的抗體，并通過抗原-抗體的免疫反應(yīng)來進(jìn)行中藥材鑒定。免疫技術(shù)目前多用于動物類中藥材，尤其是親緣關(guān)系比較近的中藥材的鑒定[3- 4]。但近些年來關(guān)于免疫技術(shù)與中藥材鑒定的研究報(bào)道較少。

2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)與中藥材鑒定

RAPD是以人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列為引物，以基因組DNA為模板，通過DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對整個(gè)未知序列的基因組的多態(tài)性的分析。RAPD在中藥材的鑒定方面得到越來越廣泛的應(yīng)用[5]。徐蘇麗[6]以S3和S12 2種引物采用RAPD標(biāo)記法對中藥多花黃精和長梗黃精進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增產(chǎn)生的多態(tài)性譜帶能有效對2種中藥材進(jìn)行鑒定。同時(shí)，李敏等[7]通過回收RAPD擴(kuò)增篩選到的川麥冬分子標(biāo)記CM503基因建立了川冬的PCR鑒定方法。另外，RAPD技術(shù)在蛇類中藥飲片分子鑒定方面也有廣泛的應(yīng)用，對烏梢蛇、赤鏈蛇、金環(huán)蛇、赤練游蛇、灰鼠蛇、金錢白花蛇及其混偽品能進(jìn)行有效鑒定[8]。

RFLP是通過對限制性內(nèi)切酶酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，分析限制性片段長度的差異性,進(jìn)而分析物種間基因型的差異性，達(dá)到鑒定鑒別的目的[9]。RFLP是應(yīng)用最廣泛的中藥材鑒定的分子生物學(xué)方法之一。朱曉燕等[10]采用PCR-RFLP法對白茅根樣品的植物通用DNA條形碼內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)1、ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)ITS1和ITS2序列可作為不同性狀白茅根鑒別的DNA條形碼，且ITS2序列上Hpy CH4Ⅲ限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)可作為不同性狀白茅根的PCR-PFLP鑒別位點(diǎn)。已有的證據(jù)顯示，西洋參與人參DNA的ITS具有不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，西洋參ITS經(jīng)Hinf Ⅰ酶切后產(chǎn)生80、42 bp 2條片段，而人參經(jīng)酶切后仍為單一片段，提示RFLP可用于西洋參與人參的鑒定[11]。對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增后產(chǎn)物采用AluⅠ酶限制性酶切，正品紫草能被限制性內(nèi)切酶酶切為2條條帶而非《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版品不能被酶切，提示PCR-RFLP可鑒別紫草正品與非《中國藥典》2015年版品，且研究發(fā)現(xiàn)，市場流通大量紫草非《中國藥典》2015年版收載的新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.和內(nèi)蒙紫草A.guttata.Bunge[12]。

AFLP是通過擴(kuò)增雙酶切后的基因組DNA片段，并根據(jù)擴(kuò)增片段的長度多態(tài)性進(jìn)行鑒定的方法。AFLP分析對石斛、黨參等種質(zhì)資源遺傳多樣性研究和黨參原產(chǎn)地分析及引種指導(dǎo)方面具有重要的價(jià)值。采用AFLP法對50份云南優(yōu)異的紅花種質(zhì)資源材料進(jìn)行多態(tài)性分析時(shí)證實(shí)，云南紅花群體遺傳分化和遺傳多樣性較為復(fù)雜，遺傳變異主要在群體間發(fā)生，AFLP標(biāo)記技術(shù)能有效地揭示紅花種質(zhì)資源的遺傳多樣性[13]。采用AFLP分子標(biāo)記與高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜技術(shù)分析多個(gè)種群和居群的黨參的遺傳多樣性，可有效指導(dǎo)原產(chǎn)地分析和引種策略[14]。同時(shí)，簡單重復(fù)序列(ISSR)結(jié)合AFLP標(biāo)記技術(shù)能有效地對不同石斛種質(zhì)資源進(jìn)行鑒別，反映種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系，提示兩者結(jié)合可用于石斛資源的遺傳多樣性研究[15]。另外，利用AFLP標(biāo)記對貴州及周邊的薏苡種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性和聚類分析發(fā)現(xiàn)，6對AFLP引物擴(kuò)增出830條清晰條帶，而多態(tài)性條帶達(dá)742條，提示薏苡種質(zhì)交流頻繁，遺傳基礎(chǔ)狹窄，遺傳多樣性低[16]。

3 ISSR與中藥材鑒定

ISSR也稱為微衛(wèi)星序列標(biāo)記，同一物種不同位點(diǎn)或同一位點(diǎn)不同等位基因間由于突變會存在較大的差異性，可用于中藥材鑒定。牛樟樹腐朽內(nèi)壁寄生的牛樟芝是珍貴的藥用真菌。采用ISSR和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)分子標(biāo)記技術(shù)對福建省引種的牛樟種質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，10個(gè)ISSR引物組合共擴(kuò)增出237個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶占比88.6%，即ISSR結(jié)合SRAP分子標(biāo)記技術(shù)可用于牛樟種質(zhì)的鑒別[17]。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCoT)標(biāo)記結(jié)合ISSR標(biāo)記能穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行射干和川射干藥材的分子鑒定，而ISSR標(biāo)記可對射干及其混偽品進(jìn)行分子鑒定[18]。在分析ISSR分子鑒定技術(shù)鑒別茶枝柑及其近緣種的研究中也證實(shí)，在多條ISSR通用引物中篩選出的10條適合茶枝柑及近緣種的引物，可用于茶枝柑及近緣種的遺傳多態(tài)性分析，即ISSR也可作為茶枝柑及其近緣種的分子鑒別手段[19]。另外，采用11條多態(tài)性引物進(jìn)行ISSR分析能有效對多花黃精與長梗黃精進(jìn)行鑒別和遺傳多樣性分析[19]。

4 DNA條形碼在動植物類中藥材鑒定中的應(yīng)用

4.1 DNA條形碼及其用于中藥鑒定的流程

DNA條形碼是由加拿大科學(xué)家Paul Hebert最早提出的，指一段相對保守的較短的序列片段。DNA條形碼既有種屬的保守性，又有近緣物種的特異性，且不會受物種不同時(shí)期生長狀態(tài)的影響[20-21]。除了核基因條形碼序列外，動物線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基1(COⅠ)、細(xì)胞色素b基因(CytB)序列條形碼[22- 23]、植物類中藥材線粒體psbA-trnH序列條形碼[24]在中藥材鑒定中有著廣泛的應(yīng)用。

DNA條形碼用于中藥鑒定的主要流程為材料預(yù)處理(防止中藥材降解或有毒物質(zhì)產(chǎn)生)→DNA提取→特異性片段的擴(kuò)增→擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析→序列與藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(MMDBD)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所中藥DNA條形碼數(shù)據(jù)庫等標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫比對確認(rèn)最接近物種→構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

4.2 DNA條形碼與植物類中藥材的鑒定

4.2.1葉綠體psbA-trnH序列與植物類藥材的鑒定psbA基因編碼光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的D1蛋白，trnH基因編碼tRNA組氨酸。psbA-trnH序列位于psbA基因與trnH之間，是被子植物葉綠體基因組中變異位點(diǎn)最多的序列之一[24-25]。psbA-trnH序列具有較好的植物種間鑒別作用。利用psbA-trnH條形碼結(jié)合trnL-F條形碼2個(gè)DNA序列數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)了黑胡麻和多葉胡麻的鑒別[26]。萬如等[27]采用psbA-trnH基因作為條形碼對21份枸杞屬植物材料進(jìn)行鑒定，通過構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將航天誘變種與普通栽培種分成了兩大分支。何首烏具有明顯的遺傳變異特性，張宏意等[28]發(fā)現(xiàn)，psbA-trnH序列分析可從分子水平上對德慶道地種源何首烏和其他種源何首烏進(jìn)行有效鑒定和區(qū)分。研究也證實(shí)，psbA-trnH序列作為DNA條形碼能區(qū)分較近親緣關(guān)系的穿龍薯蕷與毛膠薯蕷，也能鑒別穿龍薯蕷和其他薯蕷屬植物[29]。psbA-trnH條形碼序列與其他序列組合能增強(qiáng)部分植物類藥材鑒定的時(shí)效性和準(zhǔn)確性[30-31]。將psbA-trnH+matK+trnL序列組合作為DNA條形碼可對野菊和藥用菊快速有效地鑒定[32]。太子參豐抗1號和黔太子參1號的psbA-trnH序列相似度為98.5%，而采用以psbA-trnH序列為主、ITS2序列為輔的DNA條形碼技術(shù)可有效對2種人工選育太子參品種進(jìn)行鑒別[33]。同時(shí)，以核基因ITS序列為主、psbA-trnH序列為輔可以準(zhǔn)確分析巴戟天地理分布與遺傳結(jié)構(gòu)的相關(guān)性[34]。

4.2.2ITS序列與植物類藥材的鑒定 ITS序列為rRNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，屬于核基因序列，具有進(jìn)化的保守型和種屬的特異性。ITS序列除了用于微生物的鑒定分型外[35]，也可用于中藥材的鑒定[36- 37]。在利用ITS2條形碼鑒定北沙參樣品時(shí)證實(shí)，12份樣品中有北沙參10份，川明參和祁木香各1份，即ITS2條形碼可用于北沙參鑒定的DNA條形碼[38]。除了種屬的鑒定外，還可以利用ITS條形碼序列進(jìn)行特色植物資源的調(diào)查[39]。透骨草具有活血止痛、祛風(fēng)除濕的藥理活性，是中醫(yī)外科的常用藥。由于透骨草基原復(fù)雜、同名異物較為普遍，故對其從分子水平上進(jìn)行鑒定有利于質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用。經(jīng)PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物雙向測序ITS2條形碼能準(zhǔn)確、高效地鑒定東北透骨草及其混偽品[40]。雖然一種藥用植物可采用多種DNA條形碼進(jìn)行鑒定，但不同條形碼在鑒定能力方面存在較大的差異性。海南大戟科植物具有清熱解毒、清淤散結(jié)的藥理活性，采用ITS、psbA-trnH、rbcL及matK等序列條形碼都可對海南大戟科植物進(jìn)行鑒定，但I(xiàn)TS2序列條形碼變異系數(shù)和信息位點(diǎn)系數(shù)最大，對大戟科植物的鑒別能力最強(qiáng)[41]。唇形科藥用植物具有清熱解毒、活血抗菌、抗癌消炎的藥理活性，但該科植物形態(tài)變異大，單純依靠經(jīng)典的鑒定方法存在較大的局限性。證據(jù)顯示，matK序列條形碼對唇形科植物的識別率高，而ITS2序列條形碼對唇形科植物的鑒定能力強(qiáng)，通過ITS序列和matK序列相結(jié)合可以對唇形科植物快速、準(zhǔn)確鑒別，并能有效闡明物種間的親緣關(guān)系[42]。在評價(jià)ITS2序列對川貝母及其近緣物種親緣關(guān)系時(shí)證實(shí)，ITS2序列能夠?qū)⒇惸竻^(qū)分為以平貝母和伊犁貝母為代表的北方貝母群和以浙貝母、川貝母為代表的南方貝母群[43]。ITS條形碼與其他條形碼的組合應(yīng)用可以提高植物類中藥材鑒定、鑒別的準(zhǔn)確性。在比較多種DNA條形碼鑒別沉香屬物種效果時(shí)證實(shí)，不同條形碼的鑒定效果強(qiáng)弱依次為matK>ITS2>rbcL>trnH-psbA，而為準(zhǔn)確鑒別沉香屬不同物種可采用matK+ITS2+rbcL序列的組合[44]。

4.2.3rbcL條形碼與植物類中藥材鑒定 核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶大亞基屬于葉綠體基因序列，具有豐富的序列變異信息，能夠作為中藥材鑒定的DNA條形碼[45-46]。rbcL作為陸地植物通用的DNA條形碼，單獨(dú)或與其他多基因片段組合可用于植物種群的鑒定、分類和遺傳多樣性研究[47]。葉綠體基因rbcL在不同種間和產(chǎn)地的浙貝母中序列高度保守[48]。陽春砂為“四大南藥”之一砂仁的主流品種，對濕濁中阻、嘔吐泄瀉效果好，但由于自然結(jié)實(shí)率低導(dǎo)致市場上出現(xiàn)較多的混淆品。陽春砂與其混淆品長柄豆蔻、白豆蔻、九翅豆蔻和云南豆蔻的rbcL條形碼序列存在10處堿基的差異，通過分析rbcL條形碼序列可有效區(qū)分陽春砂及其混淆品種[49]。rbcL條形碼也可與其他條形碼結(jié)合使用，進(jìn)一步提高鑒定的準(zhǔn)確度和效率，尤其是對于種內(nèi)變異明顯的品種。關(guān)蒼術(shù)種內(nèi)變異較大導(dǎo)致單一ITS條形碼無法進(jìn)行有效鑒定，而atpB序列和rbcL序列的組合可以有效解決種內(nèi)變異的問題[50]。組合了rbcL序列、ITS序列和trnS-G序列的DNA條形碼能對西藏地區(qū)紅景天屬的長鞭紅景天、大花紅景天和圣地紅景天有效鑒定[51]。另外，rbcL序列對貴州苗藥頭花蓼[52]和山慈菇[53]鑒定和遺傳研究均有重要的參考價(jià)值。

4.2.4matK條形碼與植物類中藥材鑒定matK序列是葉綠體trnK基因內(nèi)含子的一個(gè)開放閱讀框，具有進(jìn)化速率快、序列變化大的特點(diǎn)，能夠在種屬水平上提供較多的進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育信息，適于中藥材類的分子鑒定。野菊和藥用菊的干燥頭狀花序均可用藥，但功效有所不同：野菊用于解毒消癰，藥用菊對清熱疏風(fēng)效果好。陳芙蓉等[32]將matK序列條形碼聯(lián)合psbA-trnH和trnL序列組合作為DNA條形碼，實(shí)現(xiàn)了分子水平上對野菊和藥用菊的準(zhǔn)確鑒別。姜科植物具有益脾胃、理元?dú)獾乃幚砘钚?，且不同姜科種間matK序列均存在明顯差異，利用matK序列條形碼可對姜科植物進(jìn)行有效地分類鑒定[54]?；趍atK序列條形碼構(gòu)建的NJ聚類樹能對白頭翁及其常見偽品有效鑒定[55]，且matK條形碼結(jié)合ITS1和ITS2基因條形碼序列能夠?qū)崿F(xiàn)麗江糙蘇和黑花糙蘇及假秦艽在分子水平上的鑒別[55]。高良姜為“十大廣藥”之一，具有理氣止痛、溫中散寒的功效，但長期以來山姜、華山姜等多被混淆為高良姜流通和使用。通過建立matK基因條形碼的分子鑒定手段能夠有效區(qū)分高良姜與同屬的混偽品[55]。積雪草能清熱利濕、解毒消腫，與其混偽品過路黃、連錢草等的matK基因序列存在近百個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，通過matK序列條形碼可準(zhǔn)確、高效鑒定積雪草及其混淆品[56]。雞血藤與混偽品及雞血藤樣品內(nèi)的matK基因序列存在較大的A～G堿基差異性，而基于matK基因序列條形碼建立的聚類樹能準(zhǔn)確地鑒別雞血藤及其混偽品[57]。

4.3 DNA條形碼與動物類中藥材的鑒定

動物藥應(yīng)用有著悠久的歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》中收載了牛黃、龍骨、麝香、龜甲等67類動物藥，《中國藥典》2015年版中收錄了水牛角、水蛭、烏梢蛇、石決明和瓦楞子等多種動物類中藥材。傳統(tǒng)的動物類中藥材的鑒定方法包括感官、性狀和顯微鑒別。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用基于DNA條形碼序列的動物藥的分子鑒定應(yīng)用越來越廣泛。目前用于動物藥分子鑒定的DNA條形碼主要有COⅠ、ITS、CytB和rRNA等。

4.3.1COⅠ條形碼與動物藥鑒定COⅠ基因?qū)儆诰€粒體DNA序列。COⅠ基因進(jìn)化速率快，在多種動物中存在明顯的序列變異性，可用于親緣物種鑒定，其作為DNA條形碼鑒定動物藥已被《中國藥典》2015年版所收載[58]?；谛誀铊b別和COⅠ、16S rRNA和ATP6等DNA條形碼聯(lián)用可對鮑氏海馬進(jìn)行分子鑒定，保障海馬藥材的質(zhì)量[59]。海馬藥材的藥源緊張，導(dǎo)致市場上海馬藥材的摻偽現(xiàn)象嚴(yán)重，而三斑海馬的種間變異明顯大于種類變異，通過分析COⅠ、16S rRNA及ATP6條形碼序列可有效區(qū)分三斑海馬和偽品海馬，進(jìn)而規(guī)范海馬藥材的質(zhì)量和市場流通[60]。哈蟆油為珍稀名貴中藥材，但也存在混偽品多、鑒定困難等技術(shù)難題，而通過建立COⅠ基因條形碼可準(zhǔn)確鑒定蛤蟆油，且能區(qū)分正品蛤蟆油與青蛙油、牛蛙油等混偽品[61]。熊膽粉具有清熱、平肝、明目的藥理學(xué)活性，對目赤腫痛和咽喉腫痛等效果顯著，但目前熊膽粉的混偽品現(xiàn)象較為嚴(yán)重。許亞春等[62]對收集到的熊膽粉采取基于COⅠ基因條形碼分析鑒定后發(fā)現(xiàn)，黑熊和棕熊的熊膽粉各聚為一支，與混偽品明顯不同。水牛角具有清熱、涼血、定驚和解毒的功效，在《中國藥典》2015年版中收載的含有水牛角或水牛角濃縮粉的中成藥達(dá)44種。但目前,藥品市場上存在以牦牛角和其他牲畜角冒充水牛角銷售的現(xiàn)象。采用COⅠ序列的DNA條形碼技術(shù)對155份市售宣稱水牛角的樣品分析發(fā)現(xiàn)，牦牛角為水牛角主要的偽品來源，采用COⅠ序列條形碼可鑒定水牛角及其易混偽品[63]。應(yīng)用COⅠ序列條形碼對不同地區(qū)的蟾皮藥材、基原動物和混偽品鑒定，發(fā)現(xiàn)蟾皮藥材和混偽品屬于不同分支，即COⅠ序列條形碼能夠準(zhǔn)確鑒別中藥材蟾皮[64]。

4.3.2CytB條形碼與動物藥鑒定CytB屬于線粒體基因，編碼以鐵卟啉為輔基的色蛋白，進(jìn)化速度適中，是種內(nèi)和種間遺傳分析的重要標(biāo)記物。根據(jù)動物線粒體CytB基因的差異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)的CytB條形碼可用于動物制品及藥材的鑒定。李盈諾等[65]給CytB條形碼開發(fā)了一種多重PCR體系，可快速、靈敏、高通量地對摻假的動物來源成分進(jìn)行鑒定。林蛙油具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤肺的功效，屬名貴中藥材，但市場上存在牛蛙油、青蛙油等假冒林蛙油的現(xiàn)象。通過PCR擴(kuò)增CytB基因并進(jìn)行測序,證實(shí)CytB序列條形碼可作為林蛙油類藥材鑒定的分子標(biāo)記[66]。CytB條形碼鑒別蛇膽汁及其偽品的效果明顯優(yōu)于COⅠ條形碼和16S rRNA條形碼，且重復(fù)性和準(zhǔn)確度高，利于蛇膽汁的質(zhì)量控制[67]。根據(jù)梅花鹿、馬鹿與豬、牛、羊和鴨等的CytB基因序列的差異性建立的PCR-RFLP方法可鑒別鹿血及相關(guān)偽品[68]。CytB序列條形碼均能對穿山甲正、偽品進(jìn)行鑒定和聚類分析，有效提高穿山甲中藥材質(zhì)量控制的水平[69]。CytB條形碼可鑒別出燕窩的種及亞種，快速、準(zhǔn)確鑒別出燕窩基原，對混偽品進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分[70]。線粒體CytB基因條形碼也可對地鱉蟲(地鱉、冀地鱉)及其混偽品炮制藥材進(jìn)行分子水平的鑒定和區(qū)分[71]。

4.3.3rRNA條形碼與動物藥鑒定 rRNA為細(xì)胞內(nèi)含量最高的RNA，主要作用為在mRNA指導(dǎo)下將氨基酸合成蛋白質(zhì)。較多的證據(jù)顯示，rRNA序列條形碼可用于動物類藥材的鑒定。參照12S rRNA基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物能特異性擴(kuò)增烏賊DNA序列，該序列條形碼結(jié)合現(xiàn)有的DNA條形碼提高了烏賊鑒定的準(zhǔn)確度[72]。基于COⅠ和28S rRNA可進(jìn)行牡蠣種類多樣性及其分布特征的研究。采用2種條形碼結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，納入研究的232個(gè)牡蠣樣品可分為3屬、10種[73]。結(jié)合分析COⅠ、16S rRNA和12S rRNA 3種微型條形碼可鑒別中華穿山甲與其易混物種，提示基于16S rRNA的微型條形碼技術(shù)可有效鑒別中華穿山甲及其混偽品[74]。部分動物類中藥材可通過多種條形碼進(jìn)行鑒定和鑒別，但不同條形碼鑒別的準(zhǔn)確性和靈敏性存在差異。分析不同的DNA條形碼鑒別簾蛤目貝類發(fā)現(xiàn)，不同的條形碼都能在一定程度上完成鑒定，但COⅠ條形碼能夠鑒定57.1%物種，18S rRNA能鑒定16.7%的物種而16S rRNA能夠鑒定60.9%的物種[75]。對比COⅠ、16S rRNA和CR3種DNA種線粒體基因條形碼發(fā)現(xiàn)至少16S rRNA基因應(yīng)可作為脊椎動物標(biāo)準(zhǔn)條碼標(biāo)記[76]。

5 DNA條形碼鑒定中藥材存在的問題及應(yīng)用前景

5.1 DNA擴(kuò)增條件的探索

DNA條形碼鑒定中藥材首要步驟為DNA的提取及擴(kuò)增。DNA提取的質(zhì)量直接決定后期分析的準(zhǔn)確性。但對于使用部位為骨骼類、貝殼類、角甲類和皮膜類及分泌物等的中藥材，通常存在DNA含量低或降解嚴(yán)重的情況。針對此類中藥材，采用DNA條形碼鑒定時(shí)應(yīng)探索提高DNA提取效率的方法，防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

5.2 微條形碼的應(yīng)用

微條形碼是利用標(biāo)準(zhǔn)條形碼的一部分基因序列進(jìn)行物種鑒定的DNA序列。對于DNA降解嚴(yán)重的中藥材或者保存年代久遠(yuǎn)的樣本，宜探索DNA微條形碼鑒定手段，以避免DNA降解而無法擴(kuò)增造成的假陰性。微條形碼序列短、引物通用性強(qiáng)，能夠快捷、簡便地對物種進(jìn)行鑒定。與傳統(tǒng)DNA條形碼相比，微條形碼更容易從發(fā)生降解的樣本中獲得。

5.3 復(fù)合條形碼(宏條形碼)

復(fù)合條形碼是利用高通量測序技術(shù)對環(huán)境樣本中的所有基因涉及到的條形碼序列同時(shí)分析、鑒定多個(gè)物種的手段。復(fù)合條形碼極大地?cái)U(kuò)展了物種多樣性的研究范圍，對鑒別中藥方劑中多種動物藥和植物藥成分具有積極的價(jià)值。

5.4 DNA條形碼數(shù)據(jù)庫及多種條形碼的組合應(yīng)用

條形碼數(shù)據(jù)庫是動植物類中藥材鑒定的重要依據(jù)。目前，國內(nèi)外已經(jīng)構(gòu)建了DNA條形碼的關(guān)鍵性數(shù)據(jù)庫，如MMDBD和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所建立的中藥DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，且目前，《中國藥典》2015年版和歐美主流藥典收載的大多數(shù)藥材均已完成DNA條形碼鑒定研究：基于ITS2+psbA-trnH2個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合，初步建立了中藥DNA條形碼編碼系統(tǒng)。該中藥DNA條形碼編碼系統(tǒng)共有78 847個(gè)序列，隸屬于23 262個(gè)種，其中95%以上為中國、日本、韓國、印度、美國及歐洲等國家藥典中的藥材[77]。但應(yīng)當(dāng)指出的是，中藥材通常有不同來源、加工手段和儲存條件，采用單一的條形碼鑒定手段通常無法實(shí)現(xiàn)有效的鑒定。同時(shí)，中藥材中容易帶有細(xì)菌、真菌和寄生蟲等，容易在DNA提取和PCR擴(kuò)增過程中造成污染，最終影響鑒定的準(zhǔn)確性。而組合多種條形碼進(jìn)行中藥材的鑒定可以有效提高鑒定的準(zhǔn)確性。動植物的基原鑒定是中藥標(biāo)準(zhǔn)制定的重要參考，也是保證臨床用藥安全的前提和基礎(chǔ)。DNA條形碼技術(shù)能夠從分子水平上對道地藥材及其混偽品進(jìn)行有效鑒定，且具有較高的準(zhǔn)確性和時(shí)效性。在以后的工作中應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大DNA條形碼的覆蓋范圍，并增強(qiáng)微條形碼和多種條形碼組合的應(yīng)用范圍，更好地推進(jìn)為中藥材鑒定和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。