中藥道地性研究新技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展

劉杰，熊亮，周勤梅，彭成，郭力

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都 611137)

“道地藥材”始見于《牡丹亭》，《神農(nóng)本草經(jīng)》中所謂“土地所出，真?zhèn)侮愋?，各有其法”。《本草?jīng)集注》認(rèn)為“諸藥所生，皆有境界”[1]。歷代醫(yī)家很早就意識到了道地藥材的重要性。唐朝《新修本草》書中記載：“竊以動植物生，因方舛性，春秋節(jié)變，感氣殊功。離其本土，則質(zhì)同而異”。孫思邈的《備急千金要方》稱：“古之醫(yī)者，用藥必依土地，所以治十得九。”金代李杲在《用藥法象》云：“凡諸草木昆蟲，產(chǎn)之有地，失其地，則性味少異?！苯沂玖颂囟ǖ纳鷳B(tài)環(huán)境對藥材質(zhì)量的影響[2-3]，強調(diào)區(qū)分產(chǎn)地，講究道地的重要性。

道地性是多種因素綜合作用的結(jié)果，涉及藥材的種源、栽培技術(shù)、地理環(huán)境、采收時節(jié)以及加工炮制等多個環(huán)節(jié)。在中醫(yī)藥的發(fā)展歷程中，醫(yī)藥學(xué)家結(jié)合看、摸、聞、嘗及水試、火試的經(jīng)驗總結(jié)出了一些道地藥材的簡單辨別方法，如“潞黨參”具有明顯的獅子盤頭和疣狀突起；寧夏枸杞以個大飽滿、皮薄色紅、肉厚籽小、味甜微苦等為特點；茅蒼術(shù)根莖上含有大量朱砂點；以及關(guān)防風(fēng)的“蚯蚓頭”、黃芪的“菊花心”等等。傳統(tǒng)鑒別方法為藥材質(zhì)量保證提供了寶貴的經(jīng)驗[4-5]。但隨著引種、產(chǎn)區(qū)遷移、種源變化以及混淆品、摻雜品、偽品的層出不窮，包括附子新興產(chǎn)區(qū)的形成[6]、GAP基地與道地產(chǎn)區(qū)肉桂質(zhì)量類似[7]、丹參代用品擬建議加入丹參新來源等[8]。簡單的外觀性狀特征鑒別已不能滿足市場和生產(chǎn)的需求。同時道地產(chǎn)區(qū)藥材存在質(zhì)量參差不齊現(xiàn)象，使道地性研究進(jìn)展緩慢。技術(shù)的豐富帶來了諸多新設(shè)想，研究人員應(yīng)用DNA分子遺傳標(biāo)記、組織形態(tài)三維定量分析、中藥化學(xué)指紋圖譜和生物效價檢測等新技術(shù)，從遺傳物質(zhì)、表觀性狀、物質(zhì)基礎(chǔ)和生物效能等方面揭示中藥道地性的科學(xué)內(nèi)涵，為中藥道地性的研究提供參考。

1 DNA分子遺傳標(biāo)記

道地藥材的形成過程是基因與環(huán)境的雙重選擇，特定代謝產(chǎn)物的表達(dá)證明基因是道地性形成的關(guān)鍵因素之一[9]?；?qū)哟蔚奶接懼饕獊碜苑肿舆z傳標(biāo)記，包括DNA分子標(biāo)記和蛋白質(zhì)分子標(biāo)記[10]。從遺傳物質(zhì)出發(fā)，通過分析藥材的DNA多態(tài)性，發(fā)掘具有高度特異性的DNA片段，并對其進(jìn)行測序分析，從分子水平上揭示道地藥材中遺傳變異規(guī)律，進(jìn)一步闡釋道地藥材的遺傳成因。DNA分子標(biāo)記因其適用性廣得到更多的應(yīng)用，一般包括：AFLP、ISSR、RAPD、ITS和rRNA基因序列分析技術(shù)等類型[11-12]。

郝明干等[13]首次提出將AFLP結(jié)合 SCAR 標(biāo)記的分子技術(shù)應(yīng)用到中藥材道地性的鑒別中，通過繪制不同產(chǎn)地中藥材的AFLP指紋圖譜證明遺傳多樣性，分析道地性產(chǎn)區(qū)藥材的特異性差異帶，進(jìn)一步設(shè)計出特異性 PCR 鑒別引物和鑒定試劑盒，從分子水平上鑒定道地藥材。王嵐等[14]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對17個居群川芎進(jìn)行遺傳背景分析，提出與生境、化學(xué)成分結(jié)合是道地性研究的新思路。ISSR分子標(biāo)記已廣泛運用于枳殼[15]、石斛[16]、黨參[17]等道地藥材的遺傳多樣性評價。肖小河等[18]研究證明RAPD技術(shù)在正確鑒別姜黃屬不同種間群體的效果顯著，對種內(nèi)等級亦能進(jìn)行有效的劃分，可作為姜黃屬藥用植物的分類鑒定與道地性評價的新手段。結(jié)合聚類分析和化學(xué)圖譜技術(shù)對冬蟲夏草[19]、前胡[20]、廣藿香[21]和當(dāng)歸等藥材的道地性鑒別和形成機制進(jìn)行了初步探索，特定遺傳標(biāo)記的確立成為了道地性研究的新方向。Hon等[22]也提出微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)在鑒別人參植物學(xué)特性和起源上優(yōu)勢明顯，可以在DNA水平的遺傳分析上做到標(biāo)準(zhǔn)化。蔡朝暉等[23]對不同居群金銀花的5S-rRNA基因間區(qū)序列變異和綠原酸進(jìn)行分析，得出成分差異及道地性的成因皆為基因變異所致。周聯(lián)等[24]以異地同種姜科藥用植物陽春砂及市場流通品為研究對象，對其nrDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)序列進(jìn)行了測定和分析，發(fā)現(xiàn)6個陽春砂和綠殼砂的ITS-2序列完全一致，各樣品的5.8 S序列也完全一致，差異在于堿基位點的ITS-1上，提出ITS-1序列分析可評判陽春砂的道地性。遺傳物質(zhì)是藥材道地性形成的重要內(nèi)在因素，各種DNA分子標(biāo)記技術(shù)被逐漸應(yīng)用于中藥道地性研究。黃璐琦等[25]提出道地性是特定遺傳背景、表性、時間及空間的綜合交互產(chǎn)物，及其化學(xué)組成也有特征的自適應(yīng)性。故結(jié)合化學(xué)成分、環(huán)境尋找道地藥材特定基因，為道地性研究帶來啟發(fā)。

2 組織形態(tài)三維定量分析

三維重建是針對生物醫(yī)學(xué)方面組織形態(tài)學(xué)二維資料的局限性而建立的對形態(tài)學(xué)參數(shù)和模型直觀描述的技術(shù)。三角形面元以及NURBS (非均勻有理B樣條)曲面的三維重建可實現(xiàn)復(fù)雜中藥特征的三維重建與動態(tài)顯示[26]。肖小河等[27]首次對中藥組織三維動態(tài)及形態(tài)參數(shù)進(jìn)行測定，描述了中藥材麥冬的特征，劉峰群等[28]進(jìn)一步綜合應(yīng)用顯微圖像分析、Mas-Ⅱ計算機圖像分析系統(tǒng)，成功地鑒別了不同產(chǎn)地麥冬。此外，肖小河等還成功構(gòu)建了郁金類中藥(黃絲郁金、綠絲郁金、溫郁金和桂郁金)的圖像[29]，建立了黃連(多源道地藥材)和姜黃屬藥用植物的顯微鑒定模式識別系統(tǒng)[30-31]。馮建紅等[32]利用等距抽樣法對兩個產(chǎn)地的防風(fēng)體視學(xué)參數(shù)的測定，較客觀地反映了各種組織的計量特征，已用于防風(fēng)藥材的產(chǎn)地鑒別。在凌秀華[33]的研究中發(fā)現(xiàn)福建和貴州太子參的區(qū)別表現(xiàn)在藥材表面皺裙程度的不同，玉竹不同產(chǎn)地藥材的橫切面組織特征皆存在顯著性差異?；诮M織形態(tài)三維可獲得的直觀圖像，形象反映其他鑒別方法難于識別的道地藥材及其近緣品種和易混淆品種的區(qū)別。在研究道地中藥性狀鑒別過程中進(jìn)一步結(jié)合計算機圖像分析、顯微圖像分析等技術(shù)，是傳統(tǒng)的鑒別技藝在現(xiàn)代的延續(xù)與創(chuàng)新，是更準(zhǔn)確、客觀地描述出道地性藥材的鑒定特征的方法。

3 中藥化學(xué)指紋圖譜以及含量測定

中藥化學(xué)指紋圖譜是對中藥化學(xué)成分信息的整體表征，是中藥材質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b定的重要手段。其中，高效液相(HPLC)、紅外光譜(IR)指紋圖譜最為常用，除此以外還包括了薄層色譜(TLC)、紫外光譜(UV)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)指紋圖譜等[34-35]。結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對中藥道地性成分進(jìn)行追蹤，使得中藥道地性研究具有一定的導(dǎo)向性[36]。

3.1 高效液相色譜

高效液相指紋圖譜是表征中藥化學(xué)成分整體性和特征性的常用技術(shù)。陳皮為傳統(tǒng)道地藥材，是廣東三寶之首、十大廣藥之一，據(jù)其產(chǎn)地的不同分為陳皮和廣陳皮[37]，然在藥典中的鑒別方式都是以其橙皮苷的含量來界定[38]。針對其道地性帶來的價格和效果差異而產(chǎn)生偽品、次品的問題，羅艷等[39]研究人員建立了32批廣陳皮藥材和10批陳皮藥材的HPLC指紋圖譜，確定了17個共有峰、3個特征峰群，發(fā)現(xiàn)10批陳皮的共有模式并無特征峰A；且雖有特征峰群B、C，但二者的峰面積比例較32批廣陳皮藥材共有模式差異大，可作為道地性鑒別的重要條件。Miao等[40]對江油、布拖以及云南等產(chǎn)地的附子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)江油道地產(chǎn)區(qū)附子有苯甲酰烏頭原堿特征峰，同時提出苯甲酰新烏頭原堿與新烏頭堿、單酯型生物堿與雙酯型生物堿的比例也可能是附子道地性標(biāo)志之一。Wang等[41]建立了甘肅定西地區(qū)當(dāng)歸的HPLC指紋圖譜，對比于其它產(chǎn)區(qū)的當(dāng)歸具有顯著的差異性，可用于當(dāng)歸的道地性評價。蘇建春等[42]建立了不同產(chǎn)地的黃芩的UPLC指紋圖譜，初步分析構(gòu)建了這幾個批次黃芩的判別函數(shù)模型，且對黃芩的產(chǎn)地判別正確率達(dá)到了96.9%。金立陽等[43]通過對四川、廣西兩地澤瀉的HPLC-MS/MS結(jié)合不同分析手段，篩選出6種主要差異性成分，并提出采用差異性最大的澤瀉醇B的限量進(jìn)行產(chǎn)地的區(qū)別。

3.2 紅外光譜

紅外光譜技術(shù)以其操作簡單、無損化、檢測速度快等優(yōu)點而被應(yīng)用于藥材產(chǎn)地的鑒別。孫素琴等[44]通過對不同產(chǎn)區(qū)45批次的山藥進(jìn)行了紅外指紋圖譜的建立并結(jié)合聚類分析的方法，得出道地與非道地的分析模型的區(qū)別極為顯著。Fan等[45]研究人員通過天麻的FT-IR測定，提出光譜耦合分析、成分分析和偏最小二乘-判別分析的結(jié)合可以作為不同產(chǎn)地天麻的鑒定手段。萬洪善等[46]對姜黃紅外指紋圖譜結(jié)合模式識別和雙指標(biāo)分析，建立起分?jǐn)?shù)評定方法可對不同產(chǎn)地姜黃進(jìn)行鑒別。此外，研究者們應(yīng)用近紅外指紋圖譜法對黨參[47]、黃柏[48]以及蒼術(shù)[49]等具有明顯道地性的藥材進(jìn)行鑒別，為道地性藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣提供了參考。

3.3 太赫茲時域光譜

太赫茲時域光譜是新興的以太赫茲波為基礎(chǔ)發(fā)展而來的一種無損檢測技術(shù)，已經(jīng)運用于許多領(lǐng)域中。太赫茲時域光譜在中藥的研究領(lǐng)域，大多數(shù)研究的是中藥材中所含的代謝物，其在光譜范圍內(nèi)的低頻振動和轉(zhuǎn)動模式，為中藥材的研究提供新的光譜特征信息和鑒別依據(jù)[50-52]。徐哲等[53]運用光譜匹配算法對不同產(chǎn)地的雞血藤和大血藤進(jìn)行了區(qū)別鑒定。張建等[54]運用雙指標(biāo)序列法分析太赫茲光譜，成功建立對不同產(chǎn)地、不同品種莪術(shù)的區(qū)分方法。田珺宏[55]基于可視化算法和自編碼理論，建立了以川芎、羌活和貝母為例的產(chǎn)地、規(guī)格種類的鑒別方法。郭帥[56]也通過太赫茲頻譜折射率和吸收系數(shù)的差別對牛膝、貝母等中藥的產(chǎn)地進(jìn)行鑒定。李小霞等[57]研究人員在對附子進(jìn)行太赫茲分析時提出吸收系數(shù)同制樣方法可以作為附子道地性鑒別需考慮的重要因素。

3.4 其它化學(xué)成分分析技術(shù)

隨著儀器分析技術(shù)的快速發(fā)展，多種分析手段的聯(lián)合應(yīng)用也在不斷加強，為中藥質(zhì)量的精準(zhǔn)把控提供了有力的保障。李然等[58]應(yīng)用GC-MS指紋圖譜技術(shù)，結(jié)合聚類分析和主成分分析，建立了平江白術(shù)的質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。黃璐琦等[59]通過GC-MS分析發(fā)現(xiàn)道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)蒼術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素、蒼術(shù)醇和β-桉葉醇的含量及比例上存在顯著差異，進(jìn)一步研究提出環(huán)境因子和遺傳因子的共同作用是道地藥材形成的關(guān)鍵因素。人參自古以來擁有“百草之王”的美譽，是東北三寶之首[60]，Yin等[61]通過對人參皂苷含量及其合成酶活性的研究，發(fā)現(xiàn)總皂苷含量與人參皂苷Re含量呈顯著相關(guān)，進(jìn)一步對其含量與HMGR、DS基因表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，可作為人參產(chǎn)地鑒別的新方法。Yuan等[62]應(yīng)用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法建立了數(shù)十個產(chǎn)區(qū)浙貝母的元素指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)鎳元素為不同產(chǎn)區(qū)浙貝母中最具特征的元素，并可以作為鑒別浙貝母的方法。吳輝貴[63]首次將 CPMG 技術(shù)、STOCSY、二維 HSQC 和 HMBC 的結(jié)合應(yīng)用于不同產(chǎn)區(qū)杜仲化學(xué)成分分析，建立了杜仲的核磁共振指紋圖譜，并運用于闡釋杜仲藥材的道地性。王蔚昕[64]通過電子鼻技術(shù)分析了不同產(chǎn)地當(dāng)歸的氣味，構(gòu)建了較為準(zhǔn)確當(dāng)歸道地產(chǎn)區(qū)的判別模型。

4 生物效價評價

生物效價測定是依據(jù)臨床功效對中藥的內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行評價，通過中藥的主治和毒效，經(jīng)由相關(guān)的藥理作用直觀反映中藥品質(zhì)[65]，是近年來發(fā)展用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、理化方法不能測定其含量、或不能反映其臨床生物活性的藥物評價方法。目前，研究者們利用生物效價對板藍(lán)根[66]、薏苡仁[67]和大黃[68]等多種藥材的質(zhì)量進(jìn)行評價。肖小河等[69]首次提出將生物效價檢測引入對道地中藥研究中，并成功對不同產(chǎn)地黃連進(jìn)行了準(zhǔn)確的辨識[70]。陳二林等[71]從當(dāng)歸的活血角度出發(fā)，選擇抑制血小板聚集為指標(biāo)，利用生物評價模式對當(dāng)歸活血功效的差異性進(jìn)行了考察，提出此法可以作為不同產(chǎn)地當(dāng)歸綜合評價的依據(jù)。梁美美等[72]建立體外纖溶生物活性檢測方法評價地龍產(chǎn)地和炮制方法帶來的影響。王叢等[73]綜合抗菌、抗病毒作用以及穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測定對不同產(chǎn)地穿心蓮進(jìn)行質(zhì)量控制。Wu等[74]提出綜合生物效價和生物標(biāo)志物是對中藥質(zhì)量進(jìn)行評價的新視角。該評價體系直接與臨床療效密切相關(guān)，是中藥鑒別和質(zhì)量評價“唯成分論”傳統(tǒng)模式研究的補充和完善。在產(chǎn)區(qū)為主導(dǎo)的情況下，環(huán)境、基源、栽培技術(shù)、炮制加工等也對藥材活性產(chǎn)生影響。生物效價評價作為道地藥材的參考標(biāo)準(zhǔn)還需進(jìn)行深入研究[65]。

5 討論與總結(jié)

中藥是一個多成分多靶點發(fā)揮作用的復(fù)雜體系，隨著研究的深入，以臨床為導(dǎo)向的中藥“品-質(zhì)-性-效-用”一體化研究已成為現(xiàn)代中藥研究的關(guān)鍵[75]。道地藥材即是醫(yī)藥學(xué)家基于中藥臨床療效優(yōu)選的產(chǎn)物。在“眼看、手摸、鼻嗅、口嘗”鑒別的傳承和發(fā)展基礎(chǔ)上，應(yīng)用DNA分子遺傳標(biāo)記、組織形態(tài)三維定量分析、中藥化學(xué)指紋圖譜和生物效價檢測等新技術(shù)，從遺傳物質(zhì)、表觀性狀、物質(zhì)基礎(chǔ)和生物效能等方面揭示中藥道地性的科學(xué)內(nèi)涵，為科學(xué)研究者提供一定的參考。目前，道地性的研究仍然是中藥研究中亟待突破的難點。它是一個綜合因素作用后形成的復(fù)雜體系，研究雖然已發(fā)現(xiàn)多種道地性藥材存在一定的特征性，但大多研究較為孤立和局限，未深入探究中藥道地與差異之間的關(guān)聯(lián)，因此形成一套道地性藥材評判體系具有重要的指導(dǎo)意義。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的分析技術(shù)可用于中藥道地性多層次的研究，同時也將不斷的融入其它的先進(jìn)技術(shù)，如質(zhì)譜成像技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜-核磁共振(LC-MS-NMR)聯(lián)用技術(shù)等。值得一提的是需要加強道地性的綜合性評價和分析，通過從不同產(chǎn)地大樣本量進(jìn)行統(tǒng)計分析，以獲得可靠的數(shù)據(jù)，不斷追溯產(chǎn)生道地性的原因，揭示道地性差異的物質(zhì)基礎(chǔ)，將其與藥效學(xué)評價相結(jié)合，進(jìn)而系統(tǒng)全面地闡釋道地性藥材臨床應(yīng)用的優(yōu)越性。

道地性藥材是中醫(yī)藥的基石，是道地性理論的載體，充分體現(xiàn)中醫(yī)藥理論內(nèi)涵。道地性的研究任重而道遠(yuǎn)。為傳承中藥道地性的精髓，推動中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，國家出臺了《全國道地藥材生產(chǎn)基地建設(shè)規(guī)劃(2018—2025年)》，明確提出推進(jìn)中藥材規(guī)范化種植。文山三七[76]、集安人參[60]、江油附子[77]規(guī)范化種植帶來的市場認(rèn)可有力地證明了GAP基地建設(shè)的必要性。區(qū)域控制標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一，GAP規(guī)范化種植可有效地改善同一產(chǎn)區(qū)藥材存在質(zhì)量差異的問題。另外，存在道地藥材產(chǎn)區(qū)變遷的中藥材，如黃芩、丹參，姜黃和郁金等[78]，需加快對其進(jìn)行本草考證，促進(jìn)對道地藥材新舊產(chǎn)區(qū)的評估認(rèn)證，做到有跡可循、有理可依。