哇巴因的抗腫瘤作用及其機制的研究進展

彭連杰 孫 暢 胡 晶 劉家輝

1.重慶醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，重慶 400016； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，重慶 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院 臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室，重慶 400016

惡性腫瘤治愈率低，死亡率高，嚴(yán)重危害人類生命健康。尋求惡性腫瘤的特效治療方法以提高患者生存率和治愈率已成為醫(yī)學(xué)界人士的首要目標(biāo)之一。哇巴因（Ouabain）主要來源于夾竹桃科植物苦毒毛旋花，可抑制細(xì)胞膜上Na+/K+-ATP酶，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，心肌收縮力增強，故臨床上常用于心力衰竭等疾病[1]。1967年Shiratori[2]首次證實哇巴因可在體外抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖后，哇巴因在抗腫瘤方面的作用逐漸受到重視。愈來愈多的研究表明，哇巴因?qū)Χ喾N腫瘤細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用，且對部分類型腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較好的選擇性。但具體機制尚未完全明確。針對哇巴因抗腫瘤作用及其相關(guān)機制的研究有望解決傳統(tǒng)腫瘤治療方法所面臨的治愈率低、耐藥性高等問題，為腫瘤治療提供新思路。本研究將對哇巴因用于腫瘤治療及其機制研究的新進展做一綜述，以期能對后續(xù)研究者有所啟發(fā)。

1 哇巴因在腫瘤治療中的作用及其機制

1.1 抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

近年來，許多研究表明，哇巴因?qū)Χ喾N腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用并能誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，包括食管腫瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞等，其相關(guān)機制非常復(fù)雜，至今尚未完全闡明。如Meng等[3]使用不同濃度哇巴因處理人Burkitt's淋巴瘤Raji細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著哇巴因濃度增大，出現(xiàn)Raji細(xì)胞的增殖抑制率顯著增大、cleaved-caspase-3和caspase-3水平升高、Bax活性升高和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低且自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)上調(diào)等變化，這表明了哇巴因?qū)urkitt's淋巴瘤Raji細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡和自噬，且其作用效果表現(xiàn)出濃度依賴性。哇巴因抑制腫瘤細(xì)胞增殖可能與Sox基因家族有關(guān)。程中華等[4]發(fā)現(xiàn)人食管OE19腫瘤細(xì)胞經(jīng)哇巴因處理后生長減緩、細(xì)胞死亡增加、Sox4 mRNA和Sox4蛋白相對表達(dá)量顯著降低、Sox4基因表達(dá)也顯著減弱，提示哇巴因可下調(diào)Sox4基因的表達(dá)從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，抑制其增殖。Lin等[5]的研究顯示哇巴因還可通過下調(diào)p38 MAP激酶6（MKK6）抑制人食管腺癌EAC細(xì)胞系（OE33和OE19）的增殖，進一步分析表明，這與MKK6受到抑制而導(dǎo)致Sox9轉(zhuǎn)錄因子水平降低有關(guān)。除Sox基因家族外，Akt/mTOR信號通路可能也參與了哇巴因抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的過程。有報道稱哇巴因?qū)θ松窠?jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞具有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，并提出這一作用可能與其下調(diào)HIF-1α、Akt、m TOR、p-mTOR的表達(dá)及上調(diào)Nrf2、p-Akt的表達(dá)有關(guān)[6]。此外，楊小颯等[7-9]也發(fā)現(xiàn)哇巴因可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Akt / mTOR信號通路并抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)從而劑量依賴性地抑制人腦膠質(zhì)瘤U-87MG細(xì)胞的生長，減弱細(xì)胞的移動性并導(dǎo)致其凋亡。哇巴因的這一作用還涉及對Wnt/β-catenin通路的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)哇巴因可以選擇性殺傷大腸癌細(xì)胞HCT116和肺癌細(xì)胞A549，并能誘導(dǎo)其凋亡，并證明這種效果可能與哇巴因作用于LRP6和β-catenin分子抑制Wnt/β-catenin通路有關(guān)[10]。此外，哇巴因可能還通過影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝而抑制其增殖。有研究者發(fā)現(xiàn)，哇巴因可通過AMPK信號通路抑制細(xì)胞內(nèi)線粒體的氧化作用，促使其進行糖酵解從而減少ATP的產(chǎn)生，抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖[11]。哇巴因介導(dǎo)的抑制細(xì)胞增殖和促進細(xì)胞凋亡的作用對部分腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出選擇性，其作用途徑因腫瘤細(xì)胞種類不同而有差異，確切機制仍有待進一步探究。

1.2 激活細(xì)胞自噬

自噬是指真核細(xì)胞通過溶酶體降解自身胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的過程，屬于程序性細(xì)胞死亡機制的一種，其與腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療之間的關(guān)系十分密切[12]。最近有研究表示哇巴因可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬而死亡[13-14]。哇巴因可使腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增多，通過激活細(xì)胞自噬而死亡。Trenti等[13]的研究表明哇巴因可通過激活JNK（c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶）而引起B(yǎng)cl-2減少，破壞Bcl-2與Beclin 1間的抑制性相互作用，從而促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡[13]。此外，Rupaimoole等的研究也證明哇巴因可增強肺癌細(xì)胞對MicroRNA-34（miR-34）治療的敏感性，哇巴因與MicroRNA-34協(xié)同作用可增強細(xì)胞自噬而殺死肺癌細(xì)胞和miR-34a缺失的類似癌癥的癌細(xì)胞[14]。

1.3 哇巴因與Na+/K+-ATP酶

Na+/K+-ATP酶最主要的配體是包括哇巴因在內(nèi)的強心甾類固醇（cardiotonic steroids，CTS），與CTS結(jié)合后，可觸發(fā)多種細(xì)胞信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化或促進自噬或凋亡[15]。這些效應(yīng)通常取決于細(xì)胞類型以及CTS的類型和濃度。

在腫瘤發(fā)生的早期Na+/K+-ATP酶α1-亞型高表達(dá)，在晚期低表達(dá)，從而促進α3-亞型表達(dá)的增強，這提示Na+/K+-ATP酶不僅可以作為生物標(biāo)志物，而且可能作為腫瘤的治療靶點[16]。糖蛋白非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤蛋白B（GPNMB）在多種腫瘤中均有過表達(dá)，Ono等在小鼠膠質(zhì)瘤模型和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的腫瘤中發(fā)現(xiàn)這種蛋白和Na+/K+-ATP酶α亞基存在相互作用，Na+/K+-ATP酶抑制劑哇巴因可抑制高表達(dá)GPNMB轉(zhuǎn)基因小鼠注射膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤生長，并阻斷GPNMB誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移[17]。Cetinkaya等通過檢測接受放化療前后的非小細(xì)胞肺癌和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者與健康對照的Na+/K+-ATP酶活性差異發(fā)現(xiàn)，放化療完成前，患者組Na+/K+-ATP酶酶活性較對照組明顯升高，放化療結(jié)束后Na+/K+-ATP酶活性較放化療前明顯降低，但仍高于健康對照組，這提示靶向該酶可能是對抗非小細(xì)胞肺癌和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一種新手段[18]。有研究發(fā)現(xiàn)與非致瘤性乳腺細(xì)胞系相比，Na+/K+-ATP酶在乳腺癌中的基線表達(dá)和活性均增強，用哇巴因處理后其活性被抑制，從而顯著降低了乳腺癌細(xì)胞的增殖、運動、侵襲[19]。另外，低濃度的哇巴因在不影響Na+/K+-ATP酶活性的情況下仍可阻止癌細(xì)胞生長。除了由于激活下游信號通路級聯(lián)反應(yīng)外，最新研究指出其可能機制是心苷類物質(zhì)與Na+/K+-ATP酶相互作用，刺激活性氧的產(chǎn)生，并明顯激活膜微區(qū)內(nèi)的體積調(diào)節(jié)性陰離子通道（volume regulated anion channel，VRAC），從而產(chǎn)生抗增殖作用[20-21]。

1.4 化療耐藥性逆轉(zhuǎn)

化療目前作為一種治療腫瘤的有效手段在臨床上被廣泛應(yīng)用，但腫瘤細(xì)胞對常用化療藥品的耐藥性逐漸成為腫瘤治療無效或疾病復(fù)發(fā)的主要原因。有研究表明，哇巴因可以逆轉(zhuǎn)肝癌和食管癌等腫瘤細(xì)胞對抗癌藥產(chǎn)生的耐藥性。Shen等的研究表明哇巴因不僅可在體外逆轉(zhuǎn)人食管癌耐藥株EC109/CDDP細(xì)胞的對順鉑（CDPP）的耐藥性并能在小鼠體內(nèi)逆轉(zhuǎn)EC109/CDDP細(xì)胞裸鼠移植瘤對CDPP的耐藥性，并提出這種效應(yīng)與哇巴因抑制β-catenin向核內(nèi)的轉(zhuǎn)運有關(guān)，提示哇巴因具有β-catenin依賴性抗獲得性多藥耐藥（MDR）的作用[22]。

楊明鎮(zhèn)等在哇巴因干預(yù)體外培養(yǎng)的人肝癌耐藥Bel-7402/ADM(阿霉素)細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)哇巴因可在體外下調(diào)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性（MDR-1）RNA的表達(dá)水平從而逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥Bel-7402/ADM（阿霉素）細(xì)胞的耐藥性[23]。Guo等發(fā)現(xiàn)哇巴因還能提高骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性，這與Ca2+通道和DNA甲基化有關(guān)[24]。另有報道哇巴因可通過抑制FA/BRCA途徑而阻止DNA鏈間交聯(lián)（ICL）的修復(fù)，從而增強順鉑和絲裂霉素C（MMC）等誘導(dǎo)ICL的抗癌藥的細(xì)胞毒性作用，并能降低其耐藥性[25]。以上研究提示哇巴因具有作為化療增敏劑用于腫瘤治療的潛力，但哇巴因逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的作用和機制可能因腫瘤細(xì)胞的種類不同而有差異，其具體機制還不甚明了。

1.5 放射增敏

放療是目前臨床上廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的手段之一，其基本機制之一是利用電離輻射（IR）誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（DSB），而非同源末端連接（NHEJ）是負(fù)責(zé)修復(fù)電離輻射（IR）誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DSB）的主要途徑[26-27]。近期研究提示哇巴因可以增強腫瘤細(xì)胞的對放射治療的敏感性，其具有抑制非同源末端連接（NHEJ）的能力，從而可抑制電離輻射（IR）誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DSB）的修復(fù)，進而可加強電離輻射（IR）的細(xì)胞毒性[28]，哇巴因有望作為放射增敏劑輔助治療腫瘤。

2 總結(jié)與展望

近年來，大量研究表明哇巴因具有良好的抗腫瘤作用[29]，但大多局限于體外實驗階段，盡管Song等[30]的研究報道哇巴因在模擬腫瘤體內(nèi)特性的肝癌多細(xì)胞腫瘤球體（MCTS）模型中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效應(yīng)而無明顯肝毒性，但其在極度復(fù)雜的人體內(nèi)環(huán)境中效果如何還尚未可知。此外，哇巴因?qū)Σ煌[瘤表現(xiàn)出的抗腫瘤效應(yīng)及其機制不甚相同，雖然有報道稱其對部分腫瘤表現(xiàn)出選擇性的細(xì)胞毒作用，但也有研究[31]表明，比起腫瘤細(xì)胞，哇巴因在非腫瘤乳腺細(xì)胞中引起更大的增殖抑制和更廣泛的凋亡，故哇巴因復(fù)雜的抗腫瘤機制還需要進一步探究，其應(yīng)用于人類腫瘤臨床治療的可行性也還有待驗證。

已發(fā)現(xiàn)的哇巴因直接抗腫瘤效應(yīng)大多具有濃度和時間依賴性，而高濃度的哇巴因除了在機體心血管系統(tǒng)表現(xiàn)出明顯毒副作用以外，與腎臟疾病的發(fā)生也密切相關(guān)[32-34]，盡管有許多報道稱哇巴因抗腫瘤效應(yīng)起效濃度低于有毒濃度，但其長期使用的安全性仍未可知，在此方面仍需謹(jǐn)慎，因此降低哇巴因用量和毒副作用而保證安全性是其應(yīng)用于臨床腫瘤治療的前提。材料學(xué)高度發(fā)展的今天，將新型材料用于醫(yī)療領(lǐng)域已成為科學(xué)界的研究熱點，有許多研究發(fā)現(xiàn)納米材料用于制藥可改善藥物的成藥性，提高藥物的靶向性，還能增強藥物的治療效果并且降低其毒副作用，且目前納米藥物制劑在臨床上包括腫瘤在內(nèi)的一些重大疾病的診療中已經(jīng)表現(xiàn)出了重要作用[35]，故將哇巴因用于抗腫瘤納米藥物制劑的研制可能具有巨大潛力。此外，哇巴因與順鉑等抗癌藥物和哇巴因與MicroRNA-34等聯(lián)合使用表現(xiàn)出的良好的抗腫瘤效應(yīng)以及哇巴因的放射增強效應(yīng)等，提示聯(lián)合治療策略可能是降低哇巴因用量、減小毒副作用、提高腫瘤治療效果的有效途徑，將哇巴因用作治療腫瘤的輔助藥物可能更有研究前景。

最近有報道稱哇巴因可對大鼠和小鼠的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較復(fù)雜的影響，可引起多種免疫細(xì)胞和分子的數(shù)量和活性發(fā)生改變[36-38]，提示哇巴因的抗腫瘤效應(yīng)可能還與免疫系統(tǒng)有關(guān)，但這些變化的具體機制尚不清楚，對腫瘤的影響也還有待探究。故研究哇巴因?qū)γ庖呦到y(tǒng)的效應(yīng)和具體機制可能對進一步發(fā)掘哇巴因用于腫瘤治療的潛力有著巨大幫助。

綜上所述，哇巴因在抗腫瘤方面具有巨大的潛力，有望成為腫瘤治療的新型藥物，但其是否具有臨床應(yīng)用價值還需要更深一步探究。