循環(huán)microRNA作為多發(fā)性硬化生物學標志物的研究進展

王靖國綜述， 付 錦審校

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種經(jīng)典的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，主要以大腦皮質、皮質下白質、腦干、小腦、視神經(jīng)和脊髓等部位的病變?yōu)樘攸c。MS是導致年輕人神經(jīng)性(非創(chuàng)傷性)殘疾的首要病因，全球約有二百萬人患病，歐美國家發(fā)病率較高，且最近幾年來有上升的趨勢[1]。由于該病的發(fā)病機制尚未被闡明，目前罹患MS的患者還無法被完全治愈。早期準確診斷并在緩解期選擇合適的疾病修正治療(disease-modifying treatment,DMT)是延緩疾病進展并降低致殘率的重要手段。

近年來，微小RNA(microRNA,miRNA)作為一種能夠在體液中穩(wěn)定表達的分子且與多種疾病密切相關，逐漸被研究人員認為是一種潛在的疾病生物學標志物。miRNA主要通過靶向作用于相關基因并調控其表達水平，進而參與了包括MS在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。大量研究發(fā)現(xiàn)，MS患者中循環(huán)miRNA的表達水平不僅與健康人群存在差異，而且隨著疾病的進展以及在不同藥物治療前后也出現(xiàn)了明顯的變化。因此，循環(huán)miRNA作為一種潛在的MS生物學標志物而受到了越來越多的關注。

為了全面總結循環(huán)miRNA表達水平與MS患者臨床特征之間的關系，并進一步發(fā)現(xiàn)其中具有重要價值的miRNA，本文主要圍繞MS與循環(huán)miRNA在診斷、預后及療效評估方面的關系進行綜述。

1 MS的診斷及預后研究現(xiàn)狀

現(xiàn)階段MS的診斷主要依賴于對可疑患者神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征的觀察，同時借助其它輔助手段如腦和脊髓的核磁共振成像、腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)的實驗室檢查以及神經(jīng)電生理檢查等。2017年McDonald診斷標準以及2018年版多發(fā)性硬化診斷和治療中國專家共識對原有的標準進行了一定的修改，在臨床孤立綜合征(clinically isolated syndrome,CIS)患者和經(jīng)MRI證實的空間多發(fā)性損傷的患者CSF中，若出現(xiàn)CSF特異性寡克隆帶(oligoclonal bands,OB)也被認為是時間多發(fā)性損傷特點之一，并支持做出MS的診斷[2,3]。因此，OB也是人體體液中第一種被廣泛應用于臨床的診斷性生物學標志物。新標準強化了血清學檢查在診斷過程中的作用，使得MS的診斷時間進一步縮短[4]。由此可見，通過對CSF或其他體液中的生物學標志物進行實驗室檢驗等輔助手段將會在MS的早期診斷過程中扮演越來越重要的角色。大量研究表明，患者的臨床特征，諸如年齡、性別、種族及發(fā)作頻率等因素是復發(fā)緩解型MS(relapsing remitting multiple sclerosis,RRMS)的疾病活動性預測因子[5,6]。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)血清及CSF中的神經(jīng)纖維細絲蛋白(neurofilament light protein,NFL)表達水平與頭部核磁檢查顯示的腦損傷程度顯著相關，即伴有影像學進展的MS患者血清中NFL水平顯著高于處于緩解期或核磁下未見新發(fā)損傷灶的MS患者血清中NFL的表達水平[7]。由此可見，通過檢測人體體液中的特定分子物質的表達水平，對患者進行診斷及預后評估將成為將來MS相關研究的重點方向之一。因此，尋找并驗證可靠而實用的特異性生物學標志物對于早期發(fā)現(xiàn)MS患者，選擇合理的治療手段及改善預后具有重要的意義。

2 循環(huán)miRNA的產(chǎn)生及其生物學特點

微小RNA(microRNA,miRNA)是一種長約22個核苷酸單位的單鏈非編碼RNA，于1993年由Lee等人在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)[8]。miRNA主要在基因的轉錄后階段發(fā)揮作用，調控靶基因的表達水平。人類基因組序列中共含有約2000個編碼miRNA的基因，在RNA聚合酶Ⅱ(RNAP Ⅱ)和核糖核酸酶(RNase)的作用下，miRNA在細胞核中合成并加工成為前體miRNA(pre-miRNA)，后經(jīng)轉運蛋白運送至細胞核外，經(jīng)另一種核糖核酸酶剪切修飾后產(chǎn)生成熟的miRNA，隨后與AGO蛋白結合形成RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)，并與特定mRNA的3’UTR區(qū)結合抑制靶基因的表達[9]。miRNA在諸如免疫調節(jié)、代謝控制、神經(jīng)發(fā)育、細胞增殖與分化等多種生物學過程中發(fā)揮著重要的作用，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[10]。

近年來國內(nèi)外多項研究結果已經(jīng)證明，miRNA參與了MS的啟動與發(fā)展[11]。Yang等通過對公開的基因表達數(shù)據(jù)庫進行了綜合分析發(fā)現(xiàn)：與健康對照組相比，45個miRNAs和621個靶mRNAs在MS患者中異常表達。并通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-PCR,RT-PCR)檢測了MS患者與健康對照組的全血樣本發(fā)現(xiàn)hsa-miR-328-3p在MS患者中顯著上調，而其靶基因RAC2具有下調趨勢[12]。隨著研究的深入，一些重要的miRNA在MS發(fā)病過程中的某些具體機制也開始被逐漸闡明。Angelou等人在自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，受抗原刺激后的幼稚CD4+T細胞在向Th17細胞分化的過程中，let-7的表達水平出現(xiàn)下調。Let-7是Th17細胞增殖過程中的重要調節(jié)因子，可負性調控細胞因子受體編碼基因Ⅱ1r1和Il23r，并阻止Th17細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移，進而延緩EAE小鼠癥狀進展[13]。與此同時，一種細胞外的游離miRNA：循環(huán)miRNA逐漸成為miRNA研究的新方向之一。

循環(huán)miRNA廣泛分布于人類體液，包括血液、CSF、尿液及腹水中，因其多存在于各類膜性囊泡中，因此無法被RNase酶降解，具有較強的穩(wěn)定性[14]。特別是外泌體相關miRNA作為一種近幾年研究較為深入的循環(huán)miRNA之一，其生物學功能及潛在的臨床應用價值逐漸受到研究者們的關注。外泌體是由細胞分泌的直徑約50～150 nm的膜性囊泡，包裹多種分子如蛋白質、DNA、RNA和脂質等[15]。由于血液中循環(huán)外泌體具有其母體細胞的生物學印記，可以反映包括癌癥與神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的多種疾病的狀態(tài)，因此能夠作為一種非侵入性檢查的檢測對象[16]。還有研究人員將轉染了編碼增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)的質粒的細胞射到小鼠體內(nèi)時，發(fā)現(xiàn)攜帶eGFP RNA的外泌體不僅存在于小鼠外周血中，也出現(xiàn)在多種類型的細胞內(nèi)，表明循環(huán)miRNA具有通過外泌體與介導細胞間信號交流的作用[17]。以上研究結果均表明，循環(huán)miRNA不僅可以在細胞內(nèi)調控相關基因的表達，也可以被分泌到細胞外并作用于其它類型的細胞，參與維持機體免疫學功能穩(wěn)態(tài)。正是由于循環(huán)miRNA所具有的穩(wěn)定性和疾病特異性，越來越多的研究人員將其作為疾病特異性生物學標記物的理想來源之一。近年來關于循環(huán)miRNA與MS的研究日趨增加，在患者體液中，尤其是外周血及CSF中有越來越多的疾病相關的循環(huán)miRNA被發(fā)現(xiàn)。

3 循環(huán)miRNA與MS相關研究進展

3.1 診斷相關性循環(huán)miRNA 大量實驗研究表明，與健康人群相比，miRNA在MS患者體液中存在異常表達。Vistbakka等人運用RT-PCR方法定量分析了83例進展型MS患者及正常人群血清中miRNA的表達情況(31例診斷為原發(fā)進展型，31例診斷為繼發(fā)進展型，21例作為正常對照組)[18]。結果表明，與正常對照組相比，原發(fā)進展型MS患者血清中有5種miRNA(miR-128-3p、miR-376c-3p、miR-26a-5p、miR-191-5p及miR-24-3p)的表達明顯升高，其中3種miRNA(miR-376c-3p、miR-26a-5p、miR-191-5p)在繼發(fā)性進展MS患者的血清中亦明顯升高，可能是MS患者診斷的生物學標志物。該研究還發(fā)現(xiàn)，在MS組中，miR-124-3p表達量與首次癥狀持續(xù)時間呈正相關(P=0.03)。不僅如此，Selmaj等人結合二代測序技術和數(shù)字化定量聚合酶鏈反應技術對101名RRMS患者及51名健康對照的血清外泌體進行測序分析，發(fā)現(xiàn)4種循環(huán)miRNA(miR-122-5p、miR-196b-5p、miR-301a-3p及miR-532-5p)在RRMS患者發(fā)作期顯著降低，可能與MS患者的活動性及臨床發(fā)展相關[19]。

3.2 預后相關性循環(huán)miRNA 循環(huán)miRNA在對MS進行臨床分型及嚴重程度的評估方面也具有潛在價值。Gandhi等人通過實驗證明，血清中miR-92a-1在復發(fā)緩解型與繼發(fā)進展型患者之間存在差異表達，并且與MS患者的擴展殘疾狀態(tài)量表(extended disability status scale,EDSS)評分(P=0.002)及單次病程持續(xù)時間(P=0.003)密切相關[20]。另一項研究分析了循環(huán)miRNA與MS患者影像學表現(xiàn)之間的關系。該項研究納入了120位MS患者，并對他們進行腦及脊髓的核磁共振檢查。結果表明，部分血清miRNA的表達水平與組織損傷程度和腦萎縮程度顯著相關，可用于監(jiān)測疾病的進展。此外，miRNA可能對MS發(fā)病具有保護作用，miR-143-3p、miR-142-5p和miR-181c-5p的表達水平與MS患者的腦萎縮程度呈負性相關[21]。有趣的是，研究人員還發(fā)現(xiàn)與正常人相比，miR-143-3p和miR-142-5p的表達水平在罹患阿爾茲海默病的患者血漿及CSF中同樣下調，表明這兩種miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中可能具有協(xié)同作用。而在miR-92a-3p上調表達的樣本中則呈現(xiàn)出更加嚴重的影像學表現(xiàn)，且在MS患者的血漿與B細胞中，miR-92a-3p的表達水平均高于健康對照，因此研究人員認為它是一種致病性miRNA[22,23]。由此可見，miRNA是MS患者的潛在預后型生物標志物，可作為疾病發(fā)展的致病性或保護性評定指標。

3.3 循環(huán)miRNA在MS治療效果評估中的作用 如今，針對MS患者緩解期的DMT藥物越來越豐富，但由于患者多變的臨床表現(xiàn)和反復發(fā)作的病程，因此在治療藥物選擇和預后評估中存在較大困難。迄今為止，尚且缺乏一種能有效反映MS緩解期藥物治療效果的血清學檢查，而循環(huán)miRNA作為一種在人體體液中穩(wěn)定存在的潛在生物學標志物而被深入研究。例如，干擾素β(interferon-beta,IFN-β)作為MS緩解期治療的一線藥物，在調節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抑制外周血T細胞遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮著重要作用[24,25]。最近的一項研究分析了接受IFN-β治療的MS患者與首次確診且未經(jīng)治療的患者血清外泌體中miRNA的表達譜差異，結果表明，有16個miRNA差異表達。其中，miR-22-3p和miR-660-5p在治療后的患者體內(nèi)上調表達，14個miRNA下調表達，包括調節(jié)髓鞘合成的miR-23a-3p、與神經(jīng)干細胞增殖相關的let-7b-5p、以及參與炎癥反應的miR-15b-3p、miR-223-3p等，而其中大部分的差異表達miRNA在以往的研究中被證明是潛在的MS診斷性生物學標志物[26]。同樣在MS患者的血清中，Ebrahimkhani等人發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過芬戈莫德治療6個月后，有兩種miRNA表達下調(miR-150-5p及miR-548e-3p)，而有3種miRNA表達上調(miR-130b-3p、miR-654-5p及miR-487b-3p)[27]。不僅如此，研究人員在經(jīng)過DMT治療的MS患者尿液、CSF等體液中也發(fā)現(xiàn)了大量差異表達的miRNA[28]。上述結論表明MS患者在接受一段時間的DMT治療之后，其體液內(nèi)部分循環(huán)miRNA會出現(xiàn)顯著變化，且與治療后疾病進展情況相關，可能是評價MS患者治療效果的生物學標志物。

4 總結與展望

循環(huán)miRNA是一種在體液中穩(wěn)定存在的生物學標志物，如果能對其進行準確而快速的定量分析，將在MS的診斷、治療及預后判定方面具有良好的應用前景。然而，由于其在MS發(fā)病過程中的具體分子機制尚不明確，且技術上對其進行精確定量分析存在困難，故將其投入臨床應用仍需時日。因此，在今后的研究中還需要借助多種手段對它們之間的關系展開全面而深入的分析，并根據(jù)所得到的結果對其中幾個有重要意義的miRNA進行更進一步的臨床試驗驗證。