核因子E2相關(guān)因子2在腦缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展

韓玉迪， 白 波， 王美琴， 朱 帆綜述， 李東芳審校

缺血性卒中是全球致死和殘疾的主要疾病之一，發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重危害人類健康，在時間窗內(nèi)實現(xiàn)血管再通及組織再灌注是治療重點，有效的治療方法包括靜脈溶栓、機(jī)械取栓等[1]，然而再灌注后發(fā)生腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)可導(dǎo)致患者產(chǎn)生更為嚴(yán)重的神經(jīng)損傷和功能缺損。在CIRI發(fā)生過程中，活性氧大量產(chǎn)生且清除不足，氧化和抗氧化作用失衡造成細(xì)胞、組織氧化損傷，氧化應(yīng)激是CIRI的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是調(diào)控內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，研究表明其介導(dǎo)的信號通路可通過抗氧化應(yīng)激、抗炎、調(diào)節(jié)線粒體分裂和細(xì)胞凋亡、保護(hù)血腦屏障等多個途徑減輕腦缺血再灌注損傷，可作為治療缺血性卒中的新策略?，F(xiàn)將Nrf2基本結(jié)構(gòu)、調(diào)控機(jī)制及其在腦缺血再灌注損傷中作用的研究進(jìn)展整理如下。

1 Nrf2的基本結(jié)構(gòu)

Nrf2是具有高度保守的堿性亮氨酸結(jié)構(gòu)bZip的對氧化應(yīng)激敏感的轉(zhuǎn)錄因子，包含7個功能結(jié)構(gòu)域(Neh1-Neh7)來調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性和穩(wěn)定性。Neh1含有bZip序列，可與核內(nèi)的小Maf蛋白形成異二聚體，使Nrf2能識別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)原件(antioxident response element,ARE)以啟動目的基因的表達(dá),Neh1還可以與E2泛素結(jié)合酶相互作用以調(diào)節(jié)Nrf2的穩(wěn)定性。Neh2含有DLG和ETGE兩個結(jié)合位點，可與Kelch樣環(huán)氧化氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)Nrf2降解，負(fù)性調(diào)控Nrf2 的轉(zhuǎn)錄活性。Neh3位于Nrf2的C端，與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)。Neh4和Neh5通過與轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合，在促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮協(xié)同作用，并且還通過與核輔因子RAC3/AIB1/SRC-3結(jié)合，增加Nrf2-ARE基因表達(dá)[2]。Neh6和Neh7調(diào)控Nrf2的非Keap1依賴性降解，并調(diào)節(jié)Nrf2的活性，β-轉(zhuǎn)錄重復(fù)包含蛋白1(β-TrCP1)介導(dǎo)的對Nrf2的降解依賴于對Neh6的識別[3],Neh7可特異性地與維甲酸X受體α(RXRα)相互作用來抑制Nrf2表達(dá)。

2 Nrf2的調(diào)控機(jī)制

Keap1是Nrf2的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，正常情況下錨定在胞漿肌動蛋白細(xì)胞骨架上[4]，由CTR、NTR、BTB、IVR及DGR 5個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。BTB區(qū)，負(fù)責(zé)同源二聚化Cullin3(Clu3)，是Keap1與Cul3作用的區(qū)域，可介導(dǎo)Nrf2的泛素化及降解。IVR區(qū)含有大量半胱氨酸殘基，對親電試劑和氧化劑敏感，是Keap1蛋白的重要功能調(diào)節(jié)區(qū)域。DGR區(qū)又稱Kelch區(qū)，既是Keap1與Nrf2的Neh2區(qū)的結(jié)合位點，也是Keap1與胞漿肌動蛋白的結(jié)合位點。

在正常生理條件下，非活性Nrf2與Keap1-Cul3-Rbx1復(fù)合物結(jié)合被限制在細(xì)胞質(zhì)中，這促進(jìn)了Nrf2的泛素化和蛋白酶體降解，使其保持最低表達(dá)量，以維持動態(tài)平衡[2]。氧化應(yīng)激時，在ROS作用下，Keap1半胱氨酸殘基氧化，構(gòu)象發(fā)生改變，Keap1介導(dǎo)的Nrf2降解減少，Nrf2與之解離。還有一種門閂和樞紐學(xué)說，基礎(chǔ)條件下，Nrf2的DLG區(qū)和ETGE區(qū)均與Keap1的DGR區(qū)相結(jié)合，介導(dǎo)Nrf2的泛素化。當(dāng)氧化應(yīng)激時，結(jié)合力弱的DLG區(qū)從DGR區(qū)解離下來，但高親和力的ETGE區(qū)仍然結(jié)合與DGR區(qū)，占據(jù)了Keap1的位點卻不能使Nrf2降解，新生成的Nrf2因Keap1的結(jié)合位點飽和而不能與之結(jié)合，使Nrf2含量升高。Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與核內(nèi)小Maf蛋白結(jié)合形成異二聚體，與ARE結(jié)合促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄及多種抗氧化酶及Ⅱ類解毒酶等的生成。

此外，Nrf2的激活還受到其他因素的調(diào)節(jié)。各種蛋白激酶對Nrf2的磷酸化也能影響Nrf2的活化。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號傳導(dǎo)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)參與了Nrf2轉(zhuǎn)位，上調(diào)PI3K、Akt或ERK減弱均可激活Nrf2[5,6]。蛋白激酶C(PKC)對Nrf2 Ser40磷酸化促進(jìn)了Nrf2與Keap1的解離[7]。自噬相關(guān)蛋白p62也可參與Nrf2的調(diào)節(jié)，p62作為一種選擇性自噬底物，正常情況下經(jīng)自噬降解；氧化應(yīng)激時p62上調(diào)可依賴哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)與Keap1上的Nrf2結(jié)合位點相互作用，以實現(xiàn)Nrf2的穩(wěn)定和激活[8,9]。此外，糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、β-TrCP、CpG甲基化、組蛋白磷酸化和乙?；舱{(diào)節(jié)了Nrf2的表達(dá)和活化[3,10～13]。

3 Nrf2在腦缺血再灌注中的作用

許多研究表明，在卒中急性期，Nrf2的表達(dá)顯著增加，且梗死周圍區(qū)較中心區(qū)水平更高[14]，可能是由于梗死周圍區(qū)的氧化應(yīng)激高于核心區(qū)所致[15]。卒中后不同類型的細(xì)胞包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等，均會表達(dá)Nrf2，表達(dá)情況可能受時間影響。在再灌注8 h的梗死周圍區(qū)中，Nrf2在神經(jīng)元中表達(dá)，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)[15]，在再灌注的24 h的梗死周圍區(qū)，Nrf2在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。以上均表明Nrf2信號通路對腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)做出了應(yīng)答。

與野生型小鼠相比，Nrf2基因敲除鼠進(jìn)行短暫性大腦中動脈閉塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)造模后抗氧化酶、解毒酶的基礎(chǔ)活性和誘導(dǎo)活性均降低，梗死面積更大，行為學(xué)表現(xiàn)也更差[16]，更容易遭受缺血性腦損傷和神經(jīng)系統(tǒng)損害?？梢奛rf2在CIRI中起著頗為重要的作用。

3.1 抗氧化應(yīng)激作用 由于腦組織需氧程度高且含有豐富的易被氧化的不飽和脂肪酸，抗過氧化能力及清除自由基的能力明顯低于其他組織[17]，腦I/R時大量自由基的生成誘發(fā)氧化應(yīng)激，對腦組織造成損傷。Shah等人研究表明神經(jīng)元中的Nrf2激活可由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)，激活了一系列抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[18]。已經(jīng)證實腦I/R后Nrf2表達(dá)增高，誘導(dǎo)多種內(nèi)源性抗氧化酶的產(chǎn)生，如醌氧化還原酶1(NQO1)、血紅素加氧酶1(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，從而減少或清除氧自由基，提高細(xì)胞、組織抗氧化能力[19]。給予Nrf2激活劑后腦組織內(nèi)Nrf2及HO-1、NQO-1表達(dá)增多，SODs、CATs、GSH-Px和GSH活性升高，ROS活性及MDA含量減少，敲除Nrf2后上述保護(hù)作用被抑制，可證明激活Nrf2信號通路可通過抗氧化應(yīng)激減輕CIRI[20]。

3.2 減輕炎癥反應(yīng) 腦I/R后炎性細(xì)胞因子的過度釋放以及隨后的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)是腦損傷惡化發(fā)展的主要原因之一。Nrf2能負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB(許多促炎基因的主要調(diào)控因子)信號通路，Nrf2基因敲除鼠的Toll樣受體4(Toll like receptor-4,TLR-4)和NF-κB的表達(dá)要高于受tMCAO作用的野生型小鼠，有更嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損、梗死面積及炎性損害[21]。此外Nrf2調(diào)節(jié)的下游信號蛋白HO-1能將促炎游離血紅素催化分解生成等摩爾數(shù)的鐵以及抗炎化合物CO和膽紅素[22]，發(fā)揮抗炎作用。NOD樣受體蛋白-3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體在缺血誘導(dǎo)炎癥損傷中扮演著重要角色，硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)與NLRP3的激活密切相關(guān)，TNNIP在氧化應(yīng)激下從硫氧還蛋白1(Trx1)/TXNIP復(fù)合物中解離出來[23]。Nrf2激活劑叔丁基對苯二酚(tBHQ)上調(diào)Nrf2顯著降低了tMCAO后TXNIP、NLRP3炎癥小體以及下游因子caspase-1、IL-1β and IL-18的表達(dá)[23]，增強(qiáng)血管生成和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活降低CIRI[24]。此外，激活Nrf2抑制了tMCAO后7 d內(nèi)急性膠質(zhì)細(xì)胞活化，7～14 d內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，將梗死區(qū)中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞的浸潤以及激活的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的數(shù)量減少50%以上[25]。

3.3 調(diào)節(jié)線粒體分裂和細(xì)胞凋亡 線粒體融合和分裂的平衡在維持神經(jīng)元的正常功能中起著至關(guān)重要的作用，CIRI可以通過調(diào)節(jié)融合和分裂相關(guān)蛋白的表達(dá)和翻譯后修飾來破壞線粒體融合和分裂的平衡，從而破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[26]。線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1在線粒體分裂和融合中起重要作用,Drp1是線粒體分裂的執(zhí)行蛋白，在細(xì)胞受刺激時被Fis1招募至線粒體外膜的特定位點持續(xù)收縮而分割線粒體,可以調(diào)節(jié)線粒體的數(shù)量、細(xì)胞能量的變化和及時處理受損的線粒體,線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1表達(dá)可以作為線粒體結(jié)構(gòu)是否穩(wěn)定的指標(biāo)；促凋亡蛋白Bax與Drp1可共定位于分裂點上，Bax寡聚化形成孔道促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放和細(xì)胞凋亡，加劇神經(jīng)元的損傷[27]。在腦I/R模型中，當(dāng)Nrf2核蛋白被抑制之后，線粒體分裂相關(guān)蛋白指標(biāo)明顯升高，線粒體形態(tài)損傷加重，凋亡率增高[27]。因此Nrf2介導(dǎo)的信號通路在腦I/R中作為內(nèi)源性保護(hù)通路，抑制線粒體分裂，減少細(xì)胞凋亡，減輕腦損傷。

3.4 保護(hù)血腦屏障 血腦屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)的結(jié)構(gòu)及功能正常是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵。腦I/R可以造成血腦屏障完整性破壞、通透性增加，進(jìn)一步加重缺血腦組織的損傷[28]。Nrf2激活劑富馬酸二甲酯(DMF)可在體內(nèi)實驗阻止內(nèi)皮間緊密連接的破壞和縫隙形成，降低腦組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶活性，體外實驗維持內(nèi)皮緊密連接，抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)，并減弱白細(xì)胞遷移，而Nrf2敲除加重了缺血狀態(tài)下緊密連接蛋白ZO-1離域并減弱了DMF的保護(hù)作用，表明了Nrf2在BBB完整性中的保護(hù)作用[29]，其他Nrf2激活劑，如蘿卜硫素(SFN)，也表現(xiàn)出了對血腦屏障的保護(hù)作用[30]。

4 小 結(jié)

Nrf2作為內(nèi)源性抗氧化防御的關(guān)鍵成分，在體、離體實驗均證明激活Nrf2途徑的治療有利于減輕CIRI，涉及的機(jī)制包括抗氧化應(yīng)激、抗炎、調(diào)節(jié)線粒體功能、抗凋亡、保護(hù)血腦屏障等，可減小梗死面積、減輕神經(jīng)功能缺損，是缺血性卒中的高價值治療靶點。目前有越來越多的藥物表明可通過Nrf2途徑減少CIRI，但具體Nrf2的激活途徑、減輕CIRI的具體機(jī)制仍不明確，亟需我們進(jìn)行進(jìn)一步研究?？偠灾邢騈rf2的卒中治療是一個很有希望的領(lǐng)域，但目前仍處于研究的初始階段，未來還需要進(jìn)一步的討論和研究。